Summary
Bu protokol, alerjik rinitin sıçan modelini değerlendirmek için çok renkli bir immünofloresan tekniğini açıklar.
Abstract
Allerjik rinit (AR), dünya nüfusunun yaklaşık %10-20'sini etkileyen, primer olarak spesifik immünoglobulin E (IgE) aracılık eden, burun mukozasının kronik, enfeksiyöz olmayan inflamatuar bir hastalığıdır. İmmünofloresan (IF) boyama, hastalığa özgü protein ekspresyonunu tespit etmek için uzun süredir standart bir teknik olsa da, geleneksel IF teknikleri, aynı numunedeki üç veya daha fazla proteinin ekspresyon seviyelerini tespit etme yeteneklerinde sınırlıdır. Sonuç olarak, son yıllarda, hücrelerde veya dokularda birden fazla hedefin aynı anda etiketlenmesine izin veren çok renkli IF teknikleri geliştirilmiştir.
Bu protokol, bir AR sıçan modeli oluşturma, nazal mukozal örneklerin alınması ve çok renkli immünofloresan için teknik prosedürler için kapsamlı bir genel bakış sağlar. AR grubundaki tüm sıçanlar hapşırma, burun akıntısı ve burun kaşıntısı gibi tipik semptomlar sergiledi ve davranışsal gözlemler ≥5 puan aldı. Hematoksilen ve eozin (H&E) boyama, AR grubunda artmış inflamatuar hücre sayısı ve bozulmuş nazal mukozal bütünlük ortaya çıkardı. Çok renkli immünofloresan (mIF), RORγt ve TICAM-1 ekspresyonunun arttığını gösterirken, AR sıçanlarının burun mukoza dokusunda Foxp3 ekspresyonu azaldı.
Introduction
Allerjik rinit (AR), primer olarak spesifik immünoglobulin E (IgE)1,2'nin aracılık ettiği burun mukozasının kronik, enfeksiyöz olmayan inflamatuar bir hastalığıdır. Hapşırma, burun akıntısı, burun tıkanıklığı ve burun kaşıntısı gibi semptomlarla karakterizedir. Sanayileşme ve kentleşme ile birlikte, AR prevalansı giderek artmakta ve dünya nüfusunun yaklaşık %10-20'sini etkilemektedir1. İmmünofloresan (IF) tekniği, bir antikor-antijen bağlanma reaksiyonu kullanan bir floresan boyama yöntemidir. Biyolojik dokularda veya hücrelerde spesifik proteinlerin dağılımını ve ekspresyon seviyelerini tespit etmek ve ölçmek için kullanılabilir. AR araştırmasında IF, AR ile ilişkili sitokinler, inflamatuar hücreler, reseptörler ve daha fazlası dahil olmak üzere birden fazla hedefi aynı anda tespit edebilir ve AR patogenezinin ve ilaçların etkilerininaraştırılmasını kolaylaştırır 3,4,5,6.
Çok renkli immünofloresan (mIF) boyama işlemi, her boyama turu sırasında bir antikor elüsyon adımının eklenmesiyle geleneksel IF'ye çok benzer. Bu modifikasyon, sıralı tek etiketleme ve çoklu yeniden boyama turları yoluyla aynı doku kesitinde birden fazla biyobelirteçin aynı anda saptanmasını sağlar. mIF, tiramid sinyal amplifikasyonuna (TSA) dayanır ve tekrarlanan TSA floresan boyama döngülerine ve floresan sinyallerinikorurken antikorları uzaklaştırmak için mikrodalga ısıtmanın kullanılmasına izin verir 7,8. Konvansiyonel IF ile karşılaştırıldığında, mIF çeşitli avantajlar sunar: (1) konvansiyonel IF 9,10 ile tanımlanması zor olan zayıf eksprese edilmiş antijenleri tespit edebilir; (2) geliştirilmiş sinyal-gürültü oranı ile yüksek kaliteli boyama sağlar; (3) dokuya özgü yapıların ve ilgilenilen bölgelerin nicelleştirilmesine izin verir11; (4) çoklu yolakların çoğullanması, dokuları verimli bir şekilde kullanır ve sınırlı patolojik kaynakları korur12; (5) mIF aracılığıyla çok parametreli analiz, gizli biyolojik bilgileri ortaya çıkararak dokular hakkında daha derin bilgiler sunar13.
Genel olarak, mIF, aynı numune içinde farklı antijen ekspresyonlarının ve dağılımlarının gözlemlenmesine izin vererek hedef proteinlerin incelenmesini kolaylaştırır. Gelecekte, çoklu hedef proteinlerin ekspresyonunu ve dağılımını anlamak isteyen araştırmacılar bu tekniği değerli bir seçim olarak göreceklerdir. Bu çalışma, sıçanlardan alınan nazal mukoza örneklerinin AR ile boyanması için mIF'nin uygulanmasını göstermekte ve bir AR sıçan modelinin oluşturulmasını değerlendirmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deneysel protokol ve prosedürler, Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi İdari ve Hayvan Araştırma Komitesi'nden onay almıştır (Kayıt numarası: 2022DL-010). 180-200 g ağırlığındaki sekiz haftalık erkek Sprague Dawley (SD) sıçanları ticari olarak elde edildi (Malzeme Tablosuna bakınız) ve kontrollü sıcaklık (23 ± 2 °C) ve bağıl nem (%55 ± %10) ile doğal bir aydınlık/karanlık döngüsü altında barındırıldı. On iki sıçan rastgele iki gruba ayrıldı: kontrol grubu ve AR grubu. Tüm sıçanlar bu koşullara alıştırıldı ve denemeden önce bir hafta boyunca yiyecek ve suya ücretsiz erişim sağlandı.
1. AR'nin sıçan modelinin kurulması
- Hassaslaştırıcı çözeltinin hazırlanması: 30 mg ovalbümin (OVA) ve 3 g Al(OH)3 100 mL salin içinde süspanse edin (bkz. Malzeme Tablosu)14,15.
- Temel duyarlılık: Tamamen uyanık sıçanı karnı yukarı bakacak şekilde kavrayın ve tutun. % 75 alkole batırılmış pamuk topları kullanarak karnı dezenfekte edin. Adım 1.1'de hazırlanan hassaslaştırıcı solüsyonun 1.5 mL'sini AR grubundaki sıçanların sol karın boşluğuna enjekte etmek için 1.5 mL'lik bir şırınga kullanın. Bu enjeksiyonu 14 gün boyunca iki günde bir tekrarlayın (Şekil 1A).
NOT: Şırıngayı yerleştirirken kalın ve ince bağırsaklara zarar vermemek için sıçanın kafasının kuyruğundan daha aşağıda olduğundan emin olun. Enjeksiyon bölgesi ventral orta hattan 1,5 cm uzaktadır. Kontrol grubundaki sıçanlar, 14 gün boyunca iki günde bir 1 mL normal salin intraperitoneal enjeksiyonu almalıdır. - Nazal zorluk: Bazal duyarlılığı takip eden gün 100 μL'lik bir pipet (Şekil 1B) kullanarak burun damlaları yoluyla 50 μL% 5 OVA uygulayın ve bu prosedürü 7 gün boyunca tekrarlayın (Şekil 1C).
NOT: 5 g OVA'yı 100 mL salin ile karıştırarak %5 OVA çözeltisini hazırlayın. Kontrol grubu için, aynı hacimde salin damlaları uygulayın.
2. Sıçanların davranışsal puanlaması
- Son burun zorluğunu tamamladıktan sonraki 30 dakika içinde, Tablo 1'de belirtilen puanlama kriterlerine göre burun kaşıma, hapşırma ve burun akıntısı gibi semptomları tanımlamak için bir dijital kamera kullanarak sıçanları gözlemleyin ve kaydedin (Şekil 1D).
NOT: Başarılı AR modellemesinin teyidi, toplam ≥5 puan14 elde edilmesine dayanmaktadır.
3. Burun mukozası örneklerinin alınması
- Sıçanları kurban etmek: Sıçanları aşırı dozdaCO2'ye maruz bırakarak kurban edin. Daha sonra, sıçanları% 75 etanol ile dezenfekte edin (Malzeme Tablosuna bakınız). Kas dokusunu ortaya çıkarmak için ağzın iki köşesi boyunca bir kesi yapmak için bir neşter kullanın (Şekil 2A). Daha sonra, doku makası kullanarak kafatasının her iki tarafındaki elmacık kemiğinin ve mandibulanın eklemlerini kesin (Şekil 2B) ve mandibulayı çıkarın (Şekil 2C).
- Burun boşluğuna maruz kalma: burun boşluğunu ortaya çıkarmak için bir hemostat (Şekil 2D) kullanarak maksillanın derisini ayırın (Şekil 2E). Burun boşluğu ile maksilla arasındaki kemik bağlantısını doku makası ile kesin (Şekil 2F). Daha sonra, infraorbital foramende burun boşluğu ile her iki taraftaki orbital kemikler arasındaki bağlantıyı kesin (Şekil 2G) ve burun boşluğunu çıkarın (Şekil 2H).
- Fiksasyon: Çıkarılan burun boşluğunu fiksasyon için% 4 paraformaldehit içine yerleştirin ve 24-72 saat oda sıcaklığında saklayın (bkz.
NOT: Kullanılan paraformaldehit fiksatif miktarının, uygun fiksasyon için bölümleri tamamen kaplamaya yeterli olduğundan emin olun.
4. Burun mukozası örneklerinin ön işleme tabi tutulması
- Dekalsifikasyon: 3.1. adımdan çıkarılan dokuları sabitleyerek başlayın. Her biri 20 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın. Bunu, her seferinde 20 dakika boyunca damıtılmış suyla üç kez yıkayarak takip edin. Daha sonra, dokuları oda sıcaklığında dokuların 20-30 katı hacme sahip bir dekalsifikasyon solüsyonunda kireçten arındırın.
- Dekalsifikasyon çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) pH'ı 7.2-7.4 arasında tutmalıdır. Son olarak, kireçten arındırılmış dokuyu bir dehidrasyon kutusuna yerleştirin.
NOT: Kireç çözücü solüsyonun haftalık olarak değiştirilmesi gerekir. Dekalsifikasyon işlemi, doku yumuşadığında (yaklaşık 2 ay) sonuçlandırılabilir.
- Dekalsifikasyon çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) pH'ı 7.2-7.4 arasında tutmalıdır. Son olarak, kireçten arındırılmış dokuyu bir dehidrasyon kutusuna yerleştirin.
- Dehidrasyon ve ağda: dehidrasyon kutusunu bir kurutucuya aktarın (bkz. 4 saat boyunca %75 alkolle başlayın, ardından 2 saat boyunca %85 alkol, 2 saat boyunca %90 alkol ve 1 saat boyunca %95 alkol ile başlayın.
- Daha sonra, dokuyu 30 dakika susuz etanole batırın, işlemi 30 dakika daha tekrarlayın, 5-10 dakika ksilen kullanın, bu adımı 5-10 dakika daha tekrarlayın, dokuyu 1 saat balmumuna batırın, bu adımı bir saat daha tekrarlayın ve son olarak dokuyu 1 saat daha balmumuna batırın.
- Gömme: Erimiş balmumu bloğunu gömme kutusuna yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve -20 °C'lik bir dondurucuda saklayın. Balmumu katılaştığında, çıkarın ve balmumu bloğunu kesin.
- Dilimleme: Kesilmiş balmumu bloğunu bir parafin mikrotomuna yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın) ve 3 μm kalınlığında dilimler halinde kesin. Dilimleri bir slayt yayıcı üzerinde 40 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Dokuyu düzleştirin, ardından bir cam sürgü ile kaldırın ve 60 °C fırında pişirin.
- Su buharlaştıktan ve balmumu uygun şekilde ayarlandıktan sonra, slaytları çıkarın ve 25 °C sıcaklıkta saklayın.
5. Nazal mukozal dokunun H & E boyaması
- Mum alma ve hidrasyon: dilimleri 20 dakika ksilene koyun, işlemi 20 dakika daha, 5 dakika mutlak etanol tekrarlayın, bu adımı 5 dakika daha tekrarlayın, 5 dakika boyunca %75 alkol ve son olarak 5 dakika yıkayın.
- Hematoksilen boyama: 100 μL'lik bir pipet kullanarak 3-5 dakika boyunca 100 μL hematoksilen boyama solüsyonu ( Malzeme Tablosuna bakınız) dağıtın, 5-10 saniye durulayın, 10-30 saniye boyunca 100 μL %0.5 hidroklorik asit etanol ekleyin, 5-10 saniye durulayın, 10-30 saniye boyunca 100 μL %0.2 amonyak suyu ekleyin ve 30 saniye durulayın.
NOT: Hematoksilen boyamadan sonra, çekirdeğe bağlı ve sitoplazma tarafından emilen aşırı hematoksilen boyasını çıkarmak için% 0.5 hidroklorik asit etanol ile farklılaşma gereklidir. Eozin boyama yapıldığında, çekirdekler ve sitoplazma açıkça boyanacaktır. % 0.5 hidroklorik asit etanol ile farklılaşmadan sonra dilimler kırmızı veya pembe görünecektir, bu nedenle farklılaşmayı durdurmak için asidi doku dilimlerinden çıkarmak için farklılaşmadan hemen sonra durulayın. Ardından, nükleer lekelenmeyi arttırmak için% 0.2 amonyak suyu kullanın. - Eozin boyama: 100 μL eozin boyama solüsyonunu dağıtmak için 100 μL'lik bir pipet kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız) 5 dakika ve 30 saniye durulayın.
- Dehidrasyon ve sızdırmazlık: dilimleri 5 dakika mutlak etanole batırın, işlemi 5 dakika daha tekrarlayın, bir kez daha 5 dakika, dimetil 5 dakika ve ksileni 5 dakika tekrarlayın. Son olarak, nötr reçine ile kapatın (Malzeme Tablosuna bakın).
- Lekeli bölümün mikroskoba yerleştirilmesi: lekeli bölümü mikroskoba yerleştirin, görüntü net bir şekilde görünene kadar mikroskobun odağını ayarlayın, büyütmeyi 40x'e ayarlayın ve görüntüyü yakalayın.
6. Nazal mukozal dokunun çok renkli immün boyaması
- Mum alma ve nemlendirme: adım 5.1'de belirtilenin aynısını izleyin.
- Sitrat-fosfat tampon işlemi: sitrat-fosfat tamponunu (pH 6.0) ( Malzeme Tablosuna bakınız) mikrodalgaya dayanıklı bir kaba koyun. Kaynayana kadar ısıtın, çıkarın ve ardından slaytları kaba ekleyin. Kaynayana kadar 8 dakika orta ateşte mikrodalga, 8 dakika ısıyı kapatın ve ardından 7 dakika orta-düşük ısıya geçin.
- Doğal soğuduktan sonra, dilimleri PBS'ye (pH 7.4) aktarın, çalkalayın ve her seferinde 5 dakika boyunca renk giderici bir çalkalayıcı kullanarak üç kez yıkayın.
NOT: Bu işlem sırasında tamponun buharlaşmadığından emin olun ve dilimlerin kurumasını önleyin.
- Doğal soğuduktan sonra, dilimleri PBS'ye (pH 7.4) aktarın, çalkalayın ve her seferinde 5 dakika boyunca renk giderici bir çalkalayıcı kullanarak üç kez yıkayın.
- Endojen peroksidazı bloke etme: dilimleri kurutun, immünohistokimyasal bir kalemle dokunun etrafına bir daire çizin (antikorun akmasını önlemek için) ve% 3 hidrojen peroksit çözeltisi uygulayın (hidrojen peroksit: saf su = 1: 9).
- Oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika inkübe edin. Doğal soğuduktan sonra, dilimleri PBS'ye (pH 7.4) yerleştirin ve her biri 5 dakikalık üç döngü boyunca renk giderici bir çalkalayıcı üzerinde çalkalayın.
- Engelleme: Daire içine %5 keçi serumu uygulayın ve 30 dakika inkübe edin.
- Birincil antikor ilavesi: bloke edici çözeltiyi yavaşça çıkarın, dilime FOXP3 (seyreltme: 1:200, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve nemli bir odaya yerleştirin. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
NOT: Antikor buharlaşmasını önlemek için nemli odaya az miktarda su ekleyin. - İkincil antikor ilavesi: dilimleri PBS'ye (pH 7.4) yerleştirin ve her biri 5 dakikalık üç döngü boyunca renk giderici bir çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. Dilimleri nazikçe kurutun ve ikincil antikoru (Keçi Anti-Tavşan IgG H & L, bkz. Malzeme Tablosu) daire içine uygulayın. Karanlıkta 50 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- Tiramid seyreltme çözeltisinin hazırlanması: 100 μL %3H2O2'yi100 mL 1x TBST ile birleştirin (bkz.
- TSA çalışma çözeltisinin eklenmesi: TSA çalışma çözeltisini hazırlamak için 1 mL Tiramid seyrelticiyi 2 μL CY3-Tiramid ile karıştırın. Her dilime 100 μL TSA çalışma solüsyonu uygulayın ve oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika inkübe edin. Ardından, dilimleri PBS ile her seferinde 5 dakika olmak üzere üç kez yıkayın.
NOT: TSA çalışma solüsyonunu hemen hazırlayıp kullanın ve karanlıkta 4 °C'de saklayın; 24 saate kadar geçerlidir. - Adım 6.2-6.8'i tekrarlayın: 1:200 RORγt (FITC floresan boya) seyreltmesine ve ardından 1:200 TICAM1 (TYP620 boya) seyreltmesine geçin (bkz.
- DAPI karşı boyalı çekirdekler: dilimleri kurutmak için hafifçe sallayın, DAPI boyama solüsyonu uygulayın ve oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika inkübe edin.
- Söndürme otofloresansı: dilimleri PBS'ye (pH 7.4) yerleştirin ve her biri 5 dakikalık üç döngü boyunca renk giderici bir çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. Otofloresan söndürücüyü ( Malzeme Tablosuna bakınız) dilimlere uygulayın, 5 dakika bekleyin ve ardından 10 dakika yıkayın.
- Engelleme: dilimleri PBS'ye (pH 7.4) yerleştirin ve her biri 5 dakikalık üç döngü boyunca renk giderici bir çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. Dilimleri kurutmak için hafifçe sallayın ve floresan önleyici söndürücü ile kapatın (bkz.
- Mikroskopi: lekeli bölümü mikroskobun üzerine yerleştirin, net görünürlük için mikroskobun odağını ayarlayın, büyütmeyi 20x ve 40x'e ayarlayın ve görüntüyü yakalayın.
NOT: DAPI, 330-380 nm UV uyarma dalga boyuna ve 420 nm (mavi ışık) emisyon dalga boyuna sahiptir. FITC, 465-495 nm'lik bir uyarma dalga boyuna ve 515-555 nm'lik bir emisyon dalga boyuna (yeşil ışık) sahiptir. CY3, 510-560 nm'lik bir uyarma dalga boyuna ve 590 nm'lik bir emisyon dalga boyuna (kırmızı ışık) sahiptir. TYP-690, 630 nm'lik bir uyarma dalga boyuna ve 690 nm'lik bir emisyon dalga boyuna (pembe ışık) sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Altı SD sıçan, OVA intraperitoneal enjeksiyon ve nazal zorlama yoluyla AR modeline başarılı bir şekilde indüklendi. AR, AR grubundaki tüm sıçanlarda indüklendi ve grubun% 100'ünü oluşturdu. AR grubundaki tüm sıçanlar hapşırma, burun akıntısı ve burun kaşıntısı gibi tipik semptomlar sergiledi. Tüm davranışsal gözlemler ≥5 puan aldı (Tablo 2).
Modellemenin 21. günündeki H & E boyama sonuçları, kontrol sıçanlarında, burun mukozasının epitel hücrelerinin ve kirpiklerin iyi düzenlenmiş olduğunu ve inflamatuar hücre infiltrasyonu belirtisi olmadığını ortaya koydu. Tersine, AR grubunda, nazal septumun mukozası hasar görmüş ve ayrılmış, kayda değer nötrofil infiltrasyonu olmuştur (Şekil 3).
AR sıçanlarının burun mukoza dokusu kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, RORγt (Th17 hücresine özgü bir transkripsiyon faktörü) ve TICAM-1 (Toll benzeri reseptör bağlayıcı molekül-1) ekspresyonunun arttığı, Foxp3'ün (Treg hücresine özgü bir transkripsiyon faktörü) azaldığı gözlenmiştir (Şekil 4).
Şekil 1: Deneysel iş akışı . (A) İntraperitoneal enjeksiyonun şematik diyagramı. (B) Burun akıntısının şematik diyagramı. (C) Allerjik rinit sıçanlarının modellenmesinin akış şeması. (D) Davranışsal gözlemin şematik diyagramı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Burun alma işlemi . (A) Ağzın köşelerindeki kas dokusunun kesilmesi. (B) Elmacık kemiği ile mandibula arasındaki bağlantının kesilmesi. (C) Mandibulanın ayrılması. (D) Maksilla derisinin çıkarılması. (E) Burun boşluğunu açığa çıkarmak. (F) Burun boşluğu ile maksilla arasındaki bağlantının kesilmesi. (G) Burun boşluğu ile orbital kemik arasındaki bağlantının kesilmesi. (H) Çıkarılan burun boşluğu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: AR modellemesinden sonra 14. günde temsili histopatolojik H&E boyama görüntüleri (n = 6). (A) Kontrol sıçanlarının nazal mukozasındaki epitel hücreleri ve kirpikler iyi düzenlenmiştir ve inflamatuar hücre infiltrasyonu gözlenmemiştir. (B) AR grubunun nazal septumunun mukozası hasar gördü ve nötrofil infiltrasyonu ile ayrıldı. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: RORγt, Foxp3 ve TICAM-1'in MIF boyama analizi (n = 6). Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, AR grubundaki sıçanların burun mukoza dokularında RORγt ve TICAM-1 ekspresyonu yükselirken, Foxp3 ekspresyonu azaldı. Ölçek çubukları = 100 μm (sol paneller); 50 μm (sağ paneller). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: mIF tekniğinin prensibi. mIF tekniği, floresan sinyalin antijene kovalent olarak bağlanmasını içeren TSA tekniğine dayanmaktadır. Bu süreçte, ikincil antikor üzerinde etiketlenmiş yaban turpu peroksidaz floresein substratının inaktif durumdan aktive duruma geçişini katalize eder. Bu aktive durum, antijen üzerindeki tirozine kovalent olarak bağlanabilir ve bu da numuneye kararlı bir kovalent floresein bağlanmasına neden olur. Daha sonra, kovalent bağlı olmayan antikorlar termal onarım yoluyla uzaklaştırılır. Prosedür daha sonra tamamen farklı bir antijenin saptanmasını sağlamak için ek primer antikorlar, sekonder antikorlar ve floresein ile tekrarlanır. Bu görüntü, mIF şematik diyagramı17'ye referansla yeniden çizildi ve renk eşleştirmesi yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Notalar | Hapşırma sıklığı | Rinore | Burun ovuşturma |
| 1 | <3 | burun boşluğunda sulu akıntı | hafif ve ara sıra burun ovuşturmaları |
| 2 | 4 ~ 10 | ön naristen dökülen sulu akıntı | tekrarlanan burun ovuşturmaları |
| 3 | ≥11 | Bol sulu akıntı ile kaplı yüz | burundan yüze sürtünme |
Tablo 1: Sıçan davranış testinin nicel ölçek tablosu.
| Bireyler | 1. Gün | 21. Gün |
| Kontrol 1 | 0 | 0 |
| Kontrol 2 | 0 | 0 |
| Kontrol 3 | 0 | 0 |
| Kontrol 4 | 0 | 0 |
| Kontrol 5 | 0 | 0 |
| Kontrol 6 | 0 | 0 |
| AR 1 | 0 | 7 |
| AR 2 | 0 | 6 |
| AR 3 | 0 | 5 |
| AR 4 | 0 | 5 |
| AR 5 | 0 | 5 |
| AR 6 | 0 | 6 |
Tablo 2: Davranışsal puanlama sonuçları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Allerjik Rinit (AR), çevresel ve genetik faktörlerin bir kombinasyonundan kaynaklanan burun mukozasının enfeksiyöz olmayan inflamatuar bir hastalığıdır. İş verimliliğini etkileyen, yaşam kalitesini düşüren, uykuyu, bilişsel işlevi bozan, sinirlilik ve yorgunluğa neden olan küresel bir sağlık sorunu haline geldi. AR, dünya nüfusunun %10-20'sini¹ etkilemekte ve önemli ekonomik maliyetler taşıyarak AB ülkelerinde yıllık 30-50 milyar avroya varan kayıplara neden olmaktadır18. Ayrıca, birkaç çalışma AR ve astım arasında güçlü bir ilişki kurmuştur18,19,20 ve AR'ye sahip bireylerin astım geliştirme olasılığı AR 21 olmayanlara göre yedi kat daha fazladır. Mevcut araştırmalar, tip 1 yardımcı T hücreleri (Th1) ve tip 2 yardımcı T hücreleri (Th2) arasında Th2 hücrelerine karşı önyargılı bir dengesizliğin AR'ye önemli bir katkıda bulunduğunu göstermektedir. İnterlökin-4 tarafından uyarılan Th2 hücreleri, IL-5 ve IL-13 gibi Th2 benzeri sitokinler üreterek B lenfositlerinde, mast hücrelerinde, eozinofillerde ve dendritik hücrelerde iltihaplanmayı tetikler22. Ayrıca, son AR araştırması, yardımcı Th17 / düzenleyici T hücresi (Treg) popülasyonlarındaki bir dengesizlik arasında güçlü bir bağlantı olduğunu göstermektedir23. Her ikisi de CD4 + T hücrelerinden türetilen Th17 ve Treg hücreleri, bağışıklık sisteminde kritik rol oynar. RORγt, Th17 hücre farklılaşması24 için gereklidir, immünosupresif işlevlere sahip Treg hücreleri, immün toleransı korumanın anahtarıdır. Foxp3 ekspresyonundaki değişiklikler Treg hücre fonksiyonunuetkiler 25,26. Bu nedenle, RORγt ve Foxp3 seviyelerindeki değişiklikler, Th17 / Treg dengesizliklerini yansıtır ve potansiyel olarak esas olarak Th17 hücreleri27 tarafından yönlendirilen bir inflamatuar yanıtı indükler. Toll benzeri reseptörler (TLR'ler), vücudun doğuştan gelen bağışıklık sisteminde hayati proteinlerdir ve spesifik gen ekspresyonunu aktive etmek için hücre içi sinyal yollarına aracılık eder28. He Shan ve ark.29 tarafından yapılan araştırmalar, TLR4 genindeki varyasyonların, özellikle rs10759930 lokusundaki CT heterozigot ve TT saf mutasyonlarının AR gelişimi ile ilişkili olduğunu buldu. TICAM-1'in TLR3 ve TLR4 arasındaki köprü molekülü rolü göz önüne alındığında, AR'nin TICAM-1 ile bağlantılı olabileceği varsayılmıştır. Gerçekten de, sonuçlar, Xu ve ark.'nınçalışması 30 ile tutarlı olarak, AR grubunda yüksek TICAM-1 ekspresyonu gösterdi.
Bu çalışmada kullanılan mIF (Multipleks immünofloresan) tekniği, son 20 yılda geliştirilen nispeten yeni bir tespit yöntemidir. Geleneksel immünofloresan (IF) tekniklerine göre, artan özgüllük, duyarlılık ve verimin yanı sıra görsel analiz yeteneği de dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sunar. Bu teknik, floresan sinyallerini antijenlere kovalent olarak bağlayan ve mikrodalga ısıtmadan etkilenmeyen TSA (Tiramid Sinyal Amplifikasyonu) yöntemine dayanmaktadır. Bu, tekrarlanan TSA floresan boyama döngüleri yoluyla dokuların çok renkli etiketlenmesine izin verir, ardından floresan sinyalini 17,31,32 korurken antikorları çıkarmak için mikrodalga ısıtma yapılır (Şekil 5). Daha sonra, çok etiketli görüntülerde belirli yapıları gösteren hedef doku bölgelerinin otomatik olarak tanımlanması ve segmentasyonu için gelişmiş algoritmalar uygulanır. Bu, hücresel immün fenotiplerin kantitatif değerlendirmesine ve immün hücrelerin fonksiyonel lokalizasyonuna izin vererek, ilgilenilen bölgelerin kantitatif istatistiksel analizini sağlar. Ayrıca doku bağlamı ve mekansal dağılım hakkında bilgi sağlar33,34.
Bununla birlikte, teknik olarak, mIF hala geleneksel IF tekniklerine dayanmaktadır ve antikor çapraz reaktivitesi ve optik karışma gibi zorluklarla karşı karşıyadır. Çoklu antikorların kullanılması, çapraz reaktiviteye ve yanlış pozitif sonuçlara yol açabilirken, üst üste binen floresan spektrumları, birden fazla hedeften gelen floresan sinyallerinin harmanlanmasına neden olabilir, bu da çıplak gözle farklılaşmayı zorlaştırır ve özel görüntü analiz algoritmalarına olan bağımlılığı artırır35. Ayrıca, antikorları etiketlemek için floresan boyalar kullanıldığından, mIF, floresan söndürme ve ağartmadan etkilenebilir ve bu da sinyal yoğunluğunun azalmasına neden olabilir. Özellikle, geleneksel IF teknikleri tüm dokuyu değerlendirirken, mIF teknikleri analiz için doku bölümündeki belirli ilgi alanlarına odaklanır. Bu, doku heterojenliği nedeniyle gerçeklikten sapmalara neden olabilir ve potansiyel olarak yanlış histolojik niceleme veya nadir olayların ihmal edilmesine neden olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Sichuan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Departmanı (2021YJ0175) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Al(OH)3 | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A7130 | |
| 75% ethanol | Anhui Yiren An Co., Ltd | 20210107 | |
| Ammonia | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Anhydrous ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Anti-fluorescence quenching sealer | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Automatic dyeing machine | Thermo scientific | Varistain Gemini ES | |
| Carrier slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Citrate-phosphate buffer | Servicebio biotechnology co., Ltd | G1201 | |
| Citric acid antigen repair solution (PH 6.0) | Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1201 | |
| Coverslip | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Coverslip | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | CS01-2450 | |
| CY3-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1223-50UL | |
| DAPI | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1012 | |
| Decoloring shaker | SCILOGEX | S1010E | |
| EDTA decalcification solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Electric heating blast dryer | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fast tissue dewatering machine | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Film sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| FITC-Tyramide | Sawell Biotechnology Co., Ltd | G1222-50UL | |
| Fluorescence microscope | Sunny Optical Technology Co.Ltd | CX40 | |
| Foxp3 | Affinity Biosciences Co., Ltd | bs-10211R | |
| Freezing table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Liankebio Co., Ltd | GAR0072 | |
| Goat serum | Biosharp | BL210A | |
| H&E staining kit | Leagene | DH0020 | |
| Hemostatic forceps | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J31010 | |
| Hydrochloric acid | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| Immunohistochemical pen | Biosharp | BC004 | |
| Microwave oven | Midea | M1-L213B | |
| Neutral gum | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Ovalbumin | Sollerbauer Biotechnology Co., Ltd | A804010 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| Palm centrifuge | SCILOGEX | D1008E | |
| Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0099-100ml | |
| Pathology section scanner | 3DHISTECH Kft | Pannoramic SCAN | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Pipette | Dragon | KE0003087/KA0056573 | |
| Rorγt | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF3196 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Self-fluorescent quenching agent Sudan Black B | Bioengineering Co., Ltd | A602008-0025 | |
| Slicer | Thermo scientific | HM325 | |
| Slicing machine | Thermo scientific | HM325 | |
| Slide | Nantong Mewtech Life Science Co., Ltd | PC2-301 | |
| Sprague Dawley rats | Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine | SYX  2023-0100 |
|
| TICAM-1 | Affinity Biosciences Co., Ltd | DF6289 | |
| Tissue scissors | Shanghai Medical Devices Co., Ltd | J22120 | |
| Tissue spreading baking sheet machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| TYR-690 fluorescent dyes | Shanghai Rutron Biotechnology Co., Ltd | RC0086-34RM | |
| Vortex mixer | SCILOGEX | SLK-O3000-S | |
| Water bath-slide drier | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Wax trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Brożek, J. L., et al. Allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) Guidelines-2016 revision. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 950-958 (2017).
- Maurer, M., Zuberbier, T. Undertreatment of rhinitis symptoms in Europe: findings from a cross-sectional questionnaire survey. Allergy. 62 (9), 1057-1063 (2007).
- Ding, Y., et al. Alpha-linolenic acid improves nasal mucosa epithelial barrier function in allergic rhinitis by arresting CD4+ T cell differentiation via IL-4Rα-JAK2-STAT3 pathway. Phytomedicine: International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology. 116, 154825 (2023).
- Zhou, H., et al. Activation of NLRP3 inflammasome contributes to the inflammatory response to allergic rhinitis via macrophage pyroptosis. International Immunopharmacology. 110, 109012 (2022).
- Watts, A. M., Cripps, A. W., West, N. P., Cox, A. J. Modulation of allergic inflammation in the nasal mucosa of allergic rhinitis sufferers with topical pharmaceutical agents. Frontiers in pharmacology. 10, 294 (2019).
- Patel, N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy & Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1(+)CD8(+) T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoua, C., et al. PD-1-ex pressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Fedchenko, N., Reifenrath, J. Different approaches for interpretation and reporting of immunohistochemistry analysis results in the bone tissue - a review. Diagnostic Pathology. 9, 221 (2014).
- Faget, L., Hnasko, T. S. Tyramide signal amplification for immunofluorescent enhancement. Methods in Molecular Biology. 1318, 161-172 (2015).
- Parra, E. R., Villalobos, P., Rodriguez-Canales, J. The multiple faces of programmed cell death ligand 1 expression in malignant and nonmalignant cells. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology.: AIMM. 27 (4), 287-294 (2019).
- Welsh, A. W., et al. Standardization of estrogen receptor measurement in breast cancer suggests false-negative results are a function of threshold intensity rather than percentage of positive cells. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 29 (22), 2978-2984 (2011).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).
- Miao, M., Xiang, L., Miao, Y. Specification for preparation of allergic rhinitis animal model (draft). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 49 (1), 50-57 (2018).
- Xu, J., et al. Astragalus polysaccharides attenuate ovalbumin-induced allergic rhinitis in rats by inhibiting nlrp3 inflammasome activation and nod2-mediated nf- κ b activation. Journal of Medicinal Food. 24 (1), 1-9 (2021).
- Bousquet, J., et al.
- Free Thinking. Multiplex fluorescence immunohistochemistry. , http://www.freethinking.com.cn/?xinwendongtai/156.html (2023).
- Huang, C., et al. Expression of activated signal transducer and activator of transcription-3 as a predictive and prognostic marker in advanced esophageal squamous cell carcinoma. World Journal of Surgical Oncology. 13, 314 (2015).
- Leynaert, B., Bousquet, J., Neukirch, C., Liard, R., Neukirch, F. Perennial rhinitis: An independent risk factor for asthma in nonatopic subjects: results from the European Community Respiratory Health Survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 104 (2), 301-304 (1999).
- Guerra, S., et al. Rhinitis is an independent risk factor for developing cough apart from colds among adults. Allergy. 60 (3), 343-349 (2005).
- Greisner, W. A., Settipane, R. J., Settipane, G. A. Co-existence of asthma and allergic rhinitis: a 23-year follow-up study of college students. Allergy and Asthma Proceedings. 19 (4), 185-188 (1998).
- Pawankar, R., Mori, S., Ozu, C., Kimura, S. Overview on the pathomechanisms of allergic rhinitis. Asia Pacific Allergy. 1 (3), 157-167 (2011).
- Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of α-lipoic acid via balancing th17/treg expression and enhancing nrf2/ho-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528 (2020).
- Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor rorγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Zhou, X., et al. Instability of the transcription factor Foxp3 leads to the generation of pathogenic memory T cells in Vivo. Nature Immunology. 10 (9), 1000-1007 (2009).
- Ziegler, S. F., Buckner, J. H. Foxp3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation. Microbes and Infection. 11 (5), 594-598 (2009).
- Yaling, Y., Gui, Y., Shuqi, Q. Recent research advances of toll-like receptors and allergic rhinitis. Medical Recapitulate. 23 (7), 1273-1276 (2017).
- Shan, H., Jie, C. Correlation between TLR4 gene polymorphisms and allergic rhinitis. Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 31 (13), 991-994 (2017).
- Xu, O., et al. Immunoregulatory mechanism of Treg cells and TICAM-1 patients with severe allergic rhinitis. Chinese Journal of Coal Industry Medicine. 23 (3), 303-306 (2020).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoual, C., et al. PD-1 expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in hpv-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Gustavson, M. D., et al. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using automated quantitative analysis. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).
- Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).
- Hernandez, S., et al. Multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification for immune cell profiling of paraffin-embedded tumor tissues. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 667067 (2021).
