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Biochemistry

ABCG5/G8 एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए लिपिडिक बाइसेल वातावरण में क्रिस्टलीकरण

Published: August 25, 2023 doi: 10.3791/65828
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, Faculty of Medicine, University of Ottawa, 2Department of Biochemistry, Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta

Summary

यह प्रोटोकॉल स्टेरोल ट्रांसपोर्टर ABCG5/G8 के क्रिस्टलीकरण के लिए एक सेटअप का वर्णन करता है। ABCG5/G8 को हैंगिंग-ड्रॉप क्रिस्टलीकरण के लिए बाइसेल में पुनर्गठित किया जाता है। प्रोटोकॉल विशेष सामग्री या सब्सट्रेट की आवश्यकता नहीं है, यह सुलभ और आसान एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के माध्यम से प्रोटीन संरचना का निर्धारण करने के लिए किसी भी प्रयोगशाला में अनुकूलन करने के लिए कर रही है.

Abstract

एटीपी-बाइंडिंग कैसेट (एबीसी) ट्रांसपोर्टर लिपिड-एम्बेडेड झिल्ली प्रोटीन का गठन करते हैं। लिपिड बाइलेयर से इन झिल्ली प्रोटीन को एक जलीय वातावरण में निकालना आमतौर पर डिटर्जेंट को नियोजित करके प्राप्त किया जाता है। ये डिटर्जेंट लिपिड बाइलेयर को विघटित करते हैं और प्रोटीन को घुलनशील करते हैं। लिपिड बाइलेयर के भीतर झिल्ली प्रोटीन का आंतरिक निवास संरचनात्मक लक्षण वर्णन के समाधान में उनकी स्थिरता और एकरूपता बनाए रखने में एक चुनौती है। बाइसेल, जिसमें लंबी और छोटी श्रृंखला फॉस्फोलिपिड और डिटर्जेंट का मिश्रण होता है, प्राकृतिक लिपिड संरचना को दोहराता है। लिपिड बाइसेल और डिटर्जेंट का उपयोग उच्च गुणवत्ता वाले विवर्तन क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल प्रणाली के रूप में कार्य करता है, विशेष रूप से झिल्ली प्रोटीन की उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारित करने के लिए। इन सिंथेटिक माइक्रोएन्वायरमेंट के माध्यम से, झिल्ली प्रोटीन अपने मूल रचना और कार्यक्षमता को संरक्षित करते हैं, जिससे त्रि-आयामी क्रिस्टल के गठन की सुविधा मिलती है। इस दृष्टिकोण में, डिटर्जेंट-घुलनशील हेटेरोडिमेरिक ABCG5/G8 को कोलेस्ट्रॉल के साथ पूरक DMPC/CHAPSO बाइसेल में पुन: एकीकृत किया गया था। इस सेटअप प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए वाष्प प्रसार प्रयोगात्मक प्रक्रिया में कार्यरत किया गया था.

Introduction

एटीपी-बाइंडिंग कैसेट (एबीसी) ट्रांसपोर्टर्स जैविक झिल्ली 1,2,3,4,5 में विविध एटीपी-निर्भर परिवहन प्रक्रियाओं के लिए जिम्मेदार झिल्ली प्रोटीन का एक सुपरफैमिली बनाते हैं। ये ट्रांसपोर्टर प्रोटीन हृदय रोगों में फंसाए जाते हैं और यकृत में बाद के उत्सर्जन के लिए पित्त को कोलेस्ट्रॉल के प्रवाह को सुविधाजनक बनाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। नतीजतन, कोलेस्ट्रॉल चयापचय और संतुलनने पिछले कुछ वर्षों में काफी रुचि पैदा की है। शरीर से कोलेस्ट्रॉल और अन्य स्टेरोल के उन्मूलन में शामिल एक विशिष्ट तंत्र में मानव एबीसीजी उपपरिवार के सदस्य शामिल हैं, विशेष रूप से हेटेरोडिमेरिक एबीसीजी 5 / इन जीनों में से किसी एक में उत्परिवर्तन हेटेरोडिमर को बाधित करते हैं, जिससे कार्य का नुकसान होता है और साइटोस्टेरोलेमिया होता है, जो स्टेरोल तस्करी11,12,13 को प्रभावित करने वाला विकार है। रोग की प्रासंगिकता और कोलेस्ट्रॉल के प्रवाह को बढ़ावा देने में उनकी भूमिका को देखते हुए, स्टेरोल ट्रांसपोर्टरों ने महत्वपूर्ण ध्यान आकर्षित किया है। फिर भी, उनके आणविक तंत्र और सब्सट्रेट चयनात्मकता का जटिल विवरण काफी हद तक अज्ञात रहता है। इस प्रकार, ABCG5/G8 की क्रिस्टल संरचना की व्याख्या कोलेस्ट्रॉल परिवहन में तंत्र और डाउनस्ट्रीम कार्यों को समझने की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है।

झिल्ली प्रोटीन को मोड़ने और सही ढंग से काम करने के लिए झिल्ली के भीतर लंगर डालने की आवश्यकता होती है। नतीजतन, उनके प्राकृतिक वातावरण से झिल्ली प्रोटीन निकालने अक्सर प्रोटीन अस्थिरता, misfolding, और समारोह14,15 के नुकसान में परिणाम. ये चुनौतियां झिल्ली प्रोटीन क्रिस्टलीकरण में आने वाली प्राथमिक बाधाओं को रेखांकित करती हैं। हालांकि, सिंथेटिक डिटर्जेंट बाइलेयर में प्रोटीन का पुनर्गठन, जैसे बाइसेल, इस दुर्दशा के समाधान के रूप में उभरा है, जिससे एक देशी जैसे बाइलेयर मील16 के भीतर झिल्ली प्रोटीन के रखरखाव को सक्षम किया जा सकता है। बाइसेल सिंथेटिक फॉस्फोलिपिड्स और डिटर्जेंट की असेंबली हैं जो पानी में निलंबित और घुलनशील हैं। विशेष रूप से, वे एक बाइलेयर संरचना को अपनाते हैं जो जैविक झिल्ली16,17,18की नकल करता है। तापमान और चिपचिपाहट के आधार पर बाइसेल तरल और जेल चरणों के बीच संक्रमण कर सकते हैं। बाइसेल क्रिस्टलीकरण छोटे बाइलेयर डिस्क और कम तापमान पर कम चिपचिपाहट को भुनाता है, जिससे प्रोटीन और बाइसेल समाधानों के पूरी तरह से मिश्रण की सुविधा मिलती है। बाइसेल का आकार19,20 की तैयारी के दौरान डिटर्जेंट-टू-लिपिड अनुपात पर निर्भर करता है। बाइसेल गठन के लिए प्रचलित डिटर्जेंट में 3- [(3-कोलामिडोप्रोपाइल) डाइमिथाइलमोनियो] -2-हाइड्रॉक्सी-1-प्रोपेनसल्फोनेट (चैप्सो) शामिल हैं, साथ ही 3- [(3-कोलामिडोप्रोपाइल) डाइमिथाइलमोनियो] -1-प्रोपेनसल्फोनेट (सीएचएपीएस) और 1,2-डिट्रिडेकोयल-एसएन-ग्लिसरॉल-3-फॉस्फोकोलिन (डीएचपीसी)21। इन डिटर्जेंट का उपयोग लिपिड जैसे कि di-myristoyl-phosphatidylcholine (DMPC) और 1-palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylcholine (POPC) के संयोजन में किया जाता है। इसके अलावा, हाल के अध्ययनों ने शारीरिक स्थितियों के तहत बाइसेल के भीतर झिल्ली प्रोटीन की पूर्ण कार्यक्षमता का प्रदर्शन किया है। उदाहरण के लिए, ली और सहयोगियों ने लिपिड बाइलेयर22,23 के आधार पर ABCG5/ABCG8 की क्रिस्टल संरचना को सफलतापूर्वक क्रिस्टलीकृत और रिपोर्ट किया। क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया में, प्रोटीन-बाइसेल मिश्रण को मानक उपकरणों का उपयोग करके समायोजित किया जा सकता है, जिसमें उच्च-थ्रूपुट क्रिस्टलीकरण रोबोट24 शामिल हैं। बाइसेल का उपयोग करने की व्यवहार्यता, हालांकि, उच्च तापमान पर क्रिस्टलीकरण की स्थिति के कारण प्रोटीन की थर्मोस्टेबिलिटी पर टिका है। फिर भी, जब अन्य तकनीकों की तुलना में, झिल्ली प्रोटीन के लिए अपेक्षित क्रिस्टलीकरण की स्थिति आम तौर पर हल्की रहती है, जिसमें अवक्षेप, नमक और बफर की कम सांद्रता शामिल होती है। यह झिल्ली प्रोटीन के संरचनात्मक अध्ययन के लिए प्रोटीन-बाइसेल मिश्रण और वाष्प प्रसार दोनों को प्रभावी और आसानी से लागू करने योग्य उपकरण प्रदान करता है।

यह प्रोटोकॉल उच्च रिज़ॉल्यूशन(चित्रा 1)पर ABCG5/G8 की एक्स-रे क्रिस्टल संरचना का निर्धारण करने के लिए प्रोटीन तैयारी और बाइसेल क्रिस्टलीकरण में आवश्यक चरणों की रूपरेखा तैयार करता है।

Protocol

1. क्लोनिंग और प्रोटीन अभिव्यक्ति

  1. पिछले प्रोटोकॉल 25,26 के बाद पिचिया पास्टरिस खमीर में मानवABCG5/G8 जीन क्लोन. संक्षेप में, pPICZB से pSGP18 और pLIC अभिव्यक्ति वैक्टर प्राप्त करें। एक टैग जोड़ें जो एक राइनोवायरस 3C प्रोटीज साइट को एन्कोड करता है और उसके बाद ABCG8 cDNA (pSGP18-G8-3C-CBP) के सी-टर्मिनस में एक कैलमोडुलिन बाइंडिंग पेप्टाइड (CBP) करता है।
    1. ABCG5 cDNA (pLIC-G5-H12) के सी-टर्मिनस में ग्लाइसिन (उसका 6 ग्लाइहिस6) द्वारा अलग किया गया छह-हिस्टिडाइन टैग जोड़ें। इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग करके प्लास्मिड को पिचिया स्ट्रेन KM71H में सह-रूपांतरित करें।
      नोट: कृपया प्लास्मिड, मीडिया और उपयोग किए गए बफ़र्स के विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।
    2. एमडी अगर प्लेटों पर 28 डिग्री सेल्सियस पर तब्दील खमीर कोशिकाओं बढ़ो.
  2. 1-2 दिनों के बाद, 10-12 कालोनियों का चयन करें और उन्हें छोटे पैमाने पर संस्कृति के लिए 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों का उपयोग करके न्यूनतम ग्लिसरॉल खमीर नाइट्रोजन बेस (एमजीवाई) मीडिया के 10 एमएल में टीका लगाएं।
    1. बेहतर वातन के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूब ढक्कन में तीन छोटे छेद करें। कोशिकाओं को 250 आरपीएम पर लगातार झटकों के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ने की अनुमति दें जब तक कि 600 एनएम (ओडी600) पर ऑप्टिकल घनत्व 10 तक नहीं पहुंच जाता, आमतौर पर 1-2 रात लग जाता है।
      नोट: सेल वृद्धि आमतौर पर 12-24 घंटे के बीच होती है।
  3. अगले दिन, बाँझ एमजीवाई मीडिया के 1 एल ले लो और एक 2.4 एल फ्लास्क में प्राथमिक संस्कृति के साथ टीका लगाना. 24 घंटे के लिए 250 आरपीएम पर एक प्रकार के बरतन इनक्यूबेटर में 28 डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क सेते हैं.
    1. पीएच को 5-6 के बीच बनाए रखने के लिए, पीएच स्थिर होने तक 10% अमोनियम हाइड्रॉक्साइड (एनएच4ओएच) जोड़ें।
  4. पीएच समायोजित करें और 1 एल संस्कृति (0.1% (वी / वी) मेथनॉल) प्रति शुद्ध मेथनॉल के 1 एमएल जोड़कर प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करें।
    नोट: 36-48 घंटे की कुल अवधि के लिए हर 12 घंटे में 5 एमएल शुद्ध मेथनॉल प्रति लीटर संस्कृति (0.5% (वी / वी) मेथनॉल) के साथ बाद में फ़ीड कोशिकाएं।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 15,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजिंग द्वारा हार्वेस्ट कोशिकाओं।
  6. सेल छर्रों लीजिए और उन्हें lysis बफर में फिर से निलंबित (0.33 एम सुक्रोज, 0.3 एम Tris-Cl पीएच 7.5, 0.1 एम aminohexanoic एसिड, 1 मिमी EDTA, और 1 मिमी EGTA) 0.5 ग्राम / एमएल की एकाग्रता के लिए. निलंबन को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। आमतौर पर, कोई सुसंस्कृत कोशिकाओं के 1 एल से 30 ± 5 ग्राम कोशिका द्रव्यमान को पुनर्प्राप्त कर सकता है।
    नोट: सेल छर्रों को सीधे फ्रीजर में स्टोर करें या झिल्ली की तैयारी के लिए लिसिस बफर में तत्काल निलंबन करें।

2. माइक्रोसोमल झिल्ली की तैयारी

  1. कोशिकाओं को पिघलाएं और प्रोटीज इनहिबिटर (2 μg/mL leupeptin, 2 μg/mL pepstatin A, 2 mM PMSF, सामग्री की तालिकादेखें) जोड़ें।
    1. कोशिकाओं को और अधिक लाइज़ करने के लिए, 25,000-30,000 साई पर एक बर्फ-ठंडा पायसीकारी या माइक्रोफ्लुइडाइज़र ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें। इस प्रक्रिया को 3-4 बार दोहराएं।
    2. सेल मलबे को हटाने के लिए अपकेंद्रित्र: 15 मिनट के लिए 3,500-4,000 x ग्राम पर स्पिन, 30 मिनट के लिए 15,000 x ग्राम पर एक दूसरे स्पिन के बाद। 4 डिग्री सेल्सियस पर दोनों स्पिन बनाए रखें।
  2. माइक्रोसोमल झिल्ली पुटिकाओं को अलग करने के लिए, सतह पर तैरनेवाला को अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 घंटे के लिए 2,00,000 x ग्राम पर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के अधीन करें।
    1. एक dounce homogenizer का उपयोग कर बफर एक (50 मिमी Tris-Cl पीएच 8.0, 100 मिमी NaCl, और 10% ग्लिसरॉल) के 50 एमएल में झिल्ली गोली resuspend. निलंबन को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. प्रोटीन की तैयारी-हेटेरोडिमर्स की शुद्धि

  1. जमे हुए माइक्रोसोमल झिल्ली को पिघलाएं, और घुलनशीलता बफर का उपयोग करके एकाग्रता को 4-6 मिलीग्राम/एमएल में समायोजित करें। बफर में 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8.0, 100 एमएम एनएसीएल, 10% ग्लिसरॉल, 1% (डब्ल्यू / वी) β-डोडेसिल माल्टोसाइड (β-डीडीएम), 0.5% (डब्ल्यू / वी) कोलेट, 0.1% (डब्ल्यू / वी) कोलेस्टेरिल हेमिसुकेट (सीएचएस), 5 एमएम इमिडाज़ोल, 5 एमएम β-मर्कैप्टोथेनॉल (β-एमई), 2 माइक्रोग्राम / एमएल ल्यूपेप्टिन, 2 माइक्रोग्राम / एमएल पेप्स्टैटिन ए, और 2 एमएम पीएमएसएफ ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    नोट: एक झिल्ली की तैयारी और घुलनशीलता बफर के बराबर मात्रा मिश्रण कर सकते हैं, या प्रोटीज अवरोधकों और एजेंटों को कम करने के बिना 2x घुलनशीलता बफर का उपयोग कर सकते हैं। बफर का छोटा उबलना सीएचएस को कुशलता से भंग करने में मदद करता है। शुद्धिकरण के लिए, केवल 4 डिग्री सेल्सियस ठंडा बफर का उपयोग करें.
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मध्यम गति पर मिश्रण हिलाओ। 20-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर अतिरिक्त सरगर्मी के साथ इस का पालन करें.
    2. अघुलनशील झिल्ली को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 1,00,000 x ग्राम पर मिश्रण अपकेंद्रित्र. घुलनशील सतह पर तैरनेवाला लीजिए और 20 मिमी imidazole और 0.1 मिमी TCEP जोड़ें।
  2. आत्मीयता स्तंभ क्रोमैटोग्राफी26 प्रदर्शन: बफर एक (2.2.1 कदम) रात भर में पूर्व equilibrated नी-एनटीए मोती (10-15 एमएल) ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए घुलनशील सतह पर तैरनेवाला बाँध.
    नोट: इस बिंदु से आगे बफ़र्स चलाने में ग्लिसरॉल का उपयोग करने से बचें।
    1. बफर बी (50 एमएम एचईपीईएस, पीएच 7.5, 100 एमएम एनएसीएल, 0.1% (डब्ल्यू/वी) β-डीडीएम, 0.05% (डब्ल्यू/वी) चोलेट, 0.01% (डब्ल्यू/वी) सीएचएस, 0.1 एमएम टीसीईपी) के 10 कॉलम वॉल्यूम के साथ कॉलम को दो बार धोएं जिसमें 25 एमएम इमिडाज़ोल होता है।
    2. 50 मिमी इमिडाज़ोल युक्त बफर बी के 10 स्तंभ संस्करणों के साथ स्तंभ धो लें।
    3. बफर सी (200 एमएम इमिडाज़ोल के साथ बफर बी) का उपयोग करके प्रोटीन को एल्यूट करें।
    4. एल्यूटेड प्रोटीन में 1 एमएम टीसीईपी ( सामग्री की तालिकादेखें) और 10 एमएम एमजीसीएल2 जोड़ें।
    5. सही प्रोटीन आकार26 की पुष्टि करने के लिए एक एसडीएस-पेज जेल पर eluted अंशों को मान्य करें.
      नोट: विशिष्ट प्रोटीन उपज (1सेंट नी-एनटीए): 6 एल संस्कृति प्रति 10-20 मिलीग्राम प्रोटीन। इसकी महत्वपूर्ण मिसेल एकाग्रता (सीएमसी) के 10x या 5x पर डीडीएम का उपयोग करें, लगभग 0.01%। यह प्रोटोकॉल 0.1% डीडीएम को नियोजित करता है।
    6. बफर डी 1 (1 एमएम सीएसीएल 2, 1 एमएम एमजीसीएल2 के साथ बफर बी) की बराबर मात्रा के साथ नी-एनटीए क्षालन से शिखर अंशों को पतला करें, मिश्रण करें, और सीबीपी कॉलम (3-5 एमएल) पर प्रोटीन अंशों को लोड करें (सामग्री की तालिका) जिसे सीबीपी वॉश बफर डी 1 के साथ पूर्व-संतुलित किया गया है।
    7. बफर डी 1 और डी 2 (1 एमएम सीएसीएल2, 1 एमएम एमजीसीएल2, 0.1% (डब्ल्यू / वी) डेसिल-माल्टोज नियोपेंटाइल ग्लाइकोल (डीएमएनजी) के साथ बफर बी, β-डीडीएम के बिना) का उपयोग करके डिटर्जेंट का आदान-प्रदान करने के लिए सीबीपी कॉलम पर अनुक्रमिक वॉश करें: सबसे पहले, डी 1 के 3 कॉलम वॉल्यूम के साथ धोएं; दूसरा, D1:D2 (3:1, v/v) के 3 कॉलम वॉल्यूम से धोएं; तीसरा, D1: D2 (1: 1, v/v) के 3 कॉलम वॉल्यूम के साथ धोएं; चौथा चरण, D1:D2 (1:3, v/v) के 3 कॉलम वॉल्यूम के साथ धोएं, इसके बाद D2 के 6-10 कॉलम वॉल्यूम हैं।
    8. सीबीपी कॉलम (कुल 10 एमएल) से 1 एमएल अंशों में 300 एमएम एनएसीएल के साथ सीबीपी वॉश बफर डी 2 का उपयोग करके प्रोटीन को एल्यूट करें। एल्यूटेड अंशों को 1-2 एमएल तक केंद्रित करें।
      नोट: ठेठ प्रोटीन उपज (1सेंट सीबीपी) 6 एल संस्कृति प्रति 5-15 मिलीग्राम प्रोटीन है। माल्टोस नियोपेंटाइल ग्लाइकोल (एमएनजी) डिटर्जेंट 4 डिग्री सेल्सियस पर शुद्ध प्रोटीन भंडारण को बढ़ाते हैं। डीएमएनजी और लॉरिल एमएनजी (एलएमएनजी) दोनों का उपयोग किया गया था, जिसमें डीएमएनजी बेहतर एक्स-रे डिफ्रेक्टिंग क्रिस्टल पैदा करता था। इसकी महत्वपूर्ण मिसेल एकाग्रता (सीएमसी) के 10-20x पर डीएमएनजी का उपयोग करें, लगभग 0.003%। इस प्रोटोकॉल ने 0.1% DMNG का उपयोग किया। सीबीपी एल्यूएट के एक अंश को जेल-निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी (चरण 4.4.) द्वारा प्रोटीन की एटीपीस गतिविधि का विश्लेषण करने या ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) के माध्यम से मोनो-फैलाव का आकलन करने के लिए शुद्ध किया जा सकता है।

4. प्रोटीन की तैयारी-पूर्व-क्रिस्टलीकरण उपचार

  1. एंडोग्लाइकोसिडेस एच (एंडो एच, ~ 0.2 मिलीग्राम प्रति 10-15 मिलीग्राम शुद्ध प्रोटीन) और एचआरवी -3 सी प्रोटीज (~ 2 मिलीग्राम प्रति 10-15 मिलीग्राम शुद्ध प्रोटीन) का उपयोग करके एन-लिंक्ड ग्लाइकान और सीबीपी टैग को क्लीव करें, क्रमशः ( सामग्री की तालिकादेखें)। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं.
  2. एंडो एच और 3 सी प्रोटीज इनक्यूबेशन के दौरान, पूल किए गए प्रोटीन पर रिडक्टिव अल्काइलेशन करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 20 मिमी iodoacetamide ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ सेते द्वारा शुरू करें. बर्फ पर एक अतिरिक्त 2 मिमी iodoacetamide के साथ एक 1 घंटे इनक्यूबेशन के साथ इस का पालन करें.
    नोट: यह कदम आगे 4 डिग्री सेल्सियस पर एक महीने तक प्रोटीन भंडारण को स्थिर करता है।
  3. क्लीव्ड सीबीपी टैग को अलग करने के लिए एक दूसरे सीबीपी कॉलम (1-2 एमएल) को नियोजित करें। इस प्रक्रिया के लिए बफर डी 2 का उपयोग करें।
    नोट: ठेठ प्रोटीन उपज (2एन डी सीबीपी) 6 एल संस्कृति प्रति 5-10 मिलीग्राम प्रोटीन है।
  4. जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके सीबीपी टैग मुक्त प्रोटीन को शुद्ध करें। बफर में 10 एमएम एचईपीईएस, पीएच 7.5, 100 एमएम एनएसीएल, 0.1% (डब्ल्यू/वी) डीएमएनजी, 0.05% (डब्ल्यू/वी) कोलेट और 0.01% (डब्ल्यू/वी) सीएचएस होना चाहिए।
    नोट: ठेठ प्रोटीन उपज (जेल-निस्पंदन) 6 एल संस्कृति प्रति 2-8 मिलीग्राम प्रोटीन है। इस चरण के दौरान, जेल निस्पंदन के दौरान डीडीएम पीक (~ 65 केडी) की अनुपस्थिति डीएमएनजी के लिए सफल डिटर्जेंट एक्सचेंज को इंगित करती है।
  5. रिडक्टिव मिथाइलेशन के माध्यम से पूल किए गए प्रोटीन अंशों को संशोधित करें: प्रोटीन में 20 एमएम डाइमिथाइलमाइन बोरेन (डीएमएबी, सामग्री की तालिकादेखें) और 40 एमएम फॉर्मलाडेहाइड जोड़ें। एक दोलन प्रकार के बरतन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते हैं. 10 मिमी डीएमएबी जोड़ें।
    1. 10 मिमी डीएमएबी के अलावा सहित 4.5 कदम दोहराएं, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात (12-18 एच) इनक्यूबेट करें।
    2. 100 मिमी Tris-Cl, पीएच 7.5 जोड़कर प्रतिक्रिया रोकें।
  6. मिथाइलेटेड प्रोटीन को 2 एमएल नी-एनटीए कॉलम पर 100 एमएम ट्रिस-सीएल, पीएच 8.0 और 100 एमएम एनएसीएल के साथ पूर्व-संतुलित करें।
    1. वॉश बफर (10 एमएम एचईपीईएस, पीएच 7.5, 100 एमएम एनएसीएल, 0.5 मिलीग्राम/एमएल डीओपीसी के साथ) के 10 कॉलम वॉल्यूम का उपयोग करके कॉलम को धोएं: डोप (3: 1, डब्ल्यू / डब्ल्यू), 0.1% (डब्ल्यू / वी) डीएमएनजी, 0.05% (डब्ल्यू / वी) चोलेट, 0.01% (डब्ल्यू / वी) सीएचएस)।
    2. क्षालन बफर (10 एमएम एचईपीईएस, पीएच 7.5, 100 एमएम एनएसीएल, 200 एमएम इमिडाजोल, 0.5 मिलीग्राम/एमएल डीओपीसी: डोप (1:1, डब्ल्यू/डब्ल्यू), 0.1% (डब्ल्यू/वी) डीएमएनजी, 0.05% (डब्ल्यू/वी) चोलेट, 0.01% (डब्ल्यू/वी) सीएचएस) का उपयोग करके रिलिपिडेटेड प्रोटीन को एल्यूट करें।
      नोट: ठेठ प्रोटीन उपज (2एन डी नी-एनटीए) 6 एल संस्कृति प्रति 1-5 मिलीग्राम प्रोटीन है।
    3. पास प्रोटीन एक पीडी -10 desalting स्तंभ के माध्यम से चरण 4.4 में इस्तेमाल बफर के साथ पूर्व संतुलित elurates.
  7. ~ 20 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता के लिए कोलेस्ट्रॉल (आइसोप्रोपेनॉल या इथेनॉल में तैयार) के साथ रातोंरात डिसाल्टेड और रिलिपिडेटेड प्रोटीन को इनक्यूबेट करें।
    1. अगली सुबह, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,50,000 x ग्राम पर ultracentrifugation द्वारा अवक्षेप हटा दें। सतह पर तैरनेवाला ले लीजिए.
    2. एक 100 केडीए cutoff केन्द्रापसारक सांद्रक का उपयोग कर 30-50 मिलीग्राम / एमएल की एक अंतिम एकाग्रता के लिए प्रोटीन एकाग्र.
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए शीर्ष गति पर एक benchtop प्रशीतित अपकेंद्रित्र का उपयोग कर अवक्षेप निकालें.
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर सतह पर तैरनेवाला रखें और bicelles में क्रिस्टलीकरण की स्थिति की स्थापना.
      नोट: केंद्रित प्रोटीन एक सप्ताह के भीतर क्रिस्टल विकास के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। प्रोटीन को फ्रीज न करें।

5. बाइसेल में प्रोटीन क्रिस्टलीकरण

  1. DMPC लिपिड और CHAPSO डिटर्जेंट के साथ 3:1 (w/w) अनुपात में 10% बाइसेल स्टॉक समाधान तैयार करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    नोट: CHAPSO का उपयोग इसकी महत्वपूर्ण मिसेल एकाग्रता (CMC) के 5x पर, लगभग 0.5%। यह प्रोटीन-बाइसेल मिश्रण (चरण 5.2) में अपने सीएमसी के आसपास डिटर्जेंट एकाग्रता को बनाए रखता है।
    1. पूर्व-सूखे लिपिड (5 mol% कोलेस्ट्रॉल और 95 mol% DMPC का मिश्रण) में विआयनीकृत एच2ओ-घुलित डिटर्जेंट (CHAPSO) जोड़ें।
      नोट: क्लोरोफॉर्म में विभिन्न लिपिड रचनाएं तैयार करें, और आरटी पर नाइट्रोजन गैस स्ट्रीम का उपयोग करके उन्हें ग्लास टेस्ट ट्यूब में सुखाएं।
    2. एक पानी स्नान sonicator का उपयोग लिपिड और डिटर्जेंट resuspension.
    3. बाइसेल मिश्रण को बर्फ-ठंडा पानी में निरंतर शक्ति का उपयोग करके सोनिकेट करें जब तक कि समाधान पारदर्शी न हो जाए।
      नोट: श्रवण सुरक्षा का उपयोग करें और मिश्रण को तरल चरण में रखने के लिए पर्याप्त बर्फ की आपूर्ति सुनिश्चित करें।
    4. एक 0.2 माइक्रोन केन्द्रापसारक फिल्टर ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ अघुलनशील घटकों निकालें.
      नोट: -80 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोटेड बाइसेल समाधान स्टोर करें।
  2. धीरे एक 1:4 (वी / वी) अनुपात में 10% bicelles (कदम 5.1.4) और प्रोटीन (4.7.4) के संयोजन से बर्फ पर एक प्रोटीन / bicelle मिश्रण बनाएँ, 5-10 मिलीग्राम / एमएल के बीच एक अंतिम प्रोटीन एकाग्रता प्राप्त करने.
  3. 30 मिनट के लिए बर्फ पर प्रोटीन और bicelle मिश्रण सेते हैं.
  4. 48-अच्छी प्लेटों का उपयोग करके एक फांसी ड्रॉप वाष्प प्रसार प्रारूप में क्रिस्टलीकरण की स्थिति स्थापित करें।
    1. प्रोटीन/बाइसेल मिश्रण और क्रिस्टलीकरण जलाशय समाधान के बराबर मात्रा (0.5 या 1 माइक्रोन) मिलाएं जिसमें 1.6 एम-2.0 एम अमोनियम सल्फेट, 100 एमएम एमईएस (पीएच 6.5), 0% -4% पीईजी 400, और 1 एमएम टीसीईपी ( सामग्री की तालिकादेखें)।
      नोट: प्रत्येक प्रयोग से पहले जलाशय समाधान का एक मैट्रिक्स बनाएं, अमोनियम सल्फेट (1.6-2.0 एम) और खूंटी 400 (0% -4%) का समायोजन।
    2. 20 डिग्री सेल्सियस पर क्रिस्टलीकरण के लिए सेते हैं।
    3. उचित कवर ग्लास सीलिंग सुनिश्चित करने के लिए अगले दिन क्रिस्टलीकरण ट्रे की जाँच करें।
    4. प्रतिदिन कम से कम एक बार क्रिस्टल विकास की निगरानी करें। उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टल आमतौर पर 1-2 सप्ताह के भीतर दिखाई देते हैं, जिनकी माप 50-150 माइक्रोन x 20-50 माइक्रोन x 2-5 माइक्रोन होती है।
      नोट: क्रिस्टल कम प्रोटीन सांद्रता पर फार्म करने के लिए अधिक समय लग सकता है. परिपक्व क्रिस्टल को एक महीने के भीतर काटा जाना चाहिए।
    5. 0.2 एम सोडियम मैलोनेट में प्रोटीन क्रिस्टल भिगोएँ और फ्लैश 50 या 100 माइक्रोन क्रायो-लूप का उपयोग करके तरल नाइट्रोजन में उन्हें फ्रीज करें।
      नोट: यदि एक्स-रे डिफ्रेक्टोमीटर उपलब्ध है, तो 5 ए तक विवर्तन प्रकट करने के लिए 15-30 मिनट एक्स-रे बीम एक्सपोजर के साथ कुछ क्रिस्टल का परीक्षण करें। उच्च-रिज़ॉल्यूशन विवर्तन के लिए एक सिंक्रोट्रॉन प्रकाश स्रोत की आवश्यकता होती है। क्रायो-प्रोटेक्टेंट के रूप में 0.2 एम सोडियम मैलोनेट का उपयोग करते हुए, 100 माइक्रोन x 50 माइक्रोन x 2 माइक्रोन मापने वाला क्रिस्टल सिंक्रोट्रॉन एक्स-रे के साथ लगभग 90 विवर्तन छवि फ्रेम प्रदान कर सकता है।

Representative Results

पुनः संयोजक एबीसी आधा ट्रांसपोर्टर्स, मानव एबीसीजी 5, और एबीसीजी 8, पिचिया पास्टोरिस खमीर में सह-व्यक्त किए जाते हैं। खमीर झिल्ली अंश को तब सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से विभाजित किया जाता है। जैसा कि इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित है, हेटेरोडिमेरिक प्रोटीन अग्रानुक्रम स्तंभ क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके निकाले जाते हैं। इसके बाद, रासायनिक रूप से पूर्व-उपचारित प्रोटीन को फॉस्फोलिपिड/कोलेस्ट्रॉल बाइसेल के साथ ऊष्मायन करके क्रिस्टलीकृत किया जाता है। शुद्धि और क्रिस्टलीकरण प्रक्रियाओं के योजनाबद्ध अवलोकन चित्रा 1 में प्रदान किए जाते हैं.

शुद्ध प्रोटीन की मोनोडिस्पर्सिटी का आकलन करने के लिए, प्रोटीन के 0.01-0.05 मिलीग्राम/एमएल वाले नमूने 1% -2% यूरेनिल एसीटेट से सने होते हैं। इन नमूनों तो नकारात्मक दाग मंदिर (चित्रा 2 ए) का उपयोग कर जांच कर रहे हैं. फ्रीज-पिघलना चक्रों से गुजरने के बिना प्रोटीन स्थिरता का मूल्यांकन करने के लिए, विश्लेषणात्मक जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी कार्यरत है। इस विश्लेषण में प्रोटीन के छोटे, समान-मात्रा वाले एलिकोट्स(चित्रा 2बी)के उपयोग के माध्यम से शुद्ध प्रोटीन के समय-पाठ्यक्रम भंडारण की निगरानी करना शामिल है। 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के एक सप्ताह के बाद चोटी अंशों पर प्रोटीन का मामूली नुकसान हो सकता है, संभवतः अवशिष्ट घुलनशील प्रोटीन समुच्चय के कारण। बहरहाल, क्रिस्टल विकास के लिए समग्र प्रोटीन उपज पर्याप्त रहती है। नकारात्मक दाग टीईएम और विश्लेषणात्मक जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी का उपयोग क्रिस्टलीकरण के लिए प्रोटीन की उपयुक्तता का आकलन करने के लिए एक मानक अभ्यास है, विशेष रूप से विभिन्न इंजीनियर निर्माणों से।

कॉलम क्रोमैटोग्राफी प्रक्रिया के प्रत्येक चरण में प्रोटीन की गुणवत्ता के आकलन के लिए, साथ ही पूर्व-क्रिस्टलीकरण रासायनिक उपचार के बाद, दो नी-एनटीए कॉलम, दो सीबीपी कॉलम, एक जेल निस्पंदन, और रिडक्टिव अल्काइलेशन के अनुरूप अंशों के विभाज्य 10% एसडीएस-पेज जेल(चित्रा 3)पर लोड किए जाते हैं। इसके अतिरिक्त, अल्काइलेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले समान प्रतिक्रिया वातावरण को एथिल पारा (ईएमटीएस) के साथ पारा लेबलिंग के लिए लागू किया जा सकता है, हालांकि यह वर्तमान अध्ययन के दायरे से परे है।

पोलराइज़र से लैस टेबलटॉप स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करके क्रिस्टल की वृद्धि की दैनिक निगरानी की जाती है। क्रिस्टल जो परिपक्व होते हैं और डेटा संग्रह के लिए उपयुक्त होते हैं, आम तौर पर 50 माइक्रोन x 100 माइक्रोन x 2 माइक्रोन(चित्रा 4)के आयाम प्राप्त करते हैं। क्रिस्टल कटाई प्रक्रिया के दौरान, छोटे क्रिस्टल या क्लस्टर से जानबूझकर बचा जाता है।

Figure 1
चित्रा 1: हेटेरोडिमेरिक एबीसीजी 5/जी 8 के शुद्धिकरण (ए) और बाइसेल क्रिस्टलीकरण (बी) के लिए योजनाबद्ध अवलोकन। पुनः संयोजक मानव ABCG5 (hG5) और ABCG8 (hG8) के निर्माण क्रमशः RGS-H 6-G-H6 और 3C-CBP टैग (A, शीर्ष) ले जाते हैं। अग्रानुक्रम आत्मीयता स्तंभ क्रोमैटोग्राफी, हेटेरोडिमेरिक शुद्धि (ए, नीचे) को प्राप्त करने के लिए जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी के बाद। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: शुद्ध प्रोटीन की मोनो-फैलाव (ए) और स्थिरता (बी) का मूल्यांकन। (ए) टीईएम का उपयोग करके नकारात्मक रूप से सना हुआ ABCG5/G8 (G5G8) हेटेरोडिमर्स का इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ। प्रतिनिधि कणों को ठोस सफेद हलकों में हाइलाइट किया जाता है। स्केल बार = 100 एनएम। (बी) एक सप्ताह के बाद प्रोटीन की मामूली हानि के साथ एक महीने के दौरान विश्लेषणात्मक जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी द्वारा विश्लेषण किए गए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत अल्काइलेटेड प्रोटीन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: कॉलम क्रोमैटोग्राफी और रिडक्टिव अल्काइलेशन के प्रोटीन एल्यूट्स का एसडीएस-पेज विश्लेषण। प्रोटीन अंशों के विभिन्न संस्करणों (1-10 माइक्रोन) को 10% ट्रिस/ग्लाइसिन जेल पर लोड किया गया था और 200 वी के निरंतर वोल्टेज पर 45 मिनट के लिए चलाया गया था। जेल को कूमासी नीले, निराधार, हवा में सुखाए जाने और टेबलटॉप स्कैनर द्वारा स्कैन किया गया था। 1° & 2° Ni: पहला और दूसरा Ni-NTA कॉलम; 1° और 2° CBP: पहला और दूसरा CBP कॉलम; पीक अंश ठोस रेखा: क्रिस्टलीकरण के लिए जमा अंश; पीक फ्रैक्शन धराशायी रेखा: कंधे के अंश; EMTS: एथिल पारा थियोसैलिसिनेट; आईए: आयोडोसेडामाइड। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रोटीन क्रिस्टल परिपक्वता का आकलन। क्रिस्टलीकरण ड्रॉप से ABCG5/G8 के परिपक्व क्रिस्टल को टेबलटॉप और पोलराइज़र से लैस स्टीरियो माइक्रोस्कोप के नीचे देखा गया था। स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

क्रिस्टलीकरण झिल्ली प्रोटीन से जुड़ी चुनौतियों ने लिपिड-बाइलेयर-संचालित क्रिस्टलीकरण विधियों के विकास को प्रेरित किया है, जैसे कि बाइसेल27 या लिपिड क्यूबिक चरण (एलसीपी)14 दृष्टिकोण। हालांकि, झिल्ली प्रोटीन के सफल क्रिस्टलीकरण को प्राप्त करना अभी भी प्रोटीन की तैयारी के महत्वपूर्ण और कभी-कभी अड़चन वाले कदम पर टिका है। विशेष रूप से, एबीसी ट्रांसपोर्टर एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए उपयुक्त बढ़ते क्रिस्टल में एक दुर्जेय बाधा पेश करते हैं। यह प्रोटोकॉल मानव ABCG5/G8 स्टेरोल ट्रांसपोर्टर की तैयारी को सुव्यवस्थित करने और बाइसेल क्रिस्टलीकरण दृष्टिकोण के माध्यम से क्रिस्टल विकास को बढ़ावा देने के लिए व्यापक हाथों पर मार्गदर्शन प्रदान करता है।

इस प्रोटोकॉल को तैयार करने में एक महत्वपूर्ण विचार प्रोटीन शुद्धि के प्रारंभिक चरणों में पर्याप्त प्रोटीन उपज के लिए अनिवार्य था, जो पूर्व-क्रिस्टलीकरण उपचार(चित्रा 3)के दौरान प्रोटीन हानि की एक निश्चित डिग्री की अनुमति देता है। इस चुनौती को संबोधित करने के लिए सामान्य रणनीतियों में व्यापक प्रोटीन इंजीनियरिंग, विविध अभिव्यक्ति मेजबानों का उपयोग, और अन्य दृष्टिकोणों के बीच ऑर्थोलॉग या होमोलॉग की खोज शामिल है। फिर भी, इस प्रतीत होता है जटिल प्रक्रिया के साथ, महत्वपूर्ण कदम है कि प्रोटोकॉल की सफलता को कम और भी संभावित सीमाओं है कि जब अन्य एबीसी ट्रांसपोर्टरों या सामान्य में झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन कर उत्पन्न हो सकता है में अंतर्दृष्टि प्रदान की पहचान की गई है.

सबसे पहले, इस प्रोटोकॉल प्रोटीन एकत्रीकरण को कम करने के लिए प्रत्येक कदम पर पूरी तरह से centrifugation रोजगार. इसके अतिरिक्त, शुद्ध प्रोटीन की थर्मोस्टेबिलिटी की निरंतर निगरानी महत्वपूर्ण है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग प्रोटीन मोनोडिस्पर्सिटी को सत्यापित करने के लिए किया जाता है, जबकि विश्लेषणात्मक जेल निस्पंदन समय के साथ प्रोटीन स्थिरता को ट्रैक करता है (चित्र 2)। परिपत्र डाइक्रोइज्म (सीडी) या अंतर स्कैनिंग कैलोरीमेट्री (डीएससी) जैसी वैकल्पिक तकनीकों को भी शामिल किया जा सकता है। इसके अलावा, विशिष्ट चरणों में लिपिड का समावेश शुद्ध ABCG5/G8 की गतिविधि और क्रिस्टलोजेनेसिस दोनों को अधिकतम करने के लिए आवश्यक है। उदाहरण के लिए, औसत दर्जे का एटीपी हाइड्रोलिसिस प्रदर्शित करने के लिए कोलेट और सीएचएस आवश्यक हैं; फॉस्फोलिपिड्स मिथाइलेटेड प्रोटीन की स्थिरता बनाए रखने के लिए अपरिहार्य हैं; और कोलेस्ट्रॉल बाइसेल समाधान का एक आवश्यक घटक है, जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन एक्स-रे विवर्तन(चित्रा 4)के लिए उपयुक्त क्रिस्टल विकास को बढ़ावा देता है।

संक्षेप में, पूरी प्रक्रिया को एक सप्ताह के प्रयास के भीतर पूरा किया जा सकता है। एलसीपी के विपरीत, हैंगिंग-ड्रॉप क्रिस्टलीकरण ट्रे से क्रिस्टल की पुनर्प्राप्ति सीधी है। आगे देख रहे हैं, एक पर्याप्त प्रोटीन उपज (लगभग 10 मिलीग्राम) के साथ, इस प्रोटोकॉल ABCG5/G8 म्यूटेंट या अन्य ट्रांसपोर्टर प्रोटीन शामिल क्रिस्टलोग्राफिक जांच के विकास के लिए आसानी से अनुकूलनीय है. यह उन मामलों के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है जो वर्तमान में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से विज़ुअलाइज़ेशन से बचते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम एक प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद डिस्कवरी ग्रांट (RGPIN 2018-04070) और JYL को एक कनाडाई स्वास्थ्य अनुसंधान परियोजना अनुदान (PJT-180640) द्वारा समर्थित है। यह प्रोटोकॉल ABCG5/G8 क्रिस्टल संरचनाओं में मूल रिपोर्टों पर आधारित है, जो पहले फरहत एट अल.22 और ली एट अल.23 द्वारा रिपोर्ट की गई थीं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABCG5 National Institute of Health collection  NCBI accession number NM_022436
ABCG8 National Institute of Health collection  NCBI accession number NM_022437
ÄKTA FPLC system  Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences)
CaCl2 Wisent 600-024-CG Anhydrous
CBP Agilent 214303 Calmodulin binding peptide affinity resin
Centrifugal concentrators (Vivaspin) Sartorius
CHAPSO  Anatrace C317 Anagrade
Cholesterol Anatrace CH200
CHS Steraloids C6823-000
DMAB MilliporeSigma 180238 97%
DMNG Anatrace NG322
DMPC Anatrace D514
DOPC Avanti 850375
DOPC Anatrace D518
DOPE Avanti 850725
DTT Fisher BP172
Dual Thickness MicroLoops MiTeGen
EDTA BioShop EDT003 Disodium salt, dihydrate
EGTA MilliporeSigma 324626
Emulsifier (EmulsiFex-C3) Avestin
Endo H New England Biolabs P0702
Ethanol Greenfield P016EAAN Ethyl Alcohol Anhydrous
Formaldehyde MilliporeSigma 252549 ACS Reagent
Glycerol BioShop GLY004
HEPES BioShop HEP001
HRV-3C protease Homemade
Imidazole BioShop IMD510 Reagent grade
Iodoacetamide MilliporeSigma I1149 BioUltra
Isopropanol Fisher BP2618212
Leupeptin BioShop LEU001
MES MilliporeSigma 69892 BioUltra
Methanol Fisher A412P
MgCl2 Wisent 800-070-CG Hydrated
microfluidizer (LM 20) Microfluidics
NaCl BioShop SOD002
NH4OH Fisher A669-212 ACS Reagent
Ni-NTA superflow Qiagen 30430 Nickel-charged resins
PEG 400 MilliporeSigma 202398
Pepstatin BioShop PEP605
PMSF MilliporeSigma P7626
pSGP18 and pLIC  Homemade (derived from pPICZ, Invitrogen)
SDS BioShop SDS003
Sodium cholate Fisher 229101
Sodium malonate MilliporeSigma 63409
Sucrose Wisent 800-081-WG Ultra pure
Superdex 200 30/100 GL Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences) 28990944 Prepacked gel-filtration column
TCEP
TEM FEI, Technai
Tris Base Fisher BP152
β-DDM Anatrace D310S Sol Grade
β-mercaptoethanol MilliporeSigma
ε-aminocaproic acid Fisher AAA1471936

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References

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ABCG5/G8 लिपिडिक बाइसेल एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी झिल्ली प्रोटीन लिपिड बाइलेयर डिटर्जेंट स्थिरता एकरूपता संरचनात्मक लक्षण वर्णन बाइसेल फॉस्फोलिपिड उच्च गुणवत्ता वाले विवर्तन क्रिस्टल उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना मूल रचना कार्यक्षमता त्रि-आयामी क्रिस्टल डिटर्जेंट-घुलनशील हेटेरोडिमेरिक ABCG5/G8 DMPC/CHAPSO बाइसेल कोलेस्ट्रॉल वाष्प प्रसार प्रोटीन क्रिस्टलीकरण
ABCG5/G8 एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए लिपिडिक बाइसेल वातावरण में क्रिस्टलीकरण
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Wazir, S., Farhat, D., Srinivasan, M., Lee, J. Y. ABCG5/G8 Crystallization in a Lipidic Bicelle Environment for X-Ray Crystallography. J. Vis. Exp. (198), e65828, doi:10.3791/65828 (2023).

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