Summary
Detta protokoll beskriver en flerfärgad immunofluorescensteknik för att utvärdera råttmodellen för allergisk rinit.
Abstract
Allergisk rinit (AR) är en kronisk, icke-infektiös inflammatorisk sjukdom i nässlemhinnan, främst medierad av specifikt immunglobulin E (IgE), som drabbar cirka 10-20 % av världens befolkning. Medan immunofluorescensfärgning (IF) länge har varit en standardteknik för att detektera sjukdomsspecifikt proteinuttryck, är konventionella IF-tekniker begränsade i sin förmåga att detektera uttrycksnivåerna av tre eller fler proteiner i samma prov. Följaktligen har flerfärgade IF-tekniker utvecklats under de senaste åren, vilket möjliggör samtidig märkning av flera mål i celler eller vävnader.
Detta protokoll ger en omfattande översikt över processen för att etablera en råttmodell av AR, erhålla nässlemhinneprover och de tekniska procedurerna för flerfärgad immunofluorescens. Alla råttor i AR-gruppen uppvisade typiska symtom som nysningar, rinnande näsa och kliande näsa, med beteendeobservationer som gav ≥5 poäng. Färgning av hematoxylin och eosin (H&E) avslöjade ökat antal inflammatoriska celler och störd nässlemhinneintegritet i AR-gruppen. Flerfärgad immunofluorescens (mIF) visade ökat uttryck av RORγt och TICAM-1, medan Foxp3-uttryck minskade i nässlemhinnevävnaden hos AR-råttor.
Introduction
Allergisk rinit (AR) är en kronisk, icke-infektiös inflammatorisk sjukdom i nässlemhinnan som främst medieras av specifikt immunglobulin E (IgE)1,2. Det kännetecknas av symtom som nysningar, rinnande näsa, nästäppa och klåda i näsan. Med industrialisering och urbanisering ökar förekomsten av AR gradvis, vilket påverkar cirka 10-20 % av världens befolkning1. Immunofluorescenstekniken (IF) är en fluorescerande färgningsmetod som använder en antikropps-antigenbindningsreaktion. Det kan användas för att detektera och kvantifiera fördelningen och uttrycksnivåerna av specifika proteiner i biologiska vävnader eller celler. Inom AR-forskning kan IF samtidigt upptäcka flera mål, inklusive AR-relaterade cytokiner, inflammatoriska celler, receptorer med mera, vilket underlättar utforskningen av AR-patogenes och effekterna av läkemedel 3,4,5,6.
Färgningsprocessen för flerfärgad immunofluorescens (mIF) liknar traditionell IF, med tillägg av ett antikroppselueringssteg under varje färgningsomgång. Denna modifiering möjliggör samtidig detektion av flera biomarkörer på samma vävnadssnitt genom sekventiell enkelmärkning och flera omgångar av omfärgning. mIF är baserad på tyramidsignalförstärkning (TSA), vilket möjliggör upprepade cykler av TSA-fluorescerande färgning och användning av mikrovågsuppvärmning för att avlägsna antikroppar samtidigt som fluorescerande signaler bibehålls 7,8. I jämförelse med konventionell IF erbjuder mIF flera fördelar: (1) den kan detektera svagt uttryckta antigener som är svåra att identifiera med konventionell IF 9,10; (2) det ger högkvalitativ färgning med ett förbättrat signal-brusförhållande; (3) Det gör det möjligt att kvantifiera vävnadsspecifika strukturer och regioner av intresse11. (4) multiplexering av flera vägar effektivt utnyttjar vävnader och bevarar begränsade patologiska resurser12; (5) Multiparameteranalys genom mIF ger djupare insikter i vävnader och avslöjar dold biologisk information13.
Sammantaget tillåter mIF observation av olika antigenuttryck och distributioner inom samma prov, vilket underlättar studier av målproteiner. I framtiden kommer forskare som vill förstå uttrycket och fördelningen av flera målproteiner att finna denna teknik som ett värdefullt val. Denna studie demonstrerar tillämpningen av mIF för färgning av nässlemhinneprover från råttor med AR och utvärderar etableringen av en råttmodell av AR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det experimentella protokollet och procedurerna har fått godkännande från den administrativa och djurforskningskommittén vid Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (diarienummer: 2022DL-010). Åtta veckor gamla hanråttor av typen Sprague Dawley (SD), som vägde 180–200 g, erhölls kommersiellt (se materialtabell) och hölls under en naturlig ljus/mörk cykel med kontrollerad temperatur (23 ± 2 °C) och relativ luftfuktighet (55 % ± 10 %). Tolv råttor delades slumpmässigt in i två grupper: kontrollgruppen och AR-gruppen. Alla råttor acklimatiserades till dessa förhållanden och fick fri tillgång till mat och vatten under en vecka före försöket.
1. Etablering av en råttmodell av AR
- Beredning av den sensibiliserande lösningen: suspendera 30 mg äggalbumin (OVA) och 3 g Al(OH)3 i 100 ml koksaltlösning (se materialförteckning)14,15.
- Grundläggande sensibilisering: ta tag i och håll den fullt vakna råttan med buken uppåt. Desinficera buken med 75 % alkoholindränkta bomullstussar. Använd en 1,5 ml spruta för att injicera 1 ml av den sensibiliserande lösningen som beretts i steg 1.1 i vänster bukhåla hos råttorna i AR-gruppen. Upprepa injektionen en gång varannan dag i 14 dagar (Figur 1A).
OBS: Se till att råttans huvud är placerat lägre än svansen för att förhindra skador på tjocktarmen och tunntarmen när du för in sprutan. Injektionsstället ligger 1,5 cm från den ventrala mittlinjen. Råttor i kontrollgruppen ska få intraperitoneala injektioner av 1 ml normal koksaltlösning en gång varannan dag i 14 dagar. - Nasal provokation: Administrera 50 μL 5 % OVA via näsdroppar med hjälp av en 100 μL pipett (Figur 1B) dagen efter basalsensibiliseringen, upprepa denna procedur i 7 dagar (Figur 1C).
OBS: Bered 5 % OVA-lösningen genom att blanda 5 g OVA med 100 ml saltlösning. För kontrollgruppen, administrera droppar av samma volym saltlösning.
2. Beteendemässig poängsättning av råttor
- Inom 30 minuter efter att ha slutfört den sista nasala provokationen, observera och spela in råttorna med hjälp av en digitalkamera för att identifiera symtom som näskliande, nysningar och rinnande näsa, baserat på poängkriterierna som anges i tabell 1 (figur 1D).
OBS: Bekräftelsen av framgångsrik AR-modellering baseras på att uppnå en totalpoäng på ≥5 poäng14.
3. Insamling av nässlemhinneprover
- Offra råttor: offra råttorna genom att utsätta dem för en överdos av CO2. Desinficera sedan råttorna med 75 % etanol (se materialförteckning). Använd en skalpell för att göra ett snitt längs de två mungiporna för att exponera muskelvävnaden (Figur 2A). Klipp sedan av lederna i det zygomatiska benet och underkäken på båda sidor av skallen med hjälp av en vävnadssax (Figur 2B) och ta bort underkäken (Figur 2C).
- Exponering för näshålan: separera huden på överkäken med hjälp av en hemostat (Figur 2D) för att exponera näshålan (Figur 2E). Klipp av den beniga förbindelsen mellan näshålan och överkäken med en vävnadssax (Figur 2F). Bryt sedan förbindelsen mellan näshålan och orbitalbenen på båda sidor vid infraorbitala foramen (Figur 2G) och ta bort näshålan (Figur 2H).
- Fixering: placera den extraherade näshålan i 4 % paraformaldehyd för fixering och förvara den i rumstemperatur i 24-72 timmar (se materialförteckning).
OBS: Se till att mängden paraformaldehydfixeringsmedel som används är tillräcklig för att helt täcka sektionerna för korrekt fixering.
4. Förbehandling av nässlemhinneprover
- Avkalkning: börja med att fixera de borttagna vävnaderna från steg 3.1. Tvätta dem tre gånger med PBS i 20 minuter vardera. Följ detta genom att tvätta dem tre gånger med destillerat vatten, varje gång i 20 minuter. Därefter avkalkas vävnaderna i en avkalkningslösning med en volym på 20-30 gånger vävnaderna vid rumstemperatur.
- Avkalkningslösningen (se materialtabell) bör hålla ett pH på 7,2-7,4. Placera slutligen den avkalkade vävnaden i en uttorkningslåda.
OBS: Avkalkningslösningen måste bytas varje vecka. Avkalkningsprocessen kan avslutas när vävnaden mjuknar (cirka 2 månader).
- Avkalkningslösningen (se materialtabell) bör hålla ett pH på 7,2-7,4. Placera slutligen den avkalkade vävnaden i en uttorkningslåda.
- Uttorkning och vaxning: överför uttorkningslådan till en dehydrator (se materialförteckning). Börja med 75 % alkohol i 4 timmar, följt av 85 % alkohol i 2 timmar, 90 % alkohol i 2 timmar och 95 % alkohol i 1 timme.
- Sänk sedan ner vävnaden i vattenfri etanol i 30 minuter, upprepa processen i ytterligare 30 minuter, använd xylen i 5-10 minuter, upprepa detta steg i ytterligare 5-10 minuter, sänk ner vävnaden i vax i 1 timme, upprepa detta steg i ytterligare en timme och sänk slutligen ner vävnaden i vax i ytterligare 1 timme.
- Inbäddning: placera det smälta vaxblocket i inbäddningslådan (se Materialförteckning) och förvara det i en -20 °C frys. När vaxet stelnar, ta bort det och trimma vaxblocket.
- Skivning: sätt in det trimmade vaxblocket i en paraffinmikrotom (se materialtabell) och skär det i skivor med en tjocklek på 3 μm. Lägg skivorna i ett 40 °C vattenbad på en objektspridare. Platta till servetten, lyft den sedan med en glasskiva och grädda den i en 60 °C ugn.
- När vattnet har avdunstat och vaxet har stelnat ordentligt, ta bort objektglasen och förvara dem vid en temperatur på 25 °C.
5. H&E-färgning av nässlemhinnevävnad
- Avvaxning och hydrering: lägg skivorna i xylen i 20 minuter, upprepa processen i ytterligare 20 minuter, absolut etanol i 5 minuter, upprepa detta steg i ytterligare 5 minuter, 75 % alkohol i 5 minuter och tvätta slutligen i 5 minuter.
- Hematoxylinfärgning: dispensera 100 μL hematoxylinfärgningslösning (se materialtabell) i 3-5 minuter med en 100 μL pipett, skölj i 5-10 s, tillsätt 100 μL 0,5% saltsyraetanol i 10-30 s, skölj i 5-10 s, tillsätt 100 μL 0,2 % ammoniakvatten i 10-30 s och skölj i 30 s.
OBS: Efter hematoxylinfärgning är differentiering med 0,5 % saltsyraetanol nödvändig för att avlägsna överskott av hematoxylinfärgämne bundet till kärnan och absorberat av cytoplasman. När eosinfärgning utförs kommer kärnorna och cytoplasman att vara tydligt färgade. Skivorna kommer att se röda eller rosa ut efter differentiering med 0,5 % saltsyraetanol, så skölj omedelbart efter differentiering för att ta bort syran från vävnadsskivorna för att stoppa differentieringen. Använd sedan 0,2 % ammoniakvatten för att förbättra kärnfärgningen. - Eosinfärgning: använd en 100 μL pipett för att dosera 100 μL eosinfärgningslösning (se Materialtabell) i 5 minuter och skölj i 30 s.
- Torkning och försegling: sänk ner skivorna i absolut etanol i 5 minuter, upprepa processen i ytterligare 5 minuter, upprepa en gång till i 5 minuter, dimetyl i 5 minuter och xylen i 5 minuter. Försegla slutligen med neutralt harts (se materialförteckning).
- Placera den färgade delen på mikroskopet: placera den färgade delen på mikroskopet, justera mikroskopets fokus tills bilden är tydligt synlig, ställ in förstoringen på 40x och ta bilden.
6. Flerfärgad immunfärgning av nässlemhinnevävnad
- Avvaxning och återfuktning: följ samma som nämns i steg 5.1.
- Behandling med citratfosfatbuffert: placera citratfosfatbufferten (pH 6.0) (se materialförteckning) i en mikrovågssäker behållare. Värm den tills den kokar, ta bort den och lägg sedan objektglasen i behållaren. Mikrovågsugn på medelvärme i 8 minuter tills det kokar, stäng av värmen i 8 minuter och växla sedan till medel-låg värme i 7 minuter.
- Efter naturlig kylning, överför skivorna till PBS (pH 7.4), skaka och tvätta dem tre gånger med en avfärgningsshaker, varje gång i 5 minuter.
OBS: Se till att bufferten inte avdunstar under denna process och förhindra att skivorna torkar ut.
- Efter naturlig kylning, överför skivorna till PBS (pH 7.4), skaka och tvätta dem tre gånger med en avfärgningsshaker, varje gång i 5 minuter.
- Blockering av endogent peroxidas: torka skivorna, rita en cirkel runt vävnaden med en immunhistokemisk penna (för att förhindra att antikroppen rinner iväg) och applicera 3 % väteperoxidlösning (väteperoxid: rent vatten = 1:9).
- Inkubera i rumstemperatur i mörker i 15 min. Efter naturlig kylning, lägg skivorna i PBS (pH 7.4) och skaka dem på en avfärgningsshaker i tre cykler på 5 minuter vardera.
- Blockering: Applicera 5 % getserum i cirkeln och inkubera i 30 minuter.
- Primär antikroppstillsats: avlägsna försiktigt den blockerande lösningen, tillsätt FOXP3 (spädning: 1:200, se materialtabell) till skivan och placera den i en fuktig kammare. Inkubera vid 4 °C över natten.
OBS: Tillsätt en liten mängd vatten i den fuktiga kammaren för att förhindra avdunstning av antikroppar. - Tillsats av sekundära antikroppar: lägg skivorna i PBS (pH 7,4) och skaka dem i en avfärgningsshaker i tre cykler om 5 minuter vardera. Torka försiktigt skivorna och applicera den sekundära antikroppen (Goat Anti-Rabbit IgG H&L, se materialtabell) i cirkeln. Inkubera i rumstemperatur i 50 minuter i mörker.
- Beredning av tyramidspädningslösning: kombinera 100 μl 3% H 2 O2med 100 ml 1x TBST (se materialtabell).
- Tillsats av TSA-arbetslösning: Blanda 1 ml tyramidspädningsvätska med 2 μl CY3-tyramidlösning för att bereda TSA-arbetslösningen. Applicera 100 μl TSA-arbetslösning på varje skiva och inkubera i rumstemperatur i mörker i 10 minuter. Tvätta sedan skivorna med PBS tre gånger, 5 min varje gång.
OBS: Förbered och använd TSA-arbetslösningen omedelbart och förvara den vid 4 °C i mörker; Den är giltig i upp till 24 timmar. - Upprepa steg 6.2-6.8: byt till en 1:200 utspädning av RORγt (FITC fluorescerande färgämne) och sedan till en 1:200 utspädning av TICAM1 (TYP620 färgämne) (se materialförteckning).
- DAPI motfärgade kärnor: skaka skivorna försiktigt för att torka dem, applicera DAPI-färgningslösning och inkubera i rumstemperatur i 10 minuter i mörker.
- Släckande autofluorescens: placera skivorna i PBS (pH 7,4) och skaka dem på en avfärgningsshaker i tre cykler på 5 minuter vardera. Applicera autofluorescenssläckaren (se materialtabell) på skivorna, vänta i 5 minuter och tvätta sedan i 10 minuter.
- Blockering: lägg skivorna i PBS (pH 7.4) och skaka dem på en avfärgningsshaker i tre cykler på 5 minuter vardera. Skaka skivorna försiktigt för att torka dem och försegla dem med antifluorescenssläckaren (se materialförteckning).
- Mikroskopi: placera den färgade delen på mikroskopet, justera mikroskopets fokus för tydlig synlighet, ställ in förstoringen på 20x och 40x och ta bilden.
OBS: DAPI har en UV-excitationsvåglängd på 330-380 nm och en emissionsvåglängd på 420 nm (blått ljus). FITC har en excitationsvåglängd på 465-495 nm och en emissionsvåglängd på 515-555 nm (grönt ljus). CY3 har en excitationsvåglängd på 510-560 nm och en emissionsvåglängd på 590 nm (rött ljus). TYP-690 har en excitationsvåglängd på 630 nm och en emissionsvåglängd på 690 nm (rosa ljus).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sex SD-råttor inducerades framgångsrikt in i AR-modellen genom intraperitoneal injektion av OVA och nasal provokation. AR inducerades hos alla råttor i AR-gruppen, vilket stod för 100 % av gruppen. Alla råttor i AR-gruppen uppvisade typiska symtom som nysningar, rinnande näsa och kliande näsa. Alla beteendeobservationer fick ≥5 poäng (Tabell 2).
H&E-färgningsresultat på den 21:a dagen av modellering avslöjade att hos kontrollråttorna var nässlemhinnans epitelceller och flimmerhår välordnade, utan tecken på inflammatorisk cellinfiltration. Omvänt, i AR-gruppen, var nässkiljeväggens slemhinna skadad och lossnade, med anmärkningsvärd neutrofilinfiltration (Figur 3).
Vid jämförelse av nässlemhinnevävnaden hos AR-råttor med kontrollgruppen observerades att uttrycket av RORγt (en Th17-cellspecifik transkriptionsfaktor) och TICAM-1 (Toll-like receptor linker molecule-1) ökade, medan Foxp3 (en Treg-cellspecifik transkriptionsfaktor) minskade (Figur 4).
Figur 1: Det experimentella arbetsflödet . (A) Schematisk bild av intraperitoneal injektion. (B) Schematisk bild av näsdropp. (C) Flödesschema över modellering av råttor med allergisk rinit. (D) Schematiskt diagram över beteendeobservation. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Process för att ta bort näsan . (A) Skärning av muskelvävnaden i mungiporna. (B) Skärning av förbindelsen mellan kindbenet och underkäken. C) Underkäkens avskiljning. D) Avlägsnande av överkäkens hud. (E) Exponera näshålan. (F) Klippa av anslutningen mellan näshålan och överkäken. (G) Skärning av förbindelsen mellan näshålan och orbitalbenet. (H) Den borttagna näshålan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa histopatologiska H&E-färgningsbilder på dag 14 efter AR-modellering (n = 6). (A) Epitelcellerna och flimmerhåren i nässlemhinnan hos kontrollråttorna var väl arrangerade och ingen inflammatorisk cellinfiltration observerades. (B) Slemhinnan i nässkiljeväggen i AR-gruppen skadades och lossnade vid neutrofilinfiltration. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: MIF-färgningsanalys av RORγt, Foxp3 och TICAM-1 (n = 6). Jämfört med kontrollgruppen var uttrycket av RORγt och TICAM-1 i nässlemhinnans vävnader hos råttor i AR-gruppen förhöjt, medan uttrycket av Foxp3 var förhöjt. Skalstaplar = 100 μm (vänster paneler); 50 μm (höger paneler). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Principen för mIF-teknik. mIF-tekniken är baserad på TSA-tekniken, som innebär att den fluorescerande signalen binds kovalent till antigenet. I denna process katalyserar pepparrotsperoxidas märkt på den sekundära antikroppen övergången av fluoresceinsubstratet från ett inaktivt till ett aktiverat tillstånd. Detta aktiverade tillstånd kan kovalent binda till tyrosinet på antigenet, vilket resulterar i en stabil kovalent bindning av fluorescein till provet. Därefter avlägsnas icke-kovalent bundna antikroppar genom termisk reparation. Proceduren upprepas sedan med ytterligare primära antikroppar, sekundära antikroppar och fluorescein för att möjliggöra detektion av ett helt annat antigen. Denna bild ritades om och färgmatchades med hänvisning till det schematiska mIF-diagrammet17. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Noter | Frekvens av nysningar | Rinorré | Gnuggning av näsan |
| 1 | <3 | vattnig flytning i näshålan | Lätta och tillfälliga gnuggningar på näsan |
| 2 | 4~10 | vattnig flytning som rinner ut ur den främre naris | upprepade gnuggningar av näsan |
| 3 | ≥11 | ansiktet täckt med rikligt med vattniga flytningar | gnugga från näsa till ansikte |
Tabell 1: Kvantitativ tabell över beteendetest på råttor.
| Individer | Dag 1 | Dag 21 |
| Kontroll 1 | 0 | 0 |
| Kontroll 2 | 0 | 0 |
| Kontroll 3 | 0 | 0 |
| Kontroll 4 | 0 | 0 |
| Kontroll 5 | 0 | 0 |
| Kontroll 6 | 0 | 0 |
| AR 1 | 0 | 7 |
| AR 2 | 0 | 6 |
| AR 3 | 0 | 5 |
| AR 4 | 0 | 5 |
| AR 5 | 0 | 5 |
| AR 6 | 0 | 6 |
Tabell 2: Resultat av beteendemässig poängsättning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Allergisk rinit (AR) är en icke-infektiös inflammatorisk sjukdom i nässlemhinnan som beror på en kombination av miljömässiga och genetiska faktorer. Det har blivit ett globalt hälsoproblem som påverkar arbetseffektiviteten, minskar livskvaliteten, försämrar sömnen, den kognitiva funktionen och orsakar irritabilitet och trötthet. Invasiv import påverkar 10–20 % av världens befolkning¹ och medför betydande ekonomiska kostnader, vilket orsakar årliga förluster på upp till 30–50 miljarder euro i EU-länderna18. Dessutom har flera studier fastställt ett starkt samband mellan AR och astma18,19,20, där individer med AR löper sju gånger större risk att utveckla astma än de utan AR 21. Aktuell forskning tyder på att en obalans mellan typ 1-hjälpar-T-celler (Th1) och typ 2-hjälpar-T-celler (Th2) med en bias mot Th2-celler är en betydande bidragande orsak till AR. Th2-celler, stimulerade av interleukin-4, producerar Th2-liknande cytokiner såsom IL-5 och IL-13, vilket utlöser inflammation i B-lymfocyter, mastceller, eosinofiler och dendritiska celler22. Dessutom tyder ny AR-forskning på ett starkt samband mellan en obalans i hjälpar-Th17/regulatoriska T-cellspopulationer (Treg)23. Th17- och Treg-celler, som båda härstammar från CD4+ T-celler, spelar avgörande roller i immunsystemet. RORγt är avgörande för Th17-celldifferentiering24, medan Treg-celler, med immunsuppressiva funktioner, är nyckeln till att upprätthålla immuntoleransen. Förändringar i uttrycket av Foxp3 påverkar Treg-cellens funktion25,26. Således återspeglar förändringar i RORγt- och Foxp3-nivåer Th17/Treg-obalanser, vilket potentiellt inducerar ett inflammatoriskt svar som främst drivs av Th17-celler27. Toll-like receptors (TLR) är viktiga proteiner i kroppens medfödda immunsystem, som förmedlar intracellulära signalvägar för att aktivera specifikt genuttryck28. Forskning av He Shan et al.29 fann att variationer i TLR4-genen, särskilt CT-heterozygota och TT-rena mutationer på rs10759930-lokus, var associerade med AR-utveckling. Med tanke på TICAM-1:s roll som den överbryggande molekylen mellan TLR3 och TLR4 antogs det att AR kunde vara kopplat till TICAM-1. Faktum är att resultaten visade ett förhöjt TICAM-1-uttryck i AR-gruppen, vilket överensstämmer med Xu et al.'s studie30.
MiF-tekniken (Multiplex immunofluorescence) som används i denna studie är en relativt ny detektionsmetod som utvecklats under de senaste 20 åren. Det erbjuder flera fördelar jämfört med konventionella immunofluorescenstekniker (IF), inklusive ökad specificitet, känslighet och genomströmning, tillsammans med förmågan till visuell analys. Denna teknik är baserad på TSA-metoden (Tyramide Signal Amplification), som kovalent binder fluorescerande signaler till antigener och förblir opåverkad av mikrovågsuppvärmning. Detta möjliggör flerfärgsmärkning av vävnader genom upprepade cykler av fluorescerande TSA-färgning, följt av mikrovågsuppvärmning för att avlägsna antikroppar samtidigt som den fluorescerande signalen 17,31,32 bibehålls (figur 5). Avancerade algoritmer används sedan för automatisk identifiering och segmentering av målvävnadsregioner som visar specifika strukturer i multimärkta bilder. Detta möjliggör kvantitativ statistisk analys av intressanta regioner, vilket möjliggör kvantitativ bedömning av cellulära immunfenotyper och funktionell lokalisering av immunceller. Den ger också information om vävnadskontext och rumslig fördelning33,34.
Tekniskt sett förlitar sig dock mIF fortfarande på traditionella IF-tekniker och står inför utmaningar som korsreaktivitet av antikroppar och optisk överhörning. Användningen av flera antikroppar kan leda till korsreaktivitet och falskt positiva resultat, medan överlappande fluorescensspektra kan leda till att fluorescenssignaler från flera mål blandas, vilket gör differentiering med blotta ögat utmanande och ökar beroendet av specialiserade bildanalysalgoritmer35. Dessutom, eftersom fluorescerande färgämnen används för att märka antikroppar, kan mIF påverkas av fluorescenskylning och blekning, vilket leder till minskad signalintensitet. Medan konventionella IF-tekniker utvärderar hela vävnaden, fokuserar mIF-tekniker på specifika regioner av intresse inom vävnadssektionen för analys. Detta kan leda till avvikelser från verkligheten på grund av vävnadsheterogenitet, vilket kan leda till felaktig histologisk kvantifiering eller utelämnande av sällsynta händelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Sichuanprovinsens avdelning för vetenskap och teknik (2021YJ0175).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Al(OH)3 | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A7130 | |
| 75% ethanol | Anhui Yiren An Co., Ltd | 20210107 | |
| Ammonia | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anhydrous ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Anti-fluorescence quenching sealer | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Automatic dyeing machine | Thermo scientific | Varistain Gemini ES | |
| Carrier slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Citrate-phosphate buffer | Servicebio biotechnology co., Ltd | G1201 | |
| Citric acid antigen repair solution (PH 6.0) | Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1201 | |
| Coverslip | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Coverslip | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | CS01-2450 | |
| CY3-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1223-50UL | |
| DAPI | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1012 | |
| Decoloring shaker | SCILOGEX | S1010E | |
| EDTA decalcification solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Electric heating blast dryer | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fast tissue dewatering machine | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Film sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| FITC-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1222-50UL | |
| Fluorescence microscope | Sunny Optical Technology Co.Ltd | CX40 | |
| Foxp3 | Affinity Biosciences Co., Ltd | bs-10211R | |
| Freezing table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Liankebio Co., Ltd | GAR0072 | |
| Goat serum | Biosharp | BL210A | |
| H&E staining kit | Leagene | DH0020 | |
| Hemostatic forceps | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J31010 | |
| Hydrochloric acid | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| Immunohistochemical pen | Biosharp | BC004 | |
| Microwave oven | Midea | M1-L213B | |
| Neutral gum | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Ovalbumin | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A804010 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Palm centrifuge | SCILOGEX | D1008E | |
| Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0099-100ml | |
| Pathology section scanner | 3DHISTECH Kft | Pannoramic SCAN | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Pipette | Dragon | KE0003087/KA0056573 | |
| Rorγt | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF3196 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B | Bioengineering Co., Ltd | A602008-0025 | |
| Slicer | Thermo scientific | HM325 | |
| Slicing machine | Thermo scientific | HM325 | |
| Slide | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | PC2-301 | |
| Sprague Dawley rats | Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine | SYX  2023-0100 |
|
| TICAM-1 | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF6289 | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J22120 | |
| Tissue spreading baking sheet machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| TYR-690 fluorescent dyes | Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd | RC0086-34RM | |
| Vortex mixer | SCILOGEX | SLK-O3000-S | |
| Water bath-slide drier | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Wax trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Brożek, J. L., et al. Allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) Guidelines-2016 revision. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 950-958 (2017).
- Maurer, M., Zuberbier, T. Undertreatment of rhinitis symptoms in Europe: findings from a cross-sectional questionnaire survey. Allergy. 62 (9), 1057-1063 (2007).
- Ding, Y., et al. Alpha-linolenic acid improves nasal mucosa epithelial barrier function in allergic rhinitis by arresting CD4+ T cell differentiation via IL-4Rα-JAK2-STAT3 pathway. Phytomedicine: International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology. 116, 154825 (2023).
- Zhou, H., et al. Activation of NLRP3 inflammasome contributes to the inflammatory response to allergic rhinitis via macrophage pyroptosis. International Immunopharmacology. 110, 109012 (2022).
- Watts, A. M., Cripps, A. W., West, N. P., Cox, A. J. Modulation of allergic inflammation in the nasal mucosa of allergic rhinitis sufferers with topical pharmaceutical agents. Frontiers in pharmacology. 10, 294 (2019).
- Patel, N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy & Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1(+)CD8(+) T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoua, C., et al. PD-1-ex pressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Fedchenko, N., Reifenrath, J. Different approaches for interpretation and reporting of immunohistochemistry analysis results in the bone tissue - a review. Diagnostic Pathology. 9, 221 (2014).
- Faget, L., Hnasko, T. S. Tyramide signal amplification for immunofluorescent enhancement. Methods in Molecular Biology. 1318, 161-172 (2015).
- Parra, E. R., Villalobos, P., Rodriguez-Canales, J. The multiple faces of programmed cell death ligand 1 expression in malignant and nonmalignant cells. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology.: AIMM. 27 (4), 287-294 (2019).
- Welsh, A. W., et al. Standardization of estrogen receptor measurement in breast cancer suggests false-negative results are a function of threshold intensity rather than percentage of positive cells. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 29 (22), 2978-2984 (2011).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Miao, M., Xiang, L., Miao, Y. Specification for preparation of allergic rhinitis animal model (draft). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 49 (1), 50-57 (2018).
- Xu, J., et al. Astragalus polysaccharides attenuate ovalbumin-induced allergic rhinitis in rats by inhibiting nlrp3 inflammasome activation and nod2-mediated nf- κ b activation. Journal of Medicinal Food. 24 (1), 1-9 (2021).
- Bousquet, J., et al.
- Free Thinking. Multiplex fluorescence immunohistochemistry. , http://www.freethinking.com.cn/?xinwendongtai/156.html (2023).
- Huang, C., et al. Expression of activated signal transducer and activator of transcription-3 as a predictive and prognostic marker in advanced esophageal squamous cell carcinoma. World Journal of Surgical Oncology. 13, 314 (2015).
- Leynaert, B., Bousquet, J., Neukirch, C., Liard, R., Neukirch, F. Perennial rhinitis: An independent risk factor for asthma in nonatopic subjects: results from the European Community Respiratory Health Survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 104 (2), 301-304 (1999).
- Guerra, S., et al. Rhinitis is an independent risk factor for developing cough apart from colds among adults. Allergy. 60 (3), 343-349 (2005).
- Greisner, W. A., Settipane, R. J., Settipane, G. A. Co-existence of asthma and allergic rhinitis: a 23-year follow-up study of college students. Allergy and Asthma Proceedings. 19 (4), 185-188 (1998).
- Pawankar, R., Mori, S., Ozu, C., Kimura, S. Overview on the pathomechanisms of allergic rhinitis. Asia Pacific Allergy. 1 (3), 157-167 (2011).
- Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of α-lipoic acid via balancing th17/treg expression and enhancing nrf2/ho-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor rorγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Zhou, X., et al. Instability of the transcription factor Foxp3 leads to the generation of pathogenic memory T cells in Vivo. Nature Immunology. 10 (9), 1000-1007 (2009).
- Ziegler, S. F., Buckner, J. H. Foxp3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation. Microbes and Infection. 11 (5), 594-598 (2009).
- Yaling, Y., Gui, Y., Shuqi, Q. Recent research advances of toll-like receptors and allergic rhinitis. Medical Recapitulate. 23 (7), 1273-1276 (2017).
- Shan, H., Jie, C. Correlation between TLR4 gene polymorphisms and allergic rhinitis. Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 31 (13), 991-994 (2017).
- Xu, O., et al. Immunoregulatory mechanism of Treg cells and TICAM-1 patients with severe allergic rhinitis. Chinese Journal of Coal Industry Medicine. 23 (3), 303-306 (2020).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoual, C., et al. PD-1 expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in hpv-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Gustavson, M. D., et al. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using automated quantitative analysis. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).
- Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).
- Hernandez, S., et al. Multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification for immune cell profiling of paraffin-embedded tumor tissues. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 667067 (2021).
