Summary
Este protocolo describe una técnica de inmunofluorescencia multicolor para evaluar el modelo de rinitis alérgica en ratas.
Abstract
La rinitis alérgica (RA) es una enfermedad inflamatoria crónica no infecciosa de la mucosa nasal, mediada principalmente por inmunoglobulina E (IgE) específica, que afecta aproximadamente al 10%-20% de la población mundial. Si bien la tinción por inmunofluorescencia (FI) ha sido durante mucho tiempo una técnica estándar para detectar la expresión de proteínas específicas de la enfermedad, las técnicas convencionales de FI tienen una capacidad limitada para detectar los niveles de expresión de tres o más proteínas en la misma muestra. En consecuencia, en los últimos años se han desarrollado técnicas de FI multicolor, que permiten el marcaje simultáneo de múltiples dianas en células o tejidos.
Este protocolo proporciona una visión general completa del proceso para establecer un modelo de RA en ratas, obtener muestras de mucosa nasal y los procedimientos técnicos para la inmunofluorescencia multicolor. Todas las ratas en el grupo de RA exhibieron síntomas típicos como estornudos, secreción nasal y picazón nasal, con observaciones de comportamiento que obtuvieron ≥5 puntos. La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) reveló un aumento de los recuentos de células inflamatorias y una alteración de la integridad de la mucosa nasal en el grupo AR. La inmunofluorescencia multicolor (mIF) demostró un aumento de la expresión de RORγt y TICAM-1, mientras que la expresión de Foxp3 disminuyó en el tejido de la mucosa nasal de ratas AR.
Introduction
La rinitis alérgica (RA) es una enfermedad inflamatoria crónica no infecciosa de la mucosa nasal mediada principalmente por inmunoglobulina E (IgE) específica1,2. Se caracteriza por síntomas como estornudos, secreción nasal, congestión nasal y picazón nasal. Con la industrialización y la urbanización, la prevalencia de la RA está aumentando gradualmente, afectando aproximadamente al 10%-20% de la población mundial1. La técnica de inmunofluorescencia (IF) es un método de tinción fluorescente que utiliza una reacción de unión anticuerpo-antígeno. Se puede emplear para detectar y cuantificar los niveles de distribución y expresión de proteínas específicas en tejidos biológicos o células. En la investigación de RA, la FI puede detectar simultáneamente múltiples dianas, incluidas citoquinas relacionadas con la RA, células inflamatorias, receptores y más, lo que facilita la exploración de la patogénesis de la RA y los efectos de los fármacos 3,4,5,6.
El proceso de tinción por inmunofluorescencia multicolor (mIF) se parece mucho al FI tradicional, con la adición de un paso de elución de anticuerpos durante cada ronda de tinción. Esta modificación permite la detección simultánea de múltiples biomarcadores en la misma sección de tejido a través de un solo etiquetado secuencial y múltiples rondas de retinción. La mIF se basa en la amplificación de la señal de tiramida (TSA), lo que permite ciclos repetidos de tinción fluorescente de TSA y el uso de calentamiento por microondas para eliminar los anticuerpos mientras se conservan las señales fluorescentes 7,8. En comparación con el FI convencional, el FIm ofrece varias ventajas: (1) puede detectar antígenos débilmente expresados que son difíciles de identificar con el FI convencional 9,10; (2) proporciona una tinción de alta calidad con una relación señal-ruido mejorada; (3) permite cuantificar las estructuras específicas de los tejidos y las regiones de interés11; (4) la multiplexación de múltiples vías utiliza eficientemente los tejidos y conserva los recursos patológicos limitados12; (5) el análisis multiparamétrico a través de mIF ofrece una visión más profunda de los tejidos, descubriendo información biológica oculta13.
En general, mIF permite la observación de diferentes expresiones y distribuciones de antígenos dentro de una misma muestra, facilitando el estudio de las proteínas diana. En el futuro, los investigadores que busquen comprender la expresión y distribución de múltiples proteínas diana encontrarán en esta técnica una opción valiosa. Este estudio demuestra la aplicación de mIF para la tinción de muestras de mucosa nasal de ratas con RA y evalúa el establecimiento de un modelo de RA en ratas.
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Protocol
El protocolo y los procedimientos experimentales han recibido la aprobación del Comité Administrativo y de Investigación Animal de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (Número de registro: 2022DL-010). Se obtuvieron comercialmente ratas macho Sprague Dawley (SD) de ocho semanas de edad, con un peso de 180-200 g (ver Tabla de Materiales) y se alojaron bajo un ciclo de luz/oscuridad natural con temperatura controlada (23 ± 2 °C) y humedad relativa (55% ± 10%). Doce ratas fueron divididas aleatoriamente en dos grupos: el grupo de control y el grupo de AR. Todas las ratas se aclimataron a estas condiciones y se les proporcionó acceso gratuito a comida y agua durante una semana antes del ensayo.
1. Establecimiento de un modelo de RA en ratas
- Preparación de la solución sensibilizante: suspender 30 mg de ovoalbúmina (OVA) y 3 g de Al(OH)3 en 100 mL de suero fisiológico (ver Tabla de Materiales)14,15.
- Sensibilización básica: agarrar y sostener a la rata completamente despierta con el abdomen hacia arriba. Desinfecte el abdomen con bolas de algodón empapadas en alcohol al 75%. Utilice una jeringa de 1,5 ml para inyectar 1 ml de la solución sensibilizante preparada en el paso 1.1 en la cavidad abdominal izquierda de las ratas del grupo AR. Repita esta inyección una vez cada dos días durante 14 días (Figura 1A).
NOTA: Asegúrese de que la cabeza de la rata esté colocada más abajo que su cola para evitar daños en los intestinos grueso y delgado al insertar la jeringa. El lugar de la inyección se encuentra a 1,5 cm de la línea media ventral. Las ratas del grupo control deben recibir inyecciones intraperitoneales de 1 ml de solución salina normal una vez cada dos días durante 14 días. - Provocación nasal: Administrar 50 μL de OVA al 5% mediante gotas nasales utilizando una pipeta de 100 μL (Figura 1B) al día siguiente de la sensibilización basal, repitiendo este procedimiento durante 7 días (Figura 1C).
NOTA: Prepare la solución de OVA al 5% mezclando 5 g de OVA con 100 ml de solución salina. Para el grupo control, administrar gotas del mismo volumen de solución salina.
2. Puntuación conductual de ratas
- Dentro de los 30 minutos posteriores a completar el desafío nasal final, observe y registre a las ratas con una cámara digital para identificar síntomas como rascarse la nariz, estornudar y secreción nasal, según los criterios de puntuación descritos en la Tabla 1 (Figura 1D).
NOTA: La confirmación del modelado de RA exitoso se basa en lograr una puntuación total de ≥5 puntos14.
3. Adquisición de muestras de mucosa nasal
- Sacrificio de ratas: sacrificar las ratas exponiéndolas a una sobredosis de CO2. Después, desinfecte las ratas con etanol al 75% (ver Tabla de Materiales). Use un bisturí para hacer una incisión a lo largo de las dos esquinas de la boca para exponer el tejido muscular (Figura 2A). A continuación, corte las articulaciones del hueso cigomático y la mandíbula a ambos lados del cráneo con unas tijeras de tejido (Figura 2B) y retire la mandíbula (Figura 2C).
- Exposición de la cavidad nasal: separar la piel del maxilar con un hemostático (Figura 2D) para exponer la cavidad nasal (Figura 2E). Corte la conexión ósea entre la cavidad nasal y el maxilar con unas tijeras de tejido (Figura 2F). A continuación, cortar la conexión entre la cavidad nasal y los huesos orbitarios de ambos lados en el agujero infraorbitario (Figura 2G) y extirpar la cavidad nasal (Figura 2H).
- Fijación: colocar la cavidad nasal extraída en paraformaldehído al 4% para su fijación y conservarla a temperatura ambiente durante 24-72 h (ver Tabla de Materiales).
NOTA: Asegúrese de que la cantidad de fijador de paraformaldehído utilizada sea suficiente para cubrir completamente las secciones para una fijación adecuada.
4. Preprocesamiento de muestras de mucosa nasal
- Descalcificación: comience fijando los tejidos eliminados del paso 3.1. Lávelos tres veces con PBS durante 20 minutos cada uno. A continuación, lávelos tres veces con agua destilada, cada vez durante 20 minutos. Posteriormente, descalcificar los tejidos en una solución de descalcificación con un volumen de 20-30 veces el de los tejidos a temperatura ambiente.
- La solución de descalcificación (ver Tabla de Materiales) debe mantener un pH de 7.2-7.4. Finalmente, coloque el tejido descalcificado en una caja de deshidratación.
NOTA: La solución descalcificante debe cambiarse semanalmente. El proceso de descalcificación puede concluir cuando el tejido se ablanda (aproximadamente 2 meses).
- La solución de descalcificación (ver Tabla de Materiales) debe mantener un pH de 7.2-7.4. Finalmente, coloque el tejido descalcificado en una caja de deshidratación.
- Deshidratación y encerado: transfiera la caja de deshidratación a un deshidratador (ver Tabla de Materiales). Comience con 75% de alcohol durante 4 h, seguido de 85% de alcohol durante 2 h, 90% de alcohol durante 2 h y 95% de alcohol durante 1 h.
- Posteriormente, sumerja el tejido en etanol anhidro durante 30 minutos, repita el proceso durante otros 30 minutos, use xileno durante 5-10 minutos, repita este paso durante otros 5-10 minutos, sumerja el tejido en cera durante 1 h, repita este paso durante otra hora y, finalmente, sumerja el tejido en cera durante 1 hora adicional.
- Incrustación: coloque el bloque de cera derretida en la caja de incrustación (consulte la tabla de materiales) y guárdelo en un congelador a -20 ° C. Una vez que la cera se solidifique, retírala y recorta el bloque de cera.
- Loncheado: insertar el bloque de cera recortado en un micrótomo de parafina (ver Tabla de materiales) y cortarlo en rodajas con un grosor de 3 μm. Coloque las rodajas en un baño de agua a 40 °C en un esparcidor deslizante. Aplanar el pañuelo, luego levantarlo con un portaobjetos de vidrio y hornearlo en un horno a 60 ° C.
- Una vez que el agua se haya evaporado y la cera esté bien fraguada, retire los portaobjetos y guárdelos a una temperatura de 25 °C.
5. Tinción de H&E del tejido de la mucosa nasal
- Desparafinado e hidratación: colocar las rodajas en xileno durante 20 min, repetir el proceso durante otros 20 min, etanol absoluto durante 5 min, repetir este paso durante otros 5 min, alcohol al 75% durante 5 min, y finalmente, lavar durante 5 min.
- Tinción con hematoxilina: dispensar 100 μL de solución de tinción con hematoxilina (ver Tabla de materiales) durante 3-5 min con una pipeta de 100 μL, enjuagar durante 5-10 s, añadir 100 μL de etanol de ácido clorhídrico al 0,5% durante 10-30 s, enjuagar durante 5-10 s, añadir 100 μL de agua amoniacal al 0,2% durante 10-30 s y enjuagar durante 30 s.
NOTA: Después de la tinción con hematoxilina, es necesaria la diferenciación con etanol de ácido clorhídrico al 0,5% para eliminar el exceso de colorante de hematoxilina unido al núcleo y absorbido por el citoplasma. Cuando se realiza la tinción con eosina, los núcleos y el citoplasma se tiñen claramente. Las rodajas aparecerán rojas o rosadas después de la diferenciación con etanol de ácido clorhídrico al 0,5%, así que enjuague inmediatamente después de la diferenciación para eliminar el ácido de las rodajas de tejido y detener la diferenciación. A continuación, utilice agua con amoníaco al 0,2% para mejorar la tinción nuclear. - Tinción con eosina: utilice una pipeta de 100 μL para dispensar 100 μL de solución de tinción con eosina (consulte la Tabla de materiales) durante 5 min y enjuague durante 30 s.
- Deshidratación y sellado: sumergir las rodajas en etanol absoluto durante 5 minutos, repetir el proceso durante otros 5 minutos, repetir una vez más durante 5 minutos, dimetil durante 5 minutos y xileno durante 5 minutos. Por último, sellar con resina neutra (ver Tabla de Materiales).
- Colocación de la sección teñida en el microscopio: coloque la sección teñida en el microscopio, ajuste el enfoque del microscopio hasta que la imagen sea claramente visible, ajuste el aumento a 40x y capture la imagen.
6. Inmunotinción multicolor del tejido de la mucosa nasal
- Desparafinado e hidratación: siga lo mismo que se mencionó en el paso 5.1.
- Tratamiento con tampón de citrato-fosfato: coloque el tampón de citrato-fosfato (pH 6,0) (consulte la tabla de materiales) en un recipiente apto para microondas. Caliéntalo hasta que hierva, retíralo y luego agrega los portaobjetos al recipiente. Cocine en el microondas a fuego medio durante 8 minutos hasta que hierva, apague el fuego durante 8 minutos y luego cambie a fuego medio-bajo durante 7 minutos.
- Después del enfriamiento natural, transfiera las rodajas a PBS (pH 7.4), agítelas y lávelas tres veces con una coctelera decolorante, cada vez durante 5 minutos.
NOTA: Asegúrese de que el tampón no se evapore durante este proceso y evite que las rodajas se sequen.
- Después del enfriamiento natural, transfiera las rodajas a PBS (pH 7.4), agítelas y lávelas tres veces con una coctelera decolorante, cada vez durante 5 minutos.
- Bloqueo de la peroxidasa endógena: secar las rodajas, dibujar un círculo alrededor del tejido con un bolígrafo inmunohistoquímico (para evitar que el anticuerpo se desvanezca) y aplicar una solución de peróxido de hidrógeno al 3% (peróxido de hidrógeno: agua pura = 1:9).
- Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 min. Después del enfriamiento natural, coloque las rodajas en PBS (pH 7.4) y agítelas en una coctelera decolorante durante tres ciclos de 5 minutos cada uno.
- Bloqueo: aplicar un 5% de suero de cabra dentro del círculo e incubar durante 30 min.
- Adición primaria de anticuerpos: retire suavemente la solución de bloqueo, agregue FOXP3 (dilución: 1:200, consulte la tabla de materiales) a la rebanada y colóquela en una cámara húmeda. Incubar a 4 °C durante la noche.
NOTA: Agregue una pequeña cantidad de agua a la cámara húmeda para evitar la evaporación de anticuerpos. - Adición secundaria de anticuerpos: colocar las rodajas en PBS (pH 7,4) y agitarlas en un agitador decolorante durante tres ciclos de 5 min cada uno. Seque suavemente las rodajas y aplique el anticuerpo secundario (IgG H&L contra el conejo de cabra, consulte la tabla de materiales) dentro del círculo. Incubar a temperatura ambiente durante 50 minutos en la oscuridad.
- Preparación de la solución de dilución de tiramida: combinar 100 μL de H 2 O2al 3% con 100 ml de 1x TBST (ver Tabla de Materiales).
- Adición de la solución de trabajo TSA: Mezcle 1 ml de diluyente de tiramida con 2 μl de CY3-tiramida para preparar la solución de trabajo de TSA. Aplicar 100 μL de solución de trabajo TSA a cada rebanada e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 min. Luego, lave las rodajas con PBS tres veces, 5 minutos cada vez.
NOTA: Prepare y utilice inmediatamente la solución de trabajo TSA y guárdela a 4 °C en la oscuridad; Tiene una validez de hasta 24 h. - Repita los pasos 6.2-6.8: cambie a una dilución 1:200 de RORγt (colorante fluorescente FITC) y luego a una dilución 1:200 de TICAM1 (colorante TYP620) (consulte la Tabla de materiales).
- Núcleos contrateñidos con DAPI: agitar suavemente las rodajas para secarlas, aplicar solución de tinción DAPI e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos en la oscuridad.
- Autofluorescencia de apagado: colocar las rodajas en PBS (pH 7,4) y agitarlas en un agitador decolorante durante tres ciclos de 5 min cada uno. Aplique el extintor de autofluorescencia (consulte la Tabla de materiales) a las rodajas, espere 5 minutos y luego lave durante 10 minutos.
- Bloqueo: colocar las rodajas en PBS (pH 7,4) y agitarlas en un agitador decolorante durante tres ciclos de 5 min cada uno. Agite suavemente las rodajas para secarlas y séllelas con el extintor antifluorescente (consulte la tabla de materiales).
- Microscopía: coloque la sección teñida en el microscopio, ajuste el enfoque del microscopio para una visibilidad clara, ajuste el aumento a 20x y 40x y capture la imagen.
NOTA: DAPI tiene una longitud de onda de excitación UV de 330-380 nm y una longitud de onda de emisión de 420 nm (luz azul). FITC tiene una longitud de onda de excitación de 465-495 nm y una longitud de onda de emisión de 515-555 nm (luz verde). CY3 tiene una longitud de onda de excitación de 510-560 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm (luz roja). TYP-690 tiene una longitud de onda de excitación de 630 nm y una longitud de onda de emisión de 690 nm (luz rosa).
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Representative Results
Seis ratas SD fueron inducidas con éxito en el modelo AR mediante inyección intraperitoneal de OVA y provocación nasal. La RA fue inducida en todas las ratas del grupo AR, lo que representa el 100% del grupo. Todas las ratas del grupo AR mostraron síntomas típicos como estornudos, secreción nasal y picazón nasal. Todas las observaciones conductuales obtuvieron una puntuación de ≥5 puntos (Tabla 2).
Los resultados de la tinción de H&E enel día 21 del modelado revelaron que en las ratas de control, las células epiteliales y los cilios de la mucosa nasal estaban bien organizados, sin signos de infiltración de células inflamatorias. Por el contrario, en el grupo AR, la mucosa del tabique nasal estaba dañada y desprendida, con notable infiltración de neutrófilos (Figura 3).
Al comparar el tejido de la mucosa nasal de ratas AR con el grupo control, se observó que la expresión de RORγt (un factor de transcripción específico de células Th17) y TICAM-1 (molécula enlazadora de receptores tipo Toll-1) estaba aumentada, mientras que Foxp3 (un factor de transcripción específico de células Treg) estaba disminuida (Figura 4).
Figura 1: El flujo de trabajo experimental . (A) Diagrama esquemático de la inyección intraperitoneal. (B) Diagrama esquemático del goteo nasal. (C) Diagrama de flujo de modelado de ratas con rinitis alérgica. (D) Diagrama esquemático de observación conductual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Proceso de extracción nasal . (A) Corte del tejido muscular en las comisuras de la boca. (B) Cortar la conexión entre el pómulo y la mandíbula. (C) Separación de la mandíbula. (D) Extirpación de la piel del maxilar. (E) Exposición de la cavidad nasal. (F) Cortar la conexión entre la cavidad nasal y el maxilar. (G) Cortar la conexión entre la cavidad nasal y el hueso orbitario. (H) La cavidad nasal extirpada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes representativas de tinción histopatológica de H&E en el día 14 después del modelado de RA (n = 6). (A) Las células epiteliales y los cilios de la mucosa nasal de las ratas de control estaban bien organizados y no se observó infiltración de células inflamatorias. (B) La mucosa del tabique nasal del grupo AR se dañó y se desprendió con infiltración de neutrófilos. Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de tinción de MIF de RORγt, Foxp3 y TICAM-1 (n = 6). En comparación con el grupo control, la expresión de RORγt y TICAM-1 en los tejidos de la mucosa nasal de las ratas en el grupo AR fue elevada, mientras que la expresión de Foxp3 disminuyó. Barras de escala = 100 μm (paneles izquierdos); 50 μm (paneles derechos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Principio de la técnica mIF. La técnica mIF se basa en la técnica TSA, que consiste en unir covalentemente la señal fluorescente al antígeno. En este proceso, la peroxidasa de rábano picante marcada en el anticuerpo secundario cataliza la transición del sustrato de fluoresceína de un estado inactivo a uno activado. Este estado activado puede unirse covalentemente a la tirosina del antígeno, lo que da lugar a una unión covalente estable de la fluoresceína a la muestra. Posteriormente, los anticuerpos unidos no covalentemente se eliminan mediante reparación térmica. A continuación, se repite el procedimiento con anticuerpos primarios adicionales, anticuerpos secundarios y fluoresceína para permitir la detección de un antígeno completamente diferente. Esta imagen fue redibujada y emparejada con el color con referencia al diagrama esquemáticomIF 17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Puntuaciones | Frecuencia de estornudos | Rinorrea | Frotamiento nasal |
| 1 | <3 | secreción acuosa dentro de la cavidad nasal | frotamientos nasales leves y ocasionales |
| 2 | 4~10 | secreción acuosa que se derrama de la narina anterior | frotamientos nasales repetidos |
| 3 | ≥11 | la cara cubierta de abundante secreción acuosa | roces de la nariz a la cara |
Tabla 1: Tabla de escala cuantitativa de la prueba de comportamiento de ratas.
| Individuales | Día 1 | Día 21 |
| Control 1 | 0 | 0 |
| Control 2 | 0 | 0 |
| Control 3 | 0 | 0 |
| Control 4 | 0 | 0 |
| Control 5 | 0 | 0 |
| Control 6 | 0 | 0 |
| AR 1 | 0 | 7 |
| AR 2 | 0 | 6 |
| AR 3 | 0 | 5 |
| AR 4 | 0 | 5 |
| AR 5 | 0 | 5 |
| AR 6 | 0 | 6 |
Tabla 2: Resultados de la puntuación conductual.
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Discussion
La rinitis alérgica (RA) es una enfermedad inflamatoria no infecciosa de la mucosa nasal que resulta de una combinación de factores ambientales y genéticos. Se ha convertido en un problema de salud mundial, que afecta la eficiencia del trabajo, disminuye la calidad de vida, perjudica el sueño, la función cognitiva y causa irritabilidad y fatiga. La RA afecta a entre el 10 % y el 20 % de la población mundial¹ y conlleva costes económicos sustanciales, causando pérdidas anuales de hasta 30-50 mil millones de euros en los países de la UE18. Además, varios estudios han establecido una fuerte asociación entre la RA y el asma18,19,20, siendo siete veces más probable que las personas con RA desarrollen asma que las que no la padecen21. La investigación actual sugiere que un desequilibrio entre las células T auxiliares de tipo 1 (Th1) y las células T auxiliares de tipo 2 (Th2) con un sesgo hacia las células Th2 es un contribuyente significativo a la RA. Las células Th2, estimuladas por la interleucina-4, producen citocinas similares a Th2 como IL-5 e IL-13, lo que desencadena inflamación en linfocitos B, mastocitos, eosinófilos y células dendríticas22. Además, investigaciones recientes sobre RA indican una fuerte conexión entre un desequilibrio en las poblaciones de células T auxiliares Th17 y reguladoras (Treg)23. Las células Th17 y Treg, ambas derivadas de las células T CD4+, desempeñan un papel fundamental en el sistema inmunitario. RORγt es esencial para la diferenciación de las células Th1724, mientras que las células Treg, con funciones inmunosupresoras, son clave para mantener la tolerancia inmune. Los cambios en la expresión de Foxp3 influyen en la función de las células Treg25,26. Por lo tanto, las alteraciones en los niveles de RORγt y Foxp3 reflejan desequilibrios de Th17/Treg, lo que puede inducir una respuesta inflamatoria impulsada principalmente por las células Th1727. Los receptores tipo Toll (TLR) son proteínas vitales en el sistema inmunitario innato del cuerpo, que median las vías de señalización intracelular para activar la expresión génica específica28. La investigación de He Shan et al.29 encontró que las variaciones en el gen TLR4, específicamente las mutaciones heterocigóticas CT y TT puras en el locus rs10759930, estaban asociadas con el desarrollo de AR. Dado el papel de TICAM-1 como molécula puente entre TLR3 y TLR4, se planteó la hipótesis de que AR podría estar relacionado con TICAM-1. De hecho, los resultados mostraron una elevada expresión de TICAM-1 en el grupo AR, lo que concuerda con el estudio de Xu et al.30.
La técnica mIF (inmunofluorescencia Multiplex) empleada en este estudio es un método de detección relativamente nuevo desarrollado en los últimos 20 años. Ofrece varias ventajas sobre las técnicas convencionales de inmunofluorescencia (IF), incluida una mayor especificidad, sensibilidad y rendimiento, junto con la capacidad de análisis visual. Esta técnica se basa en el método TSA (Tyramide Signal Amplification), que une covalentemente las señales fluorescentes a los antígenos y no se ve afectado por el calentamiento por microondas. Esto permite el marcaje multicolor de los tejidos a través de ciclos repetidos de tinción fluorescente TSA, seguidos de calentamiento por microondas para eliminar los anticuerpos mientras se conserva la señal fluorescente 17,31,32 (Figura 5). A continuación, se aplican algoritmos avanzados para la identificación y segmentación automáticas de las regiones del tejido diana que muestran estructuras específicas en imágenes multietiquetadas. Esto permite el análisis estadístico cuantitativo de las regiones de interés, lo que permite la evaluación cuantitativa de los fenotipos inmunitarios celulares y la localización funcional de las células inmunitarias. También proporciona información sobre el contexto tisular y la distribución espacial33,34.
Sin embargo, desde el punto de vista técnico, la fimIF sigue basándose en las técnicas tradicionales de FI y se enfrenta a retos como la reactividad cruzada de anticuerpos y la diafonía óptica. El uso de múltiples anticuerpos puede dar lugar a resultados de reactividad cruzada y falsos positivos, mientras que la superposición de espectros de fluorescencia puede dar lugar a la mezcla de señales de fluorescencia de múltiples objetivos, lo que dificulta la diferenciación a simple vista y aumenta la dependencia de algoritmos especializados de análisis de imágenes35. Además, como los colorantes fluorescentes se utilizan para marcar los anticuerpos, la mIF puede verse afectada por la extinción y el blanqueo de la fluorescencia, lo que provoca una disminución de la intensidad de la señal. En particular, mientras que las técnicas convencionales de FI evalúan todo el tejido, las técnicas de FIm se centran en regiones específicas de interés dentro de la sección de tejido para su análisis. Esto puede introducir desviaciones de la realidad debido a la heterogeneidad de los tejidos, lo que puede dar lugar a una cuantificación histológica inexacta o a la omisión de eventos raros.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo contó con el apoyo del Departamento Provincial de Ciencia y Tecnología de Sichuan (2021YJ0175).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Al(OH)3 | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A7130 | |
| 75% ethanol | Anhui Yiren An Co., Ltd | 20210107 | |
| Ammonia | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anhydrous ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Anti-fluorescence quenching sealer | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Automatic dyeing machine | Thermo scientific | Varistain Gemini ES | |
| Carrier slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Citrate-phosphate buffer | Servicebio biotechnology co., Ltd | G1201 | |
| Citric acid antigen repair solution (PH 6.0) | Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1201 | |
| Coverslip | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Coverslip | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | CS01-2450 | |
| CY3-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1223-50UL | |
| DAPI | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1012 | |
| Decoloring shaker | SCILOGEX | S1010E | |
| EDTA decalcification solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Electric heating blast dryer | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fast tissue dewatering machine | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Film sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| FITC-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1222-50UL | |
| Fluorescence microscope | Sunny Optical Technology Co.Ltd | CX40 | |
| Foxp3 | Affinity Biosciences Co., Ltd | bs-10211R | |
| Freezing table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Liankebio Co., Ltd | GAR0072 | |
| Goat serum | Biosharp | BL210A | |
| H&E staining kit | Leagene | DH0020 | |
| Hemostatic forceps | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J31010 | |
| Hydrochloric acid | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| Immunohistochemical pen | Biosharp | BC004 | |
| Microwave oven | Midea | M1-L213B | |
| Neutral gum | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Ovalbumin | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A804010 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Palm centrifuge | SCILOGEX | D1008E | |
| Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0099-100ml | |
| Pathology section scanner | 3DHISTECH Kft | Pannoramic SCAN | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Pipette | Dragon | KE0003087/KA0056573 | |
| Rorγt | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF3196 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B | Bioengineering Co., Ltd | A602008-0025 | |
| Slicer | Thermo scientific | HM325 | |
| Slicing machine | Thermo scientific | HM325 | |
| Slide | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | PC2-301 | |
| Sprague Dawley rats | Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine | SYX  2023-0100 |
|
| TICAM-1 | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF6289 | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J22120 | |
| Tissue spreading baking sheet machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| TYR-690 fluorescent dyes | Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd | RC0086-34RM | |
| Vortex mixer | SCILOGEX | SLK-O3000-S | |
| Water bath-slide drier | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Wax trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
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