Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

ABCG5/G8 krystallisering i et lipidisk bicellemiljø til røntgenkrystallografi

Published: August 25, 2023 doi: 10.3791/65828
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, Faculty of Medicine, University of Ottawa, 2Department of Biochemistry, Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta

Summary

Denne protokol beskriver en opsætning til krystallisering af steroltransportøren ABCG5/G8. ABCG5/G8 rekonstitueres til biceller til hanging-drop krystallisering. Protokollen kræver ikke specialiserede materialer eller substrater, hvilket gør den tilgængelig og nem at tilpasse i ethvert laboratorium til bestemmelse af proteinstrukturen gennem røntgenkrystallografi.

Abstract

ATP-bindende kassettetransportører (ABC) udgør lipidindlejrede membranproteiner. Ekstraktion af disse membranproteiner fra lipiddobbeltlaget til et vandigt miljø opnås typisk ved at anvende vaskemidler. Disse vaskemidler opløser lipiddobbeltlaget og opløser proteinerne. Membranproteinernes iboende habitat i lipiddobbeltlaget udgør en udfordring med at opretholde deres stabilitet og ensartethed i opløsning til strukturel karakterisering. Biceller, som omfatter en blanding af lange og kortkædede fosfolipider og vaskemidler, replikerer den naturlige lipidstruktur. Anvendelsen af lipidbiceller og vaskemidler tjener som et passende modelsystem til opnåelse af diffraktionskrystaller af høj kvalitet, specifikt til bestemmelse af membranproteiners højopløsningsstruktur. Gennem disse syntetiske mikromiljøer bevarer membranproteiner deres oprindelige konformation og funktionalitet, hvilket letter dannelsen af tredimensionelle krystaller. I denne tilgang blev den vaskemiddelopløselige heterodimeriske ABCG5 / G8 reintegreret i DMPC / CHAPSO-biceller, suppleret med kolesterol. Denne opsætning blev anvendt i dampdiffusionseksperimentproceduren til proteinkrystallisation.

Introduction

ATP-bindende kassettetransportører (ABC) udgør en superfamilie af membranproteiner, der er ansvarlige for forskellige ATP-afhængige transportprocesser på tværs af biologiske membraner 1,2,3,4,5. Disse transportørproteiner er impliceret i hjerte-kar-sygdomme og spiller en væsentlig rolle i at lette kolesteroludstrømning til galden til efterfølgende udskillelse i leveren. Derfor har kolesterolmetabolisme og balance fået betydelig interesse gennem årene6. En specifik mekanisme, der er involveret i eliminering af kolesterol og andre steroler fra kroppen, involverer medlemmer af den humane ABCG-underfamilie, især den heterodimeriske ABCG5/G8 7,8,9,10. Mutationer i et af disse gener forstyrrer heterodimeren, hvilket fører til tab af funktion og forårsager sitosterolæmi, en lidelse, der påvirker sterolhandel11,12,13. I betragtning af sygdommens relevans og deres rolle i at fremme kolesteroludstrømning har steroltransportører tiltrukket sig betydelig opmærksomhed. Ikke desto mindre forbliver de indviklede detaljer om deres molekylære mekanisme og substratselektivitet stort set ikke afsløret. Således er belysningen af krystalstrukturen i ABCG5 / G8 et afgørende skridt mod at forstå mekanismerne og nedstrøms funktioner i kolesteroltransport.

Membranproteiner kræver forankring i membraner for at folde og fungere korrekt. Derfor resulterer ekstraktion af membranproteiner fra deres naturlige miljø ofte i proteinstabilitet, fejlfoldning og tab af funktion14,15. Disse udfordringer understreger de primære forhindringer i membranproteinkrystallisering. Imidlertid har rekonstitution af proteiner til syntetiske vaskemiddel-dobbeltlag, ligesom biceller, vist sig at være en løsning på denne knibe, hvilket muliggør vedligeholdelse af membranproteiner inden for et naturligt lignende dobbeltlagsmiljø16. Biceller er samlinger af syntetiske fosfolipider og vaskemidler suspenderet og opløseligt i vand. Især vedtager de en dobbeltlagsstruktur, der efterligner biologiske membraner16,17,18. Biceller kan skifte mellem væske- og gelfaser baseret på temperatur og viskositet. Bicellekrystallisering udnytter de små dobbeltlagsskiver og lav viskositet ved reducerede temperaturer, hvilket letter grundig blanding af proteiner og bicelleopløsninger. Bicellernes størrelse afhænger af forholdet mellem vaskemiddel og lipid under tilberedning19,20. De fremherskende vaskemidler til bicelledannelse omfatter 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propansulfonat (CHAPSO) sammen med 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS) og 1,2-ditridecanoyl-sn-glycerol-3-phosphocholin (DHPC)21. Disse vaskemidler anvendes sammen med lipider såsom di-myristoyl-phosphatidylcholin (DMPC) og 1-palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylcholin (POPC). Desuden har nylige undersøgelser vist den fulde funktionalitet af membranproteiner i biceller under fysiologiske forhold. For eksempel krystalliserede Lee og kolleger med succes og rapporterede krystalstrukturen af ABCG5 / ABCG8 baseret på et lipid dobbeltlag22,23. I krystallisationsprocessen kan protein-bicelleblandinger rummes ved hjælp af standardudstyr, herunder krystallisationsrobotter med høj kapacitet24. Muligheden for at udnytte biceller afhænger imidlertid af proteinernes termostabilitet på grund af krystalliseringsbetingelserne ved højere temperaturer. Ikke desto mindre, sammenlignet med andre teknikker, forbliver de nødvendige krystalliseringsbetingelser for membranproteiner generelt milde, hvilket involverer lave koncentrationer af bundfald, salt og buffer. Dette gør både protein-bicelleblandinger og dampdiffusion effektive og let implementerbare værktøjer til strukturelle undersøgelser af membranproteiner.

Denne protokol skitserer væsentlige trin i proteinforberedelse og bicellekrystallisation til bestemmelse af røntgenkrystalstrukturen af ABCG5 / G8 ved høj opløsning (figur 1).

Protocol

1. Kloning og proteinekspression

  1. Klon det humane ABCG5/G8 gen ind i Pichia pastoris gær efter tidligere protokoller25,26. Kort fortalt udledes pSGP18 og pLIC ekspressionsvektorer fra pPICZB. Tilføj et tag, der koder for et rhinovirus 3C-proteasested efterfulgt af et calmodulinbindende peptid (CBP) til C-terminalen af ABCG8 cDNA (pSGP18-G8-3C-CBP).
    1. Tilføj et seks-histidin-mærke adskilt af et glycin(His 6 GlyHis6) til C-terminalen af ABCG5 cDNA (pLIC-G5-H12). Co-omdanne plasmiderne til Pichia stamme KM71H ved hjælp af elektroporation.
      BEMÆRK: Se materialefortegnelsen for detaljer om de anvendte plasmider, medier og buffere.
    2. Dyrk transformerede gærceller på MD-agarplader ved 28 °C.
  2. Efter 1-2 dage vælges 10-12 kolonier og podes i 10 ml MGY-medier (minimal glycerolgærnitrogenbase) ved hjælp af 50 ml centrifugerør til småskala kultur.
    1. Lav tre små huller i centrifugerørets låg for bedre beluftning. Lad cellerne vokse ved 28 °C med konstant omrystning ved 250 omdr./min., indtil den optiske densitet ved 600 nm (OD600) når 10, hvilket normalt tager 1-2 overnatninger.
      BEMÆRK: Cellevækst tager normalt mellem 12-24 timer.
  3. Den næste dag skal du tage 1 liter sterilt MGY-medium og pode det med den primære kultur i en 2,4 L kolbe. Kolben inkuberes ved 28 °C i en rysterinkubator ved 250 o/min i 24 timer.
    1. For at opretholde pH mellem 5-6 tilsættes 10% ammoniumhydroxid (NH4OH), indtil pH stabiliseres.
  4. pH-værdien justeres, og proteinekspressionen induceres ved at tilsætte 1 ml ren methanol pr. 1 liter kultur (0,1 % (v/v) methanol).
    BEMÆRK: Fødeceller efterfølgende med 5 ml ren methanol pr. liter kultur (0,5 % (v/v) methanol) hver 12. time i en samlet varighed på 36-48 timer.
  5. Cellerne høstes ved centrifugering ved 15.000 x g i 30 minutter ved 4 °C.
  6. Opsaml cellepellets og resuspender dem i lysisbuffer (0,33 M saccharose, 0,3 M Tris-Cl pH 7,5, 0,1 M aminohexansyre, 1 mM EDTA og 1 mM EGTA) til en koncentration på 0,5 g / ml. Opbevar suspensionen ved -80 °C. Typisk kan man genvinde 30 ± 5 g cellemasse fra 1 liter dyrkede celler.
    BEMÆRK: Opbevar cellepiller direkte i fryseren eller udfør øjeblikkelig resuspension i lysisbuffer til membranpræparater.

2. Fremstilling af mikrosomal membran

  1. Optø cellerne og tilsæt proteasehæmmere (2 μg/ml leupeptin, 2 μg/ml pepstatin A, 2 mM PMSF, se materialetabel).
    1. For yderligere at lyse celler skal du bruge en iskølet emulgator eller mikrofluidisator (se materialetabel) ved 25.000-30.000 psi. Gentag denne proces 3-4 gange.
    2. Centrifuger for at fjerne cellerester: drej ved 3.500-4.000 x g i 15 min, efterfulgt af et andet spin ved 15.000 x g i 30 min. Hold begge spins ved 4 °C.
  2. For at isolere mikrosomale membranvesikler overføres supernatanten til ultracentrifugeglas og ultracentrifugeres ved 2,00,000 x g i 1,5 timer ved 4 °C.
    1. Resuspender membranpelleten i 50 ml buffer A (50 mM Tris-Cl pH 8,0, 100 mM NaCl og 10% glycerol) ved hjælp af en dounce homogenisator. Opbevar suspensionen ved -80 °C.

3. Proteinpræparat-oprensning af heterodimerer

  1. Optø de frosne mikrosomale membraner, og juster koncentrationen til 4-6 mg/ml ved hjælp af opløselighedsbuffer. Bufferen skal indeholde 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10% glycerol, 1% (w/v) β-dodecylmaltosid (β-DDM), 0,5% (w/v) cholat, 0,1% (w/v) cholesterylhemisuccinat (CHS), 5 mM imidazol, 5 mM β-mercaptoethanol (β-ME), 2 μg/ml leupeptin, 2 μg/ml pepstatin A og 2 mM PMSF (se materialetabel).
    BEMÆRK: Man kan blande lige store mængder membranpræparation og opløselighedsbufferen eller bruge 2x opløselighedsbuffer uden proteasehæmmere og reduktionsmidler. Kort kogning af bufferen hjælper med at opløse CHS effektivt. Til rensning må der kun anvendes den 4 °C-afkølede buffer.
    1. Blandingen omrøres ved medium hastighed i 1 time ved 4 °C. Følg dette med yderligere omrøring ved stuetemperatur (RT) i 20-30 min.
    2. Blandingen centrifugeres ved 1,00,000 x g i 30 minutter ved 4 °C for at fjerne uopløselige membraner. Den opløselige supernatant opsamles, og der tilsættes 20 mM imidazol og 0,1 mM TCEP.
  2. Affinitetssøjlekromatografi26 udføres: Den opløselige supernatant bindes til præækvilibrerede Ni-NTA-perler (10-15 ml) (se materialetabel) i buffer A (trin 2.2.1) natten over.
    BEMÆRK: Undgå at bruge glycerol i løbende buffere fra dette tidspunkt og fremefter.
    1. Kolonnen vaskes to gange med 10 kolonnevolumener buffer B (50 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 % (w/v) β-DDM, 0,05 % (w/v) cholat, 0,01 % (w/v) CHS, 0,1 mM TCEP) indeholdende 25 mM imidazol.
    2. Kolonnen vaskes med buffer B indeholdende 50 mM imidazol med 10 kolonnevolumen.
    3. Eluer proteinet ved hjælp af buffer C (buffer B med 200 mM imidazol).
    4. Der tilsættes 1 mM TCEP (se materialetabel) og 10 mMMgCl2 til de eluerede proteiner.
    5. Valider de eluerede fraktioner på en SDS-PAGE gel for at bekræfte den korrekte proteinstørrelse26.
      BEMÆRK: Typisk proteinudbytte (1. Ni-NTA): 10-20 mg protein pr. 6 L kultur. Brug DDM ved 10x eller 5x af dets kritiske micellekoncentration (CMC), ca. 0,01%. Denne protokol anvender 0,1% DDM.
    6. Topfraktionerne fra Ni-NTA-eluering fortyndes med et tilsvarende volumen buffer D1 (buffer B med 1 mM CaCl2, 1 mMMgCl2), blandes og fyldes proteinfraktionerne på en CBP-kolonne (3-5 ml) (se materialetabel), der er præekvilibreret med CBP-vaskebuffer D1.
    7. Udfør sekventielle vaske på CBP-søjlen for at udskifte rengøringsmidler ved hjælp af buffer D1 og D2 (buffer B med 1 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 0,1% (w / v) decylmaltose neopentylglycol (DMNG) uden β-DDM): vask først med 3 kolonnevolumener D1; vaskes derefter med 3 kolonnevolumener D1:D2 (3:1, v/v); for det tredje, vask med 3 kolonnevolumener af D1: D2 (1: 1, v / v); fjerde trin, vask med 3 kolonnevolumener af D1: D2 (1: 3, v / v), efterfulgt af 6-10 kolonnevolumener af D2.
    8. Eluer proteinet ved hjælp af CBP vask buffer D2 med 300 mM NaCl i 1 ml fraktioner fra CBP-kolonnen (i alt 10 ml). Koncentrer de eluerede fraktioner til 1-2 ml.
      BEMÆRK: Det typiske proteinudbytte (1st CBP) er 5-15 mg protein pr. 6 L kultur. Maltose neopentyl glycol (MNG) rengøringsmidler forbedrer oprenset proteinlagring ved 4 °C. Både DMNG og Lauryl MNG (LMNG) blev brugt, hvor DMNG gav bedre røntgendiffrakterende krystaller. Brug DMNG ved 10-20x af dets kritiske micellekoncentration (CMC), ca. 0,003%. Denne protokol brugte 0,1% DMNG. En brøkdel af CBP-eluatet kan renses yderligere ved gelfiltreringskromatografi (trin 4.4.) for at analysere proteiners ATPase-aktivitet eller vurdere monodispersitet gennem transmissionselektronmikroskopi (TEM).

4. Behandling af proteinpræparat-prækrystallisation

  1. Spalte de N-bundne glycaner og CBP-tags ved hjælp af henholdsvis endoglycosidase H (Endo H, ~0,2 mg pr. 10-15 mg renset protein) og HRV-3C-protease (~ 2 mg pr. 10-15 mg renset protein) (se materialetabel). Der inkuberes natten over ved 4 °C.
  2. Under Endo H- og 3C-proteaseinkubationen udføres reduktiv alkylering på de poolede proteiner. Begynd med at inkubere med 20 mM iodoacetamid (se materialetabel) natten over ved 4 °C. Følg dette med en 1 times inkubation med yderligere 2 mM iodoacetamid på is.
    BEMÆRK: Dette trin stabiliserer yderligere proteinlagringen i op til en måned ved 4 °C.
  3. Brug en anden CBP-kolonne (1-2 ml) til at adskille det spaltede CBP-mærke. Brug buffer D2 til denne proces.
    BEMÆRK: Det typiske proteinudbytte (2. CBP ) er 5-10 mg protein pr. 6 L kultur.
  4. Rens CBP-mærkefrit protein ved hjælp af gelfiltreringskromatografi. Bufferen skal indeholde 10 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1% (w/v) DMNG, 0,05 % (w/v) cholat og 0,01% (w/v) CHS.
    BEMÆRK: Det typiske proteinudbytte (gelfiltrering) er 2-8 mg protein pr. 6 L kultur. I løbet af dette trin indikerer fraværet af en DDM-top (~ 65 kD) under gelfiltrering vellykket udskiftning af vaskemiddel til DMNG.
  5. De samlede proteinfraktioner modificeres gennem reduktiv methylering: Der tilsættes 20 mM dimethylaminboran (DMAB, se materialetabellen) og 40 mM formaldehyd til proteinet. Der inkuberes i 2 timer ved 4 °C på en oscillerende ryster. Tilføj 10 mM DMAB.
    1. Gentag trin 4.5, inklusive tilsætning af 10 mM DMAB, og inkuber natten over (12-18 timer) ved 4 °C.
    2. Stop reaktionen ved at tilsætte 100 mM Tris-Cl, pH 7,5.
  6. Det methylerede protein lægges på en 2 ml Ni-NTA-søjle, der er præekvilibreret med 100 mM Tris-Cl, pH 8,0 og 100 mM NaCl.
    1. Kolonnen vaskes med 10 kolonnevolumener vaskebuffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, med 0,5 mg/mL DOPC: DOPE (3:1, w/w), 0,1% (w/v) DMNG, 0,05% (w/v) cholat, 0,01% (w/v) CHS).
    2. Eluere det relipiderede protein ved hjælp af elueringsbuffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 200 mM imidazol, 0,5 mg/mL DOPC: DOPE (1:1, w/w), 0,1% (w/v) DMNG, 0,05% (w/v) cholat, 0,01% (w/v) CHS).
      BEMÆRK: Det typiske proteinudbytte (2nd Ni-NTA) er 1-5 mg protein pr. 6 L kultur.
    3. Proteinet eluerer gennem en PD-10-afsaltningskolonne, der er præekvilibreret med den buffer, der anvendes i trin 4.4.
  7. Det afsaltede og relipiderede protein inkuberes natten over med kolesterol (fremstillet i isopropanol eller ethanol) til en slutkoncentration på ~20 μM.
    1. Næste morgen fjernes bundfældningsmidlet ved ultracentrifugering ved 1,50,000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Supernatanten hentes.
    2. Koncentrer proteinet til en slutkoncentration på 30-50 mg/ml ved hjælp af en 100 kDa afskåret centrifugalkoncentrator.
    3. Udfældningsmidlet fjernes ved hjælp af en bordkølecentrifuge ved tophastighed i 30 minutter ved 4 °C.
    4. Supernatanten opbevares på is ved 4 °C, og krystallisationsbetingelserne i bicellerne fastlægges.
      BEMÆRK: De koncentrerede proteiner skal bruges til krystalvækst inden for en uge. Frys ikke proteinerne.

5. Proteinkrystallisation i biceller

  1. Forbered en 10 % bicellestamopløsning med DMPC-lipider og CHAPSO-vaskemiddel i forholdet 3:1 (w/w) (se materialetabel).
    BEMÆRK: Brug CHAPSO ved 5x af dets kritiske micellekoncentration (CMC), ca. 0,5 %. Dette opretholder koncentrationen af vaskemiddel omkring dets CMC i protein-bicelleblandingen (trin 5.2).
    1. Tilsæt deioniseretH2O-opløstvaskemiddel (CHAPSO) til fortørrede lipider (blanding af 5 mol% kolesterol og 95 mol% DMPC).
      BEMÆRK: Forbered forskellige lipidsammensætninger i chloroform, og tør dem i et glas reagensglas ved hjælp af en nitrogengasstrøm ved RT. Fjern resterende opløsningsmidler ved at placere dem i et vakuumkammer natten over og danne et tyndt lipidlag.
    2. Resuspender lipider og vaskemiddel ved hjælp af en vandbad sonikator.
    3. Sonikere bicelleblandingen i iskølet vand ved hjælp af kontinuerlig effekt, indtil opløsningen bliver gennemsigtig.
      BEMÆRK: Brug høreværn og sørg for tilstrækkelig istilførsel til at holde blandingen i en flydende fase.
    4. Fjern uopløste komponenter med et 0,2 μm centrifugalfilter (se materialetabellen).
      BEMÆRK: Opbevar den aliquoterede bicelleopløsning ved -80 °C.
  2. Opret en protein/bicelleblanding på is ved forsigtigt at kombinere 10% biceller (trin 5.1.4) og proteiner (trin 4.7.4) i forholdet 1:4 (v/v) og opnå en endelig proteinkoncentration mellem 5-10 mg/ml.
  3. Inkuber protein- og bicelleblandingen på is i 30 min.
  4. Opsæt krystalliseringsbetingelser i et hængende dråbedampdiffusionsformat ved hjælp af 48-brøndplader.
    1. Bland lige store mængder (0,5 eller 1 μL) protein/bicelleblanding og krystallisationsbeholderopløsning indeholdende 1,6 M-2,0 M ammoniumsulfat, 100 mM MES (pH 6,5), 0%-4% PEG 400 og 1 mM TCEP (se materialetabel).
      BEMÆRK: Opret en matrix af reservoiropløsningen før hvert eksperiment, justering af ammoniumsulfat (1,6-2,0 M) og PEG 400 (0% -4%).
    2. Der inkuberes til krystallisation ved 20 °C.
    3. Kontroller krystalliseringsbakkerne den næste dag for at sikre korrekt dækglasforsegling.
    4. Overvåg krystalvækst mindst en gang dagligt. Højkvalitetskrystaller vises normalt inden for 1-2 uger og måler 50-150 μm x 20-50 μm x 2-5 μm.
      BEMÆRK: Krystaller kan tage længere tid at danne ved lavere proteinkoncentrationer. Modne krystaller skal høstes inden for en måned.
    5. Sug proteinkrystaller i blød i 0,2 M natriummalonat og lynfrys dem i flydende nitrogen ved hjælp af 50 eller 100 μm kryo-sløjfer.
      BEMÆRK: Hvis et røntgendiffraktometer er tilgængeligt, testes et par krystaller med en 15-30 minutters røntgenstråleeksponering for at afsløre diffraktion op til 5 Å. Diffraktion med højere opløsning kræver en synkrotronlyskilde. Ved hjælp af 0,2 M natriummalonat som kryobeskyttelsesmiddel kan en krystal, der måler 100 μm x 50 μm x 2 μm, give omkring 90 diffraktionsbilledrammer med synkrotronrøntgen.

Representative Results

Rekombinante ABC-halvtransportører, human ABCG5 og ABCG8, udtrykkes sammen i Pichia pastorisgær . Gærmembranfraktionen fraktioneres derefter gennem centrifugering. Som beskrevet i denne protokol ekstraheres de heterodimeriske proteiner ved anvendelse af tandemsøjlekromatografi. Derefter krystalliseres kemisk forbehandlede proteiner ved at inkubere dem med fosfolipid / kolesterolbiceller. Skematiske oversigter over rensnings- og krystalliseringsprocesserne findes i figur 1.

For at vurdere monodispersiteten af de oprensede proteiner farves prøver indeholdende 0,01-0,05 mg / ml proteiner med 1% -2% uranylacetat. Disse prøver undersøges derefter ved hjælp af TEM med negativ plet (figur 2A). For at evaluere proteinstabilitet uden at gennemgå fryse-optøningscyklusser anvendes analytisk gelfiltreringskromatografi. Denne analyse indebærer overvågning af tidsforløbslagring af oprensede proteiner ved anvendelse af små alikvoter af proteinerne i lige store mængder (figur 2B). Der kan være et lille tab af proteiner ved de maksimale fraktioner efter en uges inkubation ved 4 °C, muligvis på grund af restopløselige proteinaggregater. Ikke desto mindre forbliver det samlede proteinudbytte tilstrækkeligt til krystalvækst. Anvendelsen af negativ plet TEM og analytisk gelfiltreringskromatografi er en standardpraksis til vurdering af proteiners egnethed til krystallisering, især fra forskellige konstruerede konstruktioner.

Til vurdering af proteinkvaliteten på hvert trin i søjlekromatografiprocessen såvel som efter den kemiske behandling før krystallisation lægges alikvoter af fraktioner svarende til to Ni-NTA-kolonner, to CBP-søjler, en gelfiltrering og reduktiv alkylering på en 10% SDS-PAGE-gel (figur 3). Derudover kan det samme reaktionsmiljø, der anvendes til alkylering, anvendes til kviksølvmærkning med ethylkviksølv (EMTS), selvom dette ligger uden for rammerne af den aktuelle undersøgelse.

Væksten af krystaller overvåges dagligt ved hjælp af et stereomikroskop udstyret med en polarisator. Krystaller, der er modne og egnede til dataindsamling, opnår generelt dimensioner på 50 μm x 100 μm x 2 μm (figur 4). Under krystalhøstningsprocessen undgås bevidst mindre krystaller eller klynger.

Figure 1
Figur 1: Skematiske oversigter for oprensning (A) og bicellekrystallisation (B) af heterodimerisk ABCG5/G8. Konstruktioner af rekombinante humane ABCG5 (hG5) og ABCG8 (hG8) bærer henholdsvis RGS-H 6-G-H6 og 3C-CBP tags (A, top). Tandemaffinitetssøjlekromatografi efterfulgt af gelfiltreringskromatografi for at opnå heterodimerisk oprensning (A, bund). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Vurdering af monodispersitet (A) og stabilitet (B) af oprensede proteiner . (A) Elektronmikrografi af negativt farvede ABCG5/G8 (G5G8) heterodimerer ved anvendelse af TEM. Repræsentative partikler fremhæves i faste hvide cirkler. Skala bar = 100 nm. B) Alkylerede proteiner opbevaret ved 4 °C analyseret ved analytisk gelfiltreringskromatografi i løbet af en måned med et let proteintab efter en uge. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: SDS-PAGE analyse af proteineluater af søjlekromatografi og reduktiv alkylering. Forskellige volumener (1-10 μL) proteinfraktioner blev lagt på en 10% Tris/Glycine gel og kørte i 45 minutter ved en konstant spænding på 200 V. Gelen blev farvet med Coomassie blå, farvet, lufttørret og scannet af en bordpladescanner. 1° & 2° Ni: første og anden Ni-NTA-kolonne 1° &; 2° CBP: første og anden CBP-kolonne Peak Fractions faste linje: puljede fraktioner til krystallisation; Peak Fractions stiplede linje: skulderfraktioner; EMTS: ethylkviksølvthiosalicynat; IA: iodoacedamid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Vurdering af proteinkrystalmodning ved lysmikroskopi. Modne krystaller af ABCG5 / G8 fra et krystalliseringsfald blev visualiseret under et stereomikroskop udstyret med bordplade og polarisator. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Udfordringerne forbundet med krystallisering af membranproteiner har ført til udvikling af lipid-dobbeltlagsdrevne krystalliseringsmetoder, såsom bicelle27 eller lipidkubisk fase (LCP)14 tilgange. At opnå en vellykket krystallisering af membranproteiner afhænger dog stadig af det kritiske og undertiden flaskehalsede trin i proteinpræparationen. Især ABC-transportører udgør en formidabel forhindring i voksende krystaller, der er egnede til røntgenkrystallografi. Denne protokol giver omfattende praktisk vejledning til strømlining af forberedelsen af human ABCG5/G8 steroltransportør og fremme af krystalvækst gennem bicellekrystalliseringsmetoden.

En vigtig overvejelse ved udarbejdelsen af denne protokol var nødvendigheden af et betydeligt proteinudbytte i de indledende faser af proteinoprensning, hvilket muliggjorde en vis grad af proteintab under prækrystallisationsbehandling (figur 3). Fælles strategier til løsning af denne udfordring involverer omfattende proteinteknik, udnyttelse af forskellige ekspressionsværter og udforskning af ortologer eller homologer, blandt andre tilgange. Ikke desto mindre er der med denne tilsyneladende indviklede procedure identificeret en række afgørende trin, der understøtter protokollens succes og også giver indsigt i potentielle begrænsninger, der kan opstå, når man studerer andre ABC-transportører eller membranproteiner generelt.

For det første anvender denne protokol grundig centrifugering på hvert trin for at minimere proteinaggregering. Derudover er kontinuerlig overvågning af termostabiliteten af de oprensede proteiner afgørende. Elektronmikroskopi bruges til at verificere proteinmonodispersitet, mens analytisk gelfiltrering sporer proteinstabilitet over tid (figur 2). Alternative teknikker som cirkulær dikroisme (CD) eller differentiel scanningskalorimetri (DSC) kunne også indarbejdes. Desuden er inkorporeringen af lipider på specifikke stadier afgørende for at maksimere både aktiviteten og krystallogenesen af den rensede ABCG5/G8. For eksempel er cholat og CHS nødvendige for at udvise målbar ATP-hydrolyse; fosfolipider er uundværlige for at opretholde stabiliteten af methylerede proteiner; og kolesterol er en nødvendig komponent i bicelleopløsningen, der fremmer krystalvækst, der er egnet til røntgendiffraktion med høj opløsning (figur 4).

I det væsentlige kan hele proceduren udføres inden for en uges indsats. I modsætning til LCP er hentning af krystaller fra krystalliseringsbakker med hængende dråbe ligetil. Fremadrettet er denne protokol med et betydeligt proteinudbytte (ca. 10 mg) let at tilpasse til udvikling af krystallografiske undersøgelser, der involverer ABCG5/G8-mutanter eller andre transportørproteiner. Dette er især relevant for tilfælde, der i øjeblikket undgår visualisering gennem elektronmikroskopi.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde er støttet af et Natural Sciences and Engineering Research Council Discovery Grant (RGPIN 2018-04070) og et Canadian Institutes of Health Research Project Grant (PJT-180640) til JYL. Denne protokol er baseret på de oprindelige rapporter i ABCG5/G8 krystalstrukturer rapporteret tidligere af Farhat et al.22 og Lee et al.23.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABCG5 National Institute of Health collection  NCBI accession number NM_022436
ABCG8 National Institute of Health collection  NCBI accession number NM_022437
ÄKTA FPLC system  Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences)
CaCl2 Wisent 600-024-CG Anhydrous
CBP Agilent 214303 Calmodulin binding peptide affinity resin
Centrifugal concentrators (Vivaspin) Sartorius
CHAPSO  Anatrace C317 Anagrade
Cholesterol Anatrace CH200
CHS Steraloids C6823-000
DMAB MilliporeSigma 180238 97%
DMNG Anatrace NG322
DMPC Anatrace D514
DOPC Avanti 850375
DOPC Anatrace D518
DOPE Avanti 850725
DTT Fisher BP172
Dual Thickness MicroLoops MiTeGen
EDTA BioShop EDT003 Disodium salt, dihydrate
EGTA MilliporeSigma 324626
Emulsifier (EmulsiFex-C3) Avestin
Endo H New England Biolabs P0702
Ethanol Greenfield P016EAAN Ethyl Alcohol Anhydrous
Formaldehyde MilliporeSigma 252549 ACS Reagent
Glycerol BioShop GLY004
HEPES BioShop HEP001
HRV-3C protease Homemade
Imidazole BioShop IMD510 Reagent grade
Iodoacetamide MilliporeSigma I1149 BioUltra
Isopropanol Fisher BP2618212
Leupeptin BioShop LEU001
MES MilliporeSigma 69892 BioUltra
Methanol Fisher A412P
MgCl2 Wisent 800-070-CG Hydrated
microfluidizer (LM 20) Microfluidics
NaCl BioShop SOD002
NH4OH Fisher A669-212 ACS Reagent
Ni-NTA superflow Qiagen 30430 Nickel-charged resins
PEG 400 MilliporeSigma 202398
Pepstatin BioShop PEP605
PMSF MilliporeSigma P7626
pSGP18 and pLIC  Homemade (derived from pPICZ, Invitrogen)
SDS BioShop SDS003
Sodium cholate Fisher 229101
Sodium malonate MilliporeSigma 63409
Sucrose Wisent 800-081-WG Ultra pure
Superdex 200 30/100 GL Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences) 28990944 Prepacked gel-filtration column
TCEP
TEM FEI, Technai
Tris Base Fisher BP152
β-DDM Anatrace D310S Sol Grade
β-mercaptoethanol MilliporeSigma
ε-aminocaproic acid Fisher AAA1471936

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hamada, H., Tsuruo, T. Purification of the 170- to 180-kilodalton membrane glycoprotein associated with multidrug resistance. 170- to 180-kilodalton membrane glycoprotein is an ATPase. Journal of Biological Chemistry. 263 (3), 1454-1458 (1988).
  2. Higgins, F., Hiles, D., Whalley, K., Jamieson, J. Nucleotide binding by membrane components of bacterial periplasmic binding protein-dependent transport systems. The EMBO Journal. 4 (4), 1033-1039 (1985).
  3. Higgins, F., et al. A family of related ATP-binding subunits coupled to many distinct biological processes in bacteria. Nature. 323 (6087), 448-450 (1986).
  4. Horio, M., Gottesman, M., Pastan, I. ATP-dependent transport of vinblastine in vesicles from human multidrug-resistant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (10), 3580-3584 (1988).
  5. Mimmack, L., et al. Energy coupling to periplasmic binding protein-dependent transport systems: stoichiometry of ATP hydrolysis during transport in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (21), 8257-8261 (1989).
  6. Grundy, M. Absorption and Metabolism of Dietary Cholesterol. Annual Review of Nutrition. 3 (1), 71-96 (1983).
  7. Berge, E., et al. Accumulation of dietary cholesterol in sitosterolemia caused by mutations in adjacent ABC transporters. Science. 290 (5497), 1771-1775 (2000).
  8. Repa, J., et al. Regulation of ATP-binding cassette sterol transporters ABCG5 and ABCG8 by the Liver X receptors α and β. Journal of Biological Chemistry. 277 (21), 18793-18800 (2002).
  9. Yu, L., et al. Stimulation of cholesterol excretion by the Liver X receptor agonist requires ATP-binding cassette transporters G5 and G8. Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15565-15570 (2003).
  10. Yu, L., et al. Expression of ABCG5 and ABCG8 is required for regulation of biliary cholesterol secretion. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 8742-8747 (2005).
  11. Lütjohann, D., Björkhem, I., Beil, F., von Bergmann, K. Sterol absorption and sterol balance in phytosterolemia evaluated by deuterium-labeled sterols: effect of sitostanol treatment. Journal of Lipid Research. 36 (8), 1763-1773 (1995).
  12. Miettinen, A. Phytosterolaemia, xanthomatosis and premature atherosclerotic arterial disease: a case with high plant sterol absorption, impaired sterol elimination and low cholesterol synthesis. European Journal of Clinical Investigation. 10 (1), 27-35 (1980).
  13. Salen, G., et al. Sitosterolemia. Journal of Lipid Research. 33 (7), 945-955 (1992).
  14. Caffrey, M. Membrane protein crystallization. Journal of Structural Biology. 142 (1), 108-132 (2003).
  15. Michel, H. Crystallization of membrane proteins. Trends in Biochemical Sciences. 8 (2), 56-59 (1983).
  16. Dürr, N., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelleslights up membrane protein structure. Chemical Reviews. 112 (11), 6054 (2012).
  17. Dürr, N., Soong, R., Ramamoorthy, A. When detergent meets bilayer: Birth and coming of age of lipid bicelles. Progress in nuclear magnetic resonance spectroscopy. 69 (1), 1-22 (2013).
  18. Dufourc, J. Bicelles and nanodiscs for biophysical chemistry. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1863 (1), 183478 (2021).
  19. Beaugrand, M., et al. Lipid concentration and molar ratio boundaries for the use of isotropic bicelles. Langmuir. 30 (21), 6162-6170 (2014).
  20. Sanders, R., Schwonek, P. Characterization of magnetically orientable bilayers in mixtures of dihexanoylphosphatidylcholine and dimyristoylphosphatidylcholine by solid-state NMR. Biochemistry. 31 (37), 8898-8905 (1992).
  21. Seddon, M., Curnow, P., Booth, J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  22. Farhat, D., et al. Structural analysis of cholesterol binding and sterol selectivity by ABCG5/G8. Journal of Molecular Biology. 434 (20), 167795 (2022).
  23. Lee, J. Y., et al. Crystal structure of the human sterol transporter ABCG5/ABCG8. Nature. 533 (7604), 561-564 (2016).
  24. Ujwal, R., Bowie, U. Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles. Methods. 55 (4), 337-341 (2011).
  25. Johnson, H., Lee, J. Y., Pickert, A., Urbatsch, L. Bile acids stimulate ATP hydrolysis in the purified cholesterol transporter ABCG5/G8. Biochemistry. 49 (16), 3403-3411 (2010).
  26. Wang, Z., et al. Purification and ATP hydrolysis of the putative cholesterol transporters ABCG5 and ABCG8. Biochemistry. 45 (32), 9929-9939 (2006).
  27. Faham, S. Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature. Protein Science. 14 (3), 836-840 (2005).

Tags

ABCG5/G8 lipidisk bicelle røntgenkrystallografi membranproteiner lipiddobbeltlag vaskemidler stabilitet ensartethed strukturel karakterisering biceller fosfolipider diffraktionskrystaller af høj kvalitet struktur med høj opløsning naturlig kropsbygning funktionalitet tredimensionelle krystaller vaskemiddelopløselige heterodimeriske ABCG5/G8 DMPC/CHAPSO-biceller kolesterol dampdiffusion proteinkrystallisering
ABCG5/G8 krystallisering i et lipidisk bicellemiljø til røntgenkrystallografi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wazir, S., Farhat, D., Srinivasan,… More

Wazir, S., Farhat, D., Srinivasan, M., Lee, J. Y. ABCG5/G8 Crystallization in a Lipidic Bicelle Environment for X-Ray Crystallography. J. Vis. Exp. (198), e65828, doi:10.3791/65828 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter