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नाक म्यूकोसा ऊतक वर्गों में इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग बहुरंगा इम्यूनोसे के माध्यम से एलर्जिक राइनाइटिस चूहों के खंड

Published: September 22, 2023 doi: 10.3791/65937
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2
1Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Meishan Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल एलर्जिक राइनाइटिस के चूहे के मॉडल के मूल्यांकन के लिए एक बहुरंगा इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक का वर्णन करता है।

Abstract

एलर्जिक राइनाइटिस (एआर) नाक के श्लेष्म की एक पुरानी, गैर-संक्रामक सूजन की बीमारी है, जो मुख्य रूप से विशिष्ट इम्युनोग्लोबुलिन ई (आईजीई) द्वारा मध्यस्थता की जाती है, जो दुनिया की आबादी का लगभग 10% -20% प्रभावित करती है। जबकि इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) धुंधला लंबे समय से रोग-विशिष्ट प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एक मानक तकनीक है, पारंपरिक आईएफ तकनीक एक ही नमूने में तीन या अधिक प्रोटीन के अभिव्यक्ति स्तर का पता लगाने की उनकी क्षमता में सीमित हैं। नतीजतन, हाल के वर्षों में बहुरंगा आईएफ तकनीक विकसित की गई है, जो कोशिकाओं या ऊतकों में कई लक्ष्यों के एक साथ लेबलिंग की अनुमति देती है।

यह प्रोटोकॉल एआर के चूहे के मॉडल की स्थापना, नाक के श्लेष्म नमूने प्राप्त करने और बहुरंगा इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए तकनीकी प्रक्रियाओं के लिए प्रक्रिया का एक व्यापक अवलोकन प्रदान करता है। एआर समूह के सभी चूहों ने छींकने, एक बहती नाक और एक खुजली वाली नाक जैसे विशिष्ट लक्षणों का प्रदर्शन किया, जिसमें व्यवहार संबंधी टिप्पणियों ने ≥5 अंक हासिल किए। हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) धुंधला होने से पता चला कि एआर समूह में भड़काऊ सेल काउंट में वृद्धि हुई है और नाक म्यूकोसल अखंडता बाधित हुई है। बहुरंगा इम्यूनोफ्लोरेसेंस (एमआईएफ) ने आरओआर और टीआईसीएएम -1 की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया, जबकि एआर चूहों के नाक म्यूकोसा ऊतक में फॉक्सपी 3 अभिव्यक्ति में कमी आई।

Introduction

एलर्जिक राइनाइटिस (एआर) नाक के श्लेष्म की एक पुरानी, गैर-संक्रामक सूजन की बीमारी है जो मुख्य रूप से विशिष्ट इम्युनोग्लोबुलिन ई (आईजीई)1,2द्वारा मध्यस्थता की जाती है। यह छींकने, नाक बहने, नाक बंद होने और नाक की खुजली जैसे लक्षणों की विशेषता है। औद्योगीकरण और शहरीकरण के साथ, एआर का प्रसार धीरे-धीरे बढ़ रहा है, जिससे दुनियाकी आबादी का लगभग 10% -20% प्रभावित होता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) तकनीक एक फ्लोरोसेंट धुंधला विधि है जो एंटीबॉडी-एंटीजन बाध्यकारी प्रतिक्रिया का उपयोग करती है। यह जैविक ऊतकों या कोशिकाओं में विशिष्ट प्रोटीन के वितरण और अभिव्यक्ति के स्तर का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। एआर अनुसंधान में, आईएफ एक साथ एआर से संबंधित साइटोकिन्स, भड़काऊ कोशिकाओं, रिसेप्टर्स, और अधिक सहित कई लक्ष्यों का पता लगा सकता है, जिससे एआर रोगजनन की खोज औरदवाओं के प्रभाव 3,4,5,6 की सुविधा मिलती है।

बहुरंगा immunofluorescence (एमआईएफ) धुंधला हो जाना प्रक्रिया बारीकी से धुंधला हो जाना के प्रत्येक दौर के दौरान एक एंटीबॉडी क्षालन कदम के अलावा पारंपरिक अगर जैसा दिखता है. यह संशोधन अनुक्रमिक एकल-लेबलिंग और पुन: धुंधला होने के कई दौरों के माध्यम से एक ही ऊतक अनुभाग पर कई बायोमार्कर का एक साथ पता लगाने में सक्षम बनाता है। एमआईएफ टायरामाइड सिग्नल प्रवर्धन (टीएसए) पर आधारित है, टीएसए फ्लोरोसेंट धुंधला के दोहराया चक्र और फ्लोरोसेंटसंकेतों को बनाए रखते हुए एंटीबॉडी को हटाने के लिए माइक्रोवेव हीटिंग के उपयोग की अनुमति देता है 7,8. पारंपरिक आईएफ की तुलना में, एमआईएफ कई फायदे प्रदान करता है: (1) यह कमजोर रूप से व्यक्त एंटीजन का पता लगा सकता है जो पारंपरिक आईएफ 9,10 के साथ पहचान करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं; (2) यह एक बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ उच्च गुणवत्ता वाला धुंधला प्रदान करता है; (3) यह ऊतक-विशिष्ट संरचनाओं और ब्याज11 के क्षेत्रों की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है; (4) कई मार्गों को मल्टीप्लेक्सिंग कुशलतापूर्वक ऊतकों का उपयोग करता है और सीमित रोग संसाधनों का संरक्षण करता है12; (5) एमआईएफ के माध्यम से बहु-पैरामीटर विश्लेषण ऊतकों में गहरी अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, छिपी हुई जैविक जानकारी को उजागर करता है13.

कुल मिलाकर, एमआईएफ एक ही नमूने के भीतर विभिन्न एंटीजन अभिव्यक्तियों और वितरण के अवलोकन की अनुमति देता है, जिससे लक्ष्य प्रोटीन के अध्ययन की सुविधा मिलती है। भविष्य में, कई लक्ष्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति और वितरण को समझने की मांग करने वाले शोधकर्ताओं को यह तकनीक एक मूल्यवान विकल्प मिलेगी। यह अध्ययन एआर के साथ चूहों से नाक के श्लेष्म के नमूनों को धुंधला करने के लिए एमआईएफ के आवेदन को प्रदर्शित करता है और एआर के चूहे मॉडल की स्थापना का मूल्यांकन करता है।

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Protocol

प्रायोगिक प्रोटोकॉल और प्रक्रियाओं को चेंगदू यूनिवर्सिटी ऑफ ट्रेडिशनल चाइनीज मेडिसिन (रिकॉर्ड नंबर: 2022DL-010) की प्रशासनिक और पशु अनुसंधान समिति से मंजूरी मिली है। आठ सप्ताह के नर स्प्रैग डॉली (एसडी) चूहों, जिनका वजन 180-200 ग्राम था, व्यावसायिक रूप से प्राप्त किए गए थे ( सामग्री की तालिकादेखें) और नियंत्रित तापमान (23 ± 2 डिग्री सेल्सियस) और सापेक्ष आर्द्रता (55% ± 10%) के साथ एक प्राकृतिक प्रकाश / अंधेरे चक्र के तहत रखे गए थे। बारह चूहों को बेतरतीब ढंग से दो समूहों में विभाजित किया गया था: नियंत्रण समूह और एआर समूह। सभी चूहों को इन स्थितियों के लिए अभ्यस्त किया गया था और परीक्षण से पहले एक सप्ताह के लिए भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच प्रदान की गई थी।

1. एआर के चूहे मॉडल की स्थापना

  1. संवेदीकरण समाधान तैयार करना: खारा के 100 एमएल में ओवलब्यूमिन (ओवीए) और अल (ओएच) 3 के 30 मिलीग्राम निलंबित (सामग्री की तालिका)14,15।
  2. बुनियादी संवेदीकरण: समझ और अपने पेट का सामना करना पड़ के साथ पूरी तरह से जाग चूहे पकड़. 75% शराब से लथपथ कपास गेंदों का उपयोग पेट कीटाणुरहित करें। एआर समूह में चूहों के बाएं पेट गुहा में चरण 1.1 में तैयार संवेदीकरण समाधान के 1 एमएल इंजेक्ट करने के लिए 1.5 एमएल सिरिंज का उपयोग करें। इस इंजेक्शन को 14 दिनों के लिए हर दो दिन में एक बार दोहराएं (चित्र 1 ए)।
    नोट: सुनिश्चित करें कि चूहे के सिर सिरिंज डालने जब बड़ी और छोटी आंतों को नुकसान को रोकने के लिए अपनी पूंछ से कम तैनात है. इंजेक्शन साइट वेंट्रल मिडलाइन से 1.5 सेमी की दूरी पर स्थित है। नियंत्रण समूह में चूहों को 14 दिनों के लिए हर दो दिनों में एक बार सामान्य खारा के 1 एमएल के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन प्राप्त करना चाहिए।
  3. नाक चुनौती: बेसल संवेदीकरण के बाद के दिन में 100 माइक्रोन पिपेट(चित्रा 1बी)का उपयोग करके नाक की बूंदों के माध्यम से 5% ओवीए के 50 माइक्रोन का प्रशासन करें, इस प्रक्रिया को 7 दिनों (चित्रा 1सी)के लिए दोहराएं।
    नोट: खारा के 100 एमएल के साथ ओवीए के 5 ग्राम मिलाकर 5% ओवीए समाधान तैयार करें। नियंत्रण समूह के लिए, खारा की समान मात्रा की बूंदों का प्रशासन करें।

2. चूहों का व्यवहार स्कोरिंग

  1. अंतिम नाक चुनौती को पूरा करने के बाद 30 मिनट के भीतर, तालिका 1 (चित्रा 1डी)में उल्लिखित स्कोरिंग मानदंडों के आधार पर, नाक खरोंचने, छींकने, और एक बहती नाक जैसे लक्षणों की पहचान करने के लिए एक डिजिटल कैमरा का उपयोग करके चूहों का निरीक्षण और रिकॉर्ड करें।
    नोट: सफल एआर मॉडलिंग की पुष्टि ≥5 अंक14 के कुल स्कोर को प्राप्त करने पर आधारित है।

3. नाक के श्लेष्म के नमूनों का अधिग्रहण

  1. चूहों की बलि देना: चूहों को सीओ2 के ओवरडोज के संपर्क में लाकर बलिदान करें। बाद में, 75% इथेनॉल के साथ चूहों कीटाणुरहित ( सामग्री की तालिकादेखें). मांसपेशियों के ऊतकों (चित्रा 2 ए) को बेनकाब करने के लिए मुंह के दो कोनों के साथ एक चीरा बनाने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें। अगला, ऊतक कैंची(चित्रा 2बी)का उपयोग कर खोपड़ी के दोनों किनारों पर जाइगोमैटिक हड्डी और जबड़ा के जोड़ों को काटें, और जबड़े(चित्रा 2सी)को हटा दें।
  2. नाक गुहा जोखिम: नाक गुहा (चित्रा 2ई) का पर्दाफाश करने के लिए एक हेमोस्टैट (चित्रा 2 डी) का उपयोग कर मैक्सिला की त्वचा को अलग करें। ऊतक कैंची (चित्रा 2एफ) के साथ नाक गुहा और मैक्सिला के बीच बोनी कनेक्शन को काटें। फिर, इन्फ्राऑर्बिटल फोरामेन(चित्रा 2जी)पर दोनों तरफ नाक गुहा और कक्षीय हड्डियों के बीच संबंध को अलग करें और नाक गुहा(चित्रा 2एच)को हटा दें।
  3. फिक्सेशन: निर्धारण के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में निकाले गए नाक गुहा रखें और इसे 24-72 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर स्टोर करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    नोट: सुनिश्चित करें कि उपयोग किए गए पैराफॉर्मलडिहाइड फिक्सेटिव की मात्रा उचित निर्धारण के लिए वर्गों को पूरी तरह से कवर करने के लिए पर्याप्त है।

4. नाक के श्लेष्म के नमूनों का पूर्व-प्रसंस्करण

  1. Decalcification: चरण 3.1 से हटाए गए ऊतकों को ठीक करके शुरू करें। प्रत्येक 20 मिनट के लिए पीबीएस के साथ उन्हें तीन बार धो लें। आसुत जल के साथ उन्हें तीन बार धोकर इस का पालन करें, 20 मिनट के लिए हर बार. इसके बाद, कमरे के तापमान पर ऊतकों की 20-30 गुना की मात्रा के साथ एक decalcification समाधान में ऊतकों decalcify करें।
    1. डीकैल्सीफिकेशन समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें) को 7.2-7.4 का पीएच बनाए रखना चाहिए। अंत में, एक निर्जलीकरण बॉक्स में decalcified ऊतक जगह है.
      नोट: decalcifying समाधान साप्ताहिक बदलने की जरूरत है। ऊतक नरम होने पर डीकैल्सीफिकेशन प्रक्रिया का निष्कर्ष निकाला जा सकता है (लगभग 2 महीने)।
  2. निर्जलीकरण और वैक्सिंग: निर्जलीकरण बॉक्स को एक निर्जलीकरण में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। 4 घंटे के लिए 75% अल्कोहल से शुरू करें, इसके बाद 2 घंटे के लिए 85% अल्कोहल, 2 घंटे के लिए 90% अल्कोहल और 1 घंटे के लिए 95% अल्कोहल लें।
    1. इसके बाद, 30 मिनट के लिए निर्जल इथेनॉल में ऊतक विसर्जित करें, एक और 30 मिनट के लिए प्रक्रिया दोहराएं, 5-10 मिनट के लिए ज़ाइलीन का उपयोग करें, इस चरण को एक और 5-10 मिनट के लिए दोहराएं, ऊतक को 1 घंटे के लिए मोम में विसर्जित करें, इस चरण को एक और घंटे के लिए दोहराएं, और अंत में, अतिरिक्त 1 घंटे के लिए ऊतक को मोम में विसर्जित करें।
  3. एम्बेडिंग: पिघला हुआ मोम ब्लॉक एम्बेडिंग बॉक्स में रखें ( सामग्री की तालिकादेखें) और इसे -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें। एक बार जब मोम जम जाता है, तो इसे हटा दें और मोम ब्लॉक को ट्रिम करें।
  4. टुकड़ा करने की क्रिया ( सामग्री की तालिका) एक पैराफिन microtome में छंटनी मोम ब्लॉक डालें और 3 माइक्रोन की मोटाई के साथ स्लाइस में कटौती. एक स्लाइड स्प्रेडर पर एक 40 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में स्लाइस रखें. ऊतक को समतल करें, फिर इसे कांच की स्लाइड से उठाएं और इसे 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में बेक करें।
    1. पानी वाष्पित हो गया है, और मोम ठीक से सेट है के बाद, स्लाइड को हटाने और 25 डिग्री सेल्सियस के एक तापमान पर उन्हें दुकान.

5. नाक के श्लेष्म ऊतक का एच एंड ई धुंधला हो जाना

  1. Dewaxing और जलयोजन: 20 मिनट के लिए xylene में स्लाइस रखें, एक और 20 मिनट के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ, 5 मिनट के लिए पूर्ण इथेनॉल, एक और 5 मिनट के लिए इस कदम को दोहराएँ, 5 मिनट के लिए 75% शराब, और अंत में, 5 मिनट के लिए धो लें।
  2. हेमेटोक्सिलिन धुंधला: 100 माइक्रोन पिपेट का उपयोग करके 3-5 मिनट के लिए हेमेटोक्सिलिन धुंधला समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें) के 100 माइक्रोन का वितरण करें, 5-10 एस के लिए कुल्ला, 10-30 एस के लिए 0.5% हाइड्रोक्लोरिक एसिड इथेनॉल के 100 माइक्रोन जोड़ें, 5-10 एस के लिए कुल्ला, 10-30 एस के लिए 0.2% अमोनिया पानी के 100 माइक्रोन जोड़ें, और 30 एस के लिए कुल्ला।
    नोट: हेमेटोक्सिलिन धुंधला होने के बाद, नाभिक से बंधे अत्यधिक हेमटोक्सिलिन डाई को हटाने और साइटोप्लाज्म द्वारा अवशोषित करने के लिए 0.5% हाइड्रोक्लोरिक एसिड इथेनॉल के साथ भेदभाव आवश्यक है। जब ईोसिन धुंधला हो जाना होता है, तो नाभिक और साइटोप्लाज्म स्पष्ट रूप से दाग जाएगा। स्लाइस 0.5% हाइड्रोक्लोरिक एसिड इथेनॉल के साथ भेदभाव के बाद लाल या गुलाबी दिखाई देंगे, इसलिए भेदभाव को रोकने के लिए ऊतक स्लाइस से एसिड को हटाने के लिए भेदभाव के तुरंत बाद कुल्ला। फिर, परमाणु धुंधला बढ़ाने के लिए 0.2% अमोनिया पानी का उपयोग करें।
  3. Eosin धुंधला: 5 मिनट के लिए ईोसिन धुंधला समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें) के 100 माइक्रोन बांटने के लिए एक 100 माइक्रोन विंदुक का उपयोग करें और 30 एस के लिए कुल्ला करें।
  4. निर्जलीकरण और सीलिंग: 5 मिनट के लिए पूर्ण इथेनॉल में स्लाइस विसर्जित करें, एक और 5 मिनट के लिए प्रक्रिया दोहराएं, 5 मिनट के लिए एक बार और दोहराएं, 5 मिनट के लिए डाइमिथाइल, और 5 मिनट के लिए ज़ाइलीन। अंत में, तटस्थ राल के साथ सील ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  5. खुर्दबीन पर सना हुआ अनुभाग रखकर: माइक्रोस्कोप पर सना हुआ अनुभाग स्थिति, माइक्रोस्कोप का ध्यान केंद्रित करें जब तक कि छवि स्पष्ट रूप से दिखाई न दे, आवर्धन को 40x पर सेट करें, और छवि को कैप्चर करें।

6. नाक के श्लेष्म ऊतक के बहुरंगा immunostaining

  1. डीवैक्सिंग और हाइड्रेशन: चरण 5.1 में बताए अनुसार इसका पालन करें।
  2. साइट्रेट-फॉस्फेट बफर उपचार: साइट्रेट-फॉस्फेट बफर (पीएच 6.0) ( सामग्री की तालिकादेखें) को माइक्रोवेव-सुरक्षित कंटेनर में रखें। इसे उबलने तक गर्म करें, इसे हटा दें, और फिर स्लाइड्स को कंटेनर में जोड़ें। उबलने तक 8 मिनट के लिए मध्यम गर्मी पर माइक्रोवेव, 8 मिनट के लिए गर्मी बंद करें, और फिर 7 मिनट के लिए मध्यम-कम गर्मी पर स्विच करें।
    1. प्राकृतिक ठंडा करने के बाद, स्लाइस को पीबीएस (पीएच 7.4) में स्थानांतरित करें, हिलाएं, और उन्हें तीन बार धोएं एक decolorizing प्रकार के बरतन का उपयोग करके, हर बार 5 मिनट के लिए।
      नोट: सुनिश्चित करें कि इस प्रक्रिया के दौरान बफर वाष्पित नहीं होता है, और स्लाइस को सूखने से रोकता है।
  3. अंतर्जात पेरोक्सीडेज को अवरुद्ध करना: स्लाइस को सुखाएं, एक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल पेन (एंटीबॉडी को बहने से रोकने के लिए) के साथ ऊतक के चारों ओर एक सर्कल खींचें, और 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान (हाइड्रोजन पेरोक्साइड: शुद्ध पानी = 1: 9) लागू करें।
    1. 15 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर सेते हैं. प्राकृतिक ठंडा करने के बाद, पीबीएस (पीएच 7.4) में स्लाइस रखें और उन्हें 5 मिनट प्रत्येक के तीन चक्रों के लिए एक decolorizing प्रकार के बरतन पर हिला.
  4. अवरुद्ध: सर्कल के भीतर 5% बकरी सीरम लागू करें और 30 मिनट के लिए सेते हैं.
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़: धीरे से अवरुद्ध समाधान को हटा दें, स्लाइस में FOXP3 (कमजोर पड़ने: 1:200, सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें, और इसे एक नम कक्ष में रखें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
    नोट: एंटीबॉडी वाष्पीकरण को रोकने के लिए नम कक्ष में पानी की एक छोटी मात्रा जोड़ें।
  6. माध्यमिक एंटीबॉडी इसके अलावा: पीबीएस (पीएच 7.4) में स्लाइस जगह और 5 मिनट प्रत्येक के तीन चक्र के लिए एक decolorizing प्रकार के बरतन पर उन्हें हिला. धीरे स्लाइस सूखी और माध्यमिक एंटीबॉडी लागू (बकरी विरोधी खरगोश IgG H &L, सामग्री की तालिकादेखें) सर्कल के भीतर. अंधेरे में 50 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  7. टायरामाइड कमजोर पड़ने के समाधान की तैयारी: 1x टीबीएसटी के 100 एमएल के साथ 3% एच 2 ओ2के 100 माइक्रोन को मिलाएं (सामग्री की तालिकादेखें)।
  8. टीएसए काम कर रहे समाधान के अलावा: टीएसए काम कर रहे समाधान तैयार करने के लिए CY3-Tyramide के 2 माइक्रोन के साथ Tyramide मंदक के 1 एमएल मिलाएं। प्रत्येक टुकड़ा करने के लिए टीएसए काम समाधान के 100 माइक्रोन लागू करें और 10 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर सेते हैं. फिर, पीबीएस के साथ स्लाइस को तीन बार, हर बार 5 मिनट धो लें।
    नोट: तुरंत टीएसए काम करने वाले समाधान को तैयार और उपयोग करें, और इसे अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें; यह 24 घंटे तक के लिए वैध है।
  9. दोहराएँ चरण 6.2-6.8: RORγt (FITC फ्लोरोसेंट डाई) के 1:200 कमजोर पड़ने के लिए और फिर TICAM1 (TYP620 डाई) के 1:200 कमजोर पड़ने के लिए ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  10. DAPI counterstained नाभिक: उन्हें सुखाने के लिए धीरे स्लाइस हिला, DAPI धुंधला समाधान लागू, और अंधेरे में 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  11. शमन autofluorescence: पीबीएस (पीएच 7.4) में स्लाइस जगह और 5 मिनट प्रत्येक के तीन चक्र के लिए एक decolorizing प्रकार के बरतन पर उन्हें हिला. स्लाइस के लिए autofluorescence quencher ( सामग्री की तालिकादेखें) लागू करें, 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें, और फिर 10 मिनट के लिए धो लें.
  12. अवरुद्ध: पीबीएस (पीएच 7.4) में स्लाइस जगह और 5 मिनट प्रत्येक के तीन चक्रों के लिए एक decolorizing प्रकार के बरतन पर उन्हें हिला. धीरे उन्हें सूखी करने के लिए स्लाइस हिला और विरोधी प्रतिदीप्ति क्वेंचर ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ उन्हें सील.
  13. माइक्रोस्कोपी: माइक्रोस्कोप पर सना हुआ अनुभाग रखें, स्पष्ट दृश्यता के लिए माइक्रोस्कोप का फोकस समायोजित करें, आवर्धन को 20x और 40x पर सेट करें, और छवि को कैप्चर करें।
    नोट: DAPI में 330-380 एनएम की यूवी उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और 420 एनएम (नीली रोशनी) की उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य है। FITC में 465-495 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और 515-555 एनएम (हरी रोशनी) की उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य है। CY3 में 510-560 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और 590 एनएम (लाल बत्ती) की उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य है। TYP-690 में 630 nm की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और 690 nm (गुलाबी प्रकाश) की उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य है।

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Representative Results

छह एसडी चूहों सफलतापूर्वक ओवीए intraperitoneal इंजेक्शन और नाक चुनौती के माध्यम से एआर मॉडल में प्रेरित किया गया. एआर समूह में सभी चूहों में एआर को प्रेरित किया गया था, जो समूह के 100% के लिए जिम्मेदार था। एआर समूह के सभी चूहों ने छींकने, नाक बहने और खुजली वाली नाक जैसे विशिष्ट लक्षणों का प्रदर्शन किया। सभी व्यवहार टिप्पणियों ने ≥5 अंक (तालिका 2) बनाए।

मॉडलिंग के 21वें दिन एच एंड ई धुंधला परिणामों से पता चला कि नियंत्रण चूहों में, नाक के श्लेष्म की उपकला कोशिकाएं और सिलिया अच्छी तरह से व्यवस्थित थे, जिसमें भड़काऊ सेल घुसपैठ के कोई संकेत नहीं थे। इसके विपरीत, एआर समूह में, नाक सेप्टम का म्यूकोसा क्षतिग्रस्त और अलग हो गया था, उल्लेखनीय न्यूट्रोफिल घुसपैठ (चित्रा 3) के साथ।

नियंत्रण समूह के साथ एआर चूहों के नाक म्यूकोसा ऊतक की तुलना करते समय, यह देखा गया कि आरओआर (एक Th17 सेल-विशिष्ट प्रतिलेखन कारक) और टीआईसीएएम -1 (टोल-जैसे रिसेप्टर लिंकर अणु -1) की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई थी, जबकि फॉक्सपी 3 (एक ट्रेग सेल-विशिष्ट प्रतिलेखन कारक) में कमी आई थी(चित्रा 4)।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो । (ए) इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन का योजनाबद्ध आरेख। (बी) नाक ड्रिप का योजनाबद्ध आरेख। (सी)एलर्जिक राइनाइटिस चूहों के मॉडलिंग का फ्लोचार्ट। (डी) व्यवहार अवलोकन का योजनाबद्ध आरेख। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: नाक हटाने की प्रक्रिया । (ए) मुंह के कोनों पर मांसपेशियों के ऊतकों को काटना। (बी) चीकबोन और जबड़ा के बीच संबंध काटना। (C) अनिवार्य का पृथक्करण। (डी) मैक्सिला की त्वचा को हटाना। (ई) नाक गुहा को उजागर करना। (एफ) नाक गुहा और मैक्सिला के बीच संबंध काटना। (जी) नाक गुहा और कक्षीय हड्डी के बीच संबंध काटना। (एच) हटाए गए नाक गुहा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एआर मॉडलिंग (एन = 6) के बाद 14 दिन पर प्रतिनिधि हिस्टोपैथोलॉजिकल एच एंड ई धुंधला छवियां। (ए) नियंत्रण चूहों के नाक म्यूकोसा में उपकला कोशिकाओं और सिलिया को अच्छी तरह से व्यवस्थित किया गया था, और कोई भड़काऊ सेल घुसपैठ नहीं देखी गई थी। (बी) एआर समूह के नाक सेप्टम का म्यूकोसा क्षतिग्रस्त हो गया था और न्यूट्रोफिल घुसपैठ से अलग हो गया था। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: आरओआरटी, फॉक्सपी 3, और टीआईसीएएम -1 (एन = 6) का एमआईएफ धुंधला विश्लेषण। नियंत्रण समूह की तुलना में, एआर समूह में चूहों के नाक के श्लेष्म ऊतकों में RORγt और TICAM-1 की अभिव्यक्ति को ऊंचा किया गया था, जबकि Foxp3 की अभिव्यक्ति कम हो गई थी। स्केल बार = 100 माइक्रोन (बाएं पैनल); 50 माइक्रोन (दाएं पैनल)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एमआईएफ तकनीक का सिद्धांत। एमआईएफ तकनीक टीएसए तकनीक पर आधारित है, जिसमें प्रतिजन को फ्लोरोसेंट सिग्नल को सहसंयोजक रूप से बांधना शामिल है। इस प्रक्रिया में, माध्यमिक एंटीबॉडी पर हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-लेबल एक निष्क्रिय से सक्रिय अवस्था में फ्लोरेसिन सब्सट्रेट के संक्रमण को उत्प्रेरित करता है। यह सक्रिय अवस्था प्रतिजन पर टायरोसिन को सहसंयोजक रूप से बांध सकती है, जिसके परिणामस्वरूप नमूने में फ्लोरेसिन का एक स्थिर सहसंयोजक लगाव होता है। इसके बाद, थर्मल मरम्मत के माध्यम से गैर-सहसंयोजक बाध्य एंटीबॉडी को हटा दिया जाता है। प्रक्रिया को तब अतिरिक्त प्राथमिक एंटीबॉडी, माध्यमिक एंटीबॉडी और फ्लोरेसिन के साथ दोहराया जाता है ताकि पूरी तरह से अलग एंटीजन का पता लगाया जा सके। इस छवि को फिर से तैयार किया गया था और एमआईएफ योजनाबद्ध आरेख17 के संदर्भ में रंग-मिलान किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

स्कोर छींकने की आवृत्ति राइनोरिया नाक रगड़ना
1 <3 नाक गुहा के भीतर पानी का निर्वहन मामूली और कभी-कभी नाक रगड़ना
2 4 ~ 10 पूर्वकाल नारियों से पानी का निर्वहन बार-बार नाक रगड़ना
3 ≥11 चेहरा प्रचुर मात्रा में पानी के निर्वहन के साथ कवर किया गया नाक से चेहरे तक रगड़ना

तालिका 1: चूहे व्यवहार परीक्षण की मात्रात्मक पैमाने तालिका।

अविभाज्य दिन 1 दिन 21
नियंत्रण 1 0 0
नियंत्रण 2 0 0
नियंत्रण 3 0 0
नियंत्रण 4 0 0
नियंत्रण 5 0 0
नियंत्रण 6 0 0
एआर 1 0 7
एआर 2 0 6
एआर 3 0 5
एआर 4 0 5
एआर 5 0 5
एआर 6 0 6

तालिका 2: व्यवहार स्कोरिंग के परिणाम।

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Discussion

एलर्जिक राइनाइटिस (एआर) नाक के श्लेष्म की एक गैर-संक्रामक सूजन की बीमारी है जो पर्यावरण और आनुवंशिक कारकों के संयोजन से उत्पन्न होती है। यह एक वैश्विक स्वास्थ्य चिंता बन गई है, जो कार्य कुशलता को प्रभावित करती है, जीवन की गुणवत्ता को कम करती है, नींद को खराब करती है, संज्ञानात्मक कार्य करती है, और चिड़चिड़ापन और थकान पैदा करती है। एआर दुनिया की आबादी का 10% -20% प्रभावित करता है और पर्याप्त आर्थिक लागत वहन करता है, जिससे यूरोपीय संघ के देशों में 30-50 बिलियन यूरो तक का वार्षिक नुकसान होता है18. इसके अलावा, कई अध्ययनों ने एआर और अस्थमा18,19,20 के बीच एक मजबूत संबंध स्थापित किया है, एआर वाले व्यक्तियों में एआर 21 के बिना उन लोगों की तुलना में अस्थमा विकसित होने की संभावना सात गुना अधिक है। वर्तमान शोध से पता चलता है कि टाइप 1 हेल्पर टी कोशिकाओं (Th1) और टाइप 2 हेल्पर टी कोशिकाओं (Th2) के बीच Th2 कोशिकाओं के प्रति पूर्वाग्रह के साथ असंतुलन AR में एक महत्वपूर्ण योगदानकर्ता है। Th2 कोशिकाएं, इंटरल्यूकिन -4 द्वारा प्रेरित, IL-5 और IL-13 जैसे Th2-जैसे साइटोकिन्स का उत्पादन करती हैं, B लिम्फोसाइट्स, मस्तूल कोशिकाओं, ईोसिनोफिल और डेंड्राइटिक कोशिकाओं22 में सूजन को ट्रिगर करती हैं. इसके अलावा, हाल ही में एआर अनुसंधान सहायक Th17/नियामक टी सेल (Treg) आबादी23 में असंतुलन के बीच एक मजबूत संबंध इंगित करता है. Th17 और Treg कोशिकाएं, दोनों CD4+ T कोशिकाओं से प्राप्त होती हैं, प्रतिरक्षा प्रणाली में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। RORot Th17 सेल भेदभाव24 के लिए आवश्यक है, जबकि Treg कोशिकाओं, immunosuppressive कार्यों के साथ, प्रतिरक्षा सहिष्णुता बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं. Foxp3 अभिव्यक्ति में परिवर्तन Treg सेल समारोह25,26 प्रभाव. इस प्रकार, RORγt और Foxp3 स्तरों में परिवर्तन Th17/Treg असंतुलन को दर्शाते हैं, संभावित रूप से मुख्य रूप से Th17 कोशिकाओं27 द्वारा संचालित एक भड़काऊ प्रतिक्रिया को प्रेरित करते हैं। टोल की तरह रिसेप्टर्स (टीएलआर) शरीर की जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली में महत्वपूर्ण प्रोटीन हैं, विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति28 को सक्रिय करने के लिए इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग रास्ते मध्यस्थता. हे शान एट अल 29 द्वारा किए गए शोध में पाया गया कि टीएलआर 4 जीन में भिन्नताएं, विशेष रूप से आरएस 10759930 स्थान पर सीटी विषमयुग्मजी और टीटी शुद्ध उत्परिवर्तन, एआर विकास से जुड़े थे। टीएलआर 3 और टीएलआर 4 के बीच ब्रिजिंग अणु के रूप में टीआईसीएएम -1 की भूमिका को देखते हुए, यह अनुमान लगाया गया था कि एआर को टीआईसीएएम -1 से जोड़ा जा सकता है। दरअसल, परिणामों ने एआर समूह में ऊंचा टीआईसीएएम -1 अभिव्यक्ति दिखाई, जो जू एट अल के अध्ययन30 के अनुरूप है।

इस अध्ययन में नियोजित एमआईएफ (मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस) तकनीक पिछले 20 वर्षों में विकसित एक अपेक्षाकृत नई पहचान विधि है। यह पारंपरिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) तकनीकों पर कई फायदे प्रदान करता है, जिसमें दृश्य विश्लेषण की क्षमता के साथ-साथ विशिष्टता, संवेदनशीलता और थ्रूपुट शामिल हैं। यह तकनीक टीएसए (टायरामाइड सिग्नल एम्प्लीफिकेशन) विधि पर आधारित है, जो एंटीजन को फ्लोरोसेंट संकेतों को सहसंयोजक रूप से बांधती है और माइक्रोवेव हीटिंग से अप्रभावित रहती है। यह टीएसए फ्लोरोसेंट धुंधला के दोहराया चक्र के माध्यम से ऊतकों की बहुरंगा लेबलिंग के लिए अनुमति देता है, माइक्रोवेव हीटिंग के बाद एंटीबॉडी को हटाने के लिए जबकि फ्लोरोसेंट संकेत 17,31,32(चित्रा 5)को बनाए रखने. उन्नत एल्गोरिदम तो स्वत: पहचान और multilabeled छवियों में विशिष्ट संरचनाओं को प्रदर्शित लक्ष्य ऊतक क्षेत्रों के विभाजन के लिए लागू कर रहे हैं. यह ब्याज के क्षेत्रों के मात्रात्मक सांख्यिकीय विश्लेषण को सक्षम बनाता है, सेलुलर प्रतिरक्षा फेनोटाइप के मात्रात्मक मूल्यांकन और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के कार्यात्मक स्थानीयकरण की अनुमति देता है। यह भी ऊतक संदर्भ और स्थानिक वितरण33,34 पर जानकारी प्रदान करता है.

हालांकि, तकनीकी रूप से, एमआईएफ अभी भी पारंपरिक आईएफ तकनीकों पर निर्भर करता है और एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी और ऑप्टिकल क्रॉसस्टॉक जैसी चुनौतियों का सामना करता है। कई एंटीबॉडी के उपयोग से पार प्रतिक्रियाशीलता और झूठी सकारात्मक परिणाम हो सकता है, जबकि अतिव्यापी प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा कई लक्ष्यों से प्रतिदीप्ति संकेतों के सम्मिश्रण में परिणाम हो सकता है, नग्न आंखों भेदभाव चुनौतीपूर्ण बनाने और विशेष छवि विश्लेषण एल्गोरिदम35 पर निर्भरता में वृद्धि. इसके अलावा, फ्लोरोसेंट रंगों एंटीबॉडी लेबल करने के लिए उपयोग किया जाता है के रूप में, एमआईएफ प्रतिदीप्ति शमन और विरंजन से प्रभावित किया जा सकता है, कम संकेत तीव्रता के लिए अग्रणी. विशेष रूप से, जबकि पारंपरिक आईएफ तकनीक पूरे ऊतक का मूल्यांकन करती है, एमआईएफ तकनीक विश्लेषण के लिए ऊतक अनुभाग के भीतर ब्याज के विशिष्ट क्षेत्रों पर ध्यान केंद्रित करती है। यह ऊतक विषमता के कारण वास्तविकता से विचलन का परिचय दे सकता है, संभावित रूप से गलत हिस्टोलॉजिकल परिमाणीकरण या दुर्लभ घटनाओं की चूक के परिणामस्वरूप।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को सिचुआन प्रांतीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग (2021YJ0175) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Al(OH)3 Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd A7130
75% ethanol Anhui Yiren An Co., Ltd 20210107
Ammonia Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd 2021070101
Anhydrous ethanol Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd 2022070501
Anti-fluorescence quenching sealer SouthernBiotech 0100-01
Automatic dyeing machine Thermo scientific Varistain Gemini ES
Carrier slides Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd 220518001
Citrate-phosphate buffer  Servicebio biotechnology co., Ltd G1201
Citric acid antigen repair solution (PH 6.0) Xavier Biotechnology Co., Ltd G1201
Coverslip Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. 220518001
Coverslip Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd CS01-2450
CY3-Tyramide Sawell Biotechnology Co., Ltd G1223-50UL
DAPI Sawell Biotechnology Co., Ltd G1012
Decoloring shaker SCILOGEX S1010E
EDTA decalcification solution Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd CR2203047
Electric heating blast dryer  Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd DHG-9240A
Embedding box marking machine Thermo scientific  PrintMate AS
Embedding machine Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd JB-P5
Fast tissue dewatering machine Thermo scientific STP420 ES
Film sealer Thermo scientific Autostainer 360
FITC-Tyramide Sawell Biotechnology Co., Ltd G1222-50UL
Fluorescence microscope Sunny Optical Technology Co.Ltd CX40
Foxp3 Affinity Biosciences Co., Ltd bs-10211R
Freezing table Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd JB-L5
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) Liankebio Co., Ltd GAR0072
Goat serum Biosharp BL210A
H&E staining kit Leagene DH0020
Hemostatic forceps Shanghai Medical Devices Co., Ltd J31010
Hydrochloric acid Sichuan Xilong Science Co., Ltd 210608
Immunohistochemical pen Biosharp BC004
Microwave oven Midea M1-L213B
Neutral gum Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd 10004160
Ovalbumin  Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd A804010
Oven Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd DHG-9240A
Palm centrifuge SCILOGEX D1008E
Paraformaldehyde Beyotime Biotechnology Co., Ltd P0099-100ml
Pathology section scanner 3DHISTECH Kft Pannoramic SCAN 
PBS buffer Biosharp G4202
Pipette  Dragon KE0003087/KA0056573
Rorγt Affinity Biosciences Co., Ltd DF3196
Scalpel Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd 20170022
Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B Bioengineering Co., Ltd A602008-0025
Slicer Thermo scientific HM325
Slicing machine Thermo scientific HM325
Slide Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd PC2-301
Sprague Dawley rats Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine SYX Equation 1 2023-0100
TICAM-1 Affinity Biosciences Co., Ltd DF6289
Tissue scissors Shanghai Medical Devices Co., Ltd J22120
Tissue spreading baking sheet machine Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd JK-6
TYR-690 fluorescent dyes Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd RC0086-34RM
Vortex mixer SCILOGEX SLK-O3000-S
Water bath-slide drier Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd JK-6
Wax trimmer Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd JXL-818
Xylene Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd 2022051901

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References

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इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग नाक म्यूकोसा ऊतक अनुभाग एलर्जिक राइनाइटिस चूहे बहुरंगा इम्यूनोसे विशिष्ट इम्युनोग्लोबुलिन ई आईएफ धुंधला रोग-विशिष्ट प्रोटीन अभिव्यक्ति बहुरंगा आईएफ तकनीक एआर का चूहा मॉडल नाक म्यूकोसल नमूने बहुरंगा इम्यूनोफ्लोरेसेंस एआर के लक्षण छींकना बहती नाक खुजली वाली नाक भड़काऊ सेल मायने रखता है नाक श्लैष्मिक अखंडता RORγt अभिव्यक्ति TICAM-1 अभिव्यक्ति Foxp3 अभिव्यक्ति
नाक म्यूकोसा ऊतक वर्गों में इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग बहुरंगा इम्यूनोसे के <em>माध्यम से</em> एलर्जिक राइनाइटिस चूहों के खंड
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Hu, Y., Luo, H., Li, J., Zhang, R., Fu, L., Ren, Q., Chen, Y., Huang, X., Zhou, Z., Yuan, H., Tian, L., Wang, X. Immunofluorescent Labeling in Nasal Mucosa Tissue Sections of Allergic Rhinitis Rats via Multicolor Immunoassay. J. Vis. Exp. (199), e65937, doi:10.3791/65937 (2023).

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