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Biochemistry

X선 결정학을 위한 지질 이중세포 환경에서의 ABCG5/G8 결정화

Published: August 25, 2023 doi: 10.3791/65828
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, Faculty of Medicine, University of Ottawa, 2Department of Biochemistry, Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta

Summary

이 프로토콜은 스테롤 수송체 ABCG5/G8의 결정화를 위한 설정을 설명합니다. ABCG5/G8은 행잉 드롭 결정화를 위해 이셀로 재구성됩니다. 이 프로토콜은 특수 재료나 기질이 필요하지 않으므로 X선 결정학을 통해 단백질 구조를 결정하기 위한 모든 실험실에서 쉽게 접근할 수 있고 적용할 수 있습니다.

Abstract

ATP-결합 카세트(ABC) 수송체는 지질에 내장된 막 단백질을 구성합니다. 이러한 막 단백질을 지질 이중층에서 수성 환경으로 추출하는 것은 일반적으로 세제를 사용하여 달성됩니다. 이 세제는 지질 이중층을 분해하고 단백질을 용해시킵니다. 지질 이중층 내 막 단백질의 고유 서식지는 구조적 특성 분석을 위한 용액에서 안정성과 균일성을 유지하는 데 어려움을 초래합니다. 긴 사슬과 짧은 사슬 인지질과 세제의 혼합물로 구성된 Bicelles는 천연 지질 구조를 복제합니다. 지질 이세 및 세제의 활용은 특히 막 단백질의 고분해능 구조를 결정하기 위해 고품질 회절 결정을 얻기 위한 적합한 모델 시스템 역할을 합니다. 이러한 합성 미세환경을 통해 막 단백질은 본래의 형태와 기능을 보존하여 3차원 결정의 형성을 촉진합니다. 이 접근법에서, 세제-가용화된 헤테로다이메릭 ABCG5/G8은 콜레스테롤이 보충된 DMPC/CHAPSO bicelles에 재통합되었습니다. 이 설정은 단백질 결정화를 위한 증기 확산 실험 절차에 사용되었습니다.

Introduction

ATP-결합 카세트(ABC) 수송체는 생체막 1,2,3,4,5를 가로지르는 다양한 ATP 의존성 수송 과정을 담당하는 막 단백질의 슈퍼패밀리를 구성합니다. 이러한 수송 단백질은 심혈관 질환과 관련이 있으며 간에서 후속 배설을 위해 담즙으로 콜레스테롤 유출을 촉진하는 데 중요한 역할을 합니다. 결과적으로, 콜레스테롤 대사와 균형은 수년 동안 상당한 관심을 끌었다.6. 체내에서 콜레스테롤과 다른 스테롤을 제거하는 데 관여하는 특정 메커니즘은 인간 ABCG 아과, 특히 이종 ABCG5/G8 7,8,9,10의 구성원을 포함합니다. 이들 유전자 중 하나의 돌연변이는 이질체를 교란하여 기능을 상실하고 스테롤 밀매에 영향을 미치는 질환인 좌골혈증을 유발한다11,12,13. 이 질병의 관련성과 콜레스테롤 유출을 촉진하는 역할을 감안할 때, 스테롤 수송체는 상당한 관심을 끌었습니다. 그럼에도 불구하고, 분자 메커니즘과 기질 선택성의 복잡한 세부 사항은 대부분 공개되지 않은 상태로 남아 있습니다. 따라서 ABCG5/G8의 결정 구조를 규명하는 것은 콜레스테롤 수송의 메커니즘과 다운스트림 기능을 이해하는 데 중요한 진전입니다.

막 단백질은 접히고 올바르게 기능하기 위해 막 내에 고정되어야 합니다. 결과적으로, 자연 환경에서 막 단백질을 추출하는 것은 종종 단백질의 불안정성, 잘못 접힘 및 기능 상실을 초래합니다14,15. 이러한 과제는 막 단백질 결정화에서 직면하는 주요 장애물을 강조합니다. 그러나, 단백질을 이두박과 같은 합성 세제 이중층으로 재구성하는 것은 이러한 곤경에 대한 해결책으로 등장하여, 네이티브와 유사한 이중층 환경 내에서 막 단백질의 유지를 가능하게 한다16. Bicelles는 합성 인지질과 세제가 물에 현탁되고 용해되는 집합체입니다. 특히, 그들은 생체막16,17,18을 모방하는 이중층 구조를 채택합니다. Bicelle은 온도와 점도에 따라 액체 상과 겔 상 사이를 전이할 수 있습니다. Bicelle 결정화는 작은 이중층 디스크와 저온에서 낮은 점도를 활용하여 단백질과 bicelle 용액의 철저한 혼합을 촉진합니다. bicelles의 크기는 준비 중 세제 대 지질 비율에 따라 다릅니다19,20. bicelle 형성을 위해 널리 사용되는 세제는 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propanesulfonate(CHAPSO)와 함께 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate(CHAPS) 및 1,2-ditridecanoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine(DHPC)21입니다. 이 세제는 디-미리스토일-포스파티딜콜린(DMPC) 및 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜콜린(POPC)과 같은 지질과 함께 사용됩니다. 또한, 최근 연구는 생리학적 조건 하에서 이두엽 내 막 단백질의 완전한 기능을 입증했습니다. 예를 들어, Lee와 동료들은 지질 이중층22,23을 기반으로 ABCG5/ABCG8의 결정 구조를 성공적으로 결정화하고 보고했습니다. 결정화 공정에서, 단백질-바이셀 혼합물은 고처리량 결정화 로봇(24)을 포함하는 표준 장비를 사용하여 수용될 수 있다. 그러나 bicelles 활용의 타당성은 더 높은 온도에서 결정화 조건으로 인한 단백질의 열 안정성에 달려 있습니다. 그럼에도 불구하고, 다른 기술과 비교할 때, 막 단백질에 필요한 결정화 조건은 일반적으로 낮은 농도의 침전제, 염 및 완충액을 포함하는 온화한 상태로 유지됩니다. 이를 통해 단백질-이체 혼합물과 증기 확산을 모두 효과적으로 만들고 막 단백질의 구조 연구를 위한 도구를 쉽게 구현할 수 있습니다.

이 프로토콜은 ABCG5/G8의 X선 결정 구조를 고분해능으로 측정하기 위한 단백질 준비 및 이체 결정화의 필수 단계를 간략하게 설명합니다(그림 1).

Protocol

1. 클로닝과 단백질 발현

  1. 인간 ABCG5/G8 유전자를 이전 프로토콜25,26에 따라 Pichia pastoris 효모로 복제합니다. 간단히 말해서 pPICZB에서 pSGP18 및 pLIC 발현 벡터를 도출합니다. 리노바이러스 3C 프로테아제 부위를 암호화한 후 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP)를 ABCG8 cDNA(pSGP18-G8-3C-CBP)의 C-말단에 추가합니다.
    1. 글리신(His 6 GlyHis 6)으로 분리된6-히스티딘 태그를 ABCG5 cDNA(pLIC-G5-H12)의 C-말단에 첨가한다. electroporation을 사용하여 플라스미드를 Pichia 균주 KM71H로 동시 형질전환시킵니다.
      NOTE: 사용된 플라스미드, 배지 및 완충액에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
    2. 형질전환된 효모 세포를 28°C의 MD 한천 플레이트에서 성장시킵니다.
  2. 1-2일 후 10-12개의 콜로니를 선택하고 소규모 배양을 위해 50mL 원심분리 튜브를 사용하여 10mL의 최소 글리세롤 효모 질소 염기(MGY) 배지에 접종합니다.
    1. 더 나은 통기를 위해 원심분리기 튜브 뚜껑에 세 개의 작은 구멍을 만듭니다. 600nm(OD600)의 광학 밀도가 10에 도달할 때까지 250rpm에서 지속적으로 흔들면서 세포가 28°C에서 성장하도록 하며, 일반적으로 1-2박이 걸립니다.
      참고: 세포 성장은 일반적으로 12-24시간이 걸립니다.
  3. 다음 날, 멸균 MGY 배지 1L를 2.4L 플라스크에 담아 1차 배양액과 함께 접종합니다. 플라스크를 28°C의 셰이커 인큐베이터에서 250rpm으로 24시간 동안 배양합니다.
    1. pH를 5-6 사이로 유지하려면 pH가 안정화될 때까지 10% 수산화암모늄(NH4OH)을 추가합니다.
  4. 배양 1L당 순수 메탄올 1mL(0.1%(v/v) 메탄올)을 첨가하여 pH를 조정하고 단백질 발현을 유도합니다.
    참고: 총 36-48시간 동안 12시간마다 리터 배양액당 5mL 순수 메탄올(0.5%(v/v) 메탄올)을 주입합니다.
  5. 4°C에서 30분 동안 15,000 x g 에서 원심분리하여 세포를 수확합니다.
  6. 세포 펠릿을 수집하고 0.5g/mL의 농도로 용해 완충액(0.33M 자당, 0.3M Tris-Cl pH 7.5, 0.1M 아미노헥사노산, 1mM EDTA 및 1mM EGTA)에 재현탁시킵니다. 현탁액을 -80 °C에서 보관하십시오. 일반적으로 배양된 세포 1L에서 30 ± 5g의 세포 질량을 회수할 수 있습니다.
    참고: 세포 펠릿을 냉동실에 직접 보관하거나 멤브레인 준비를 위해 용해 완충액에서 즉시 재현탁을 수행합니다.

2. 마이크로솜막의 제조

  1. 세포를 해동하고 단백질 분해 효소 억제제(2μg/mL 류펩틴, 2μg/mL 펩스타틴 A, 2mM PMSF, 재료 표 참조)를 추가합니다.
    1. 세포를 추가로 용해하려면 25,000-30,000psi에서 얼음으로 냉각된 유화제 또는 미세유동화기( 재료 표 참조)를 사용하십시오. 이 과정을 3-4회 반복합니다.
    2. 세포 파편을 제거하기 위한 원심분리기: 3,500-4,000 x g 에서 15분 동안 회전한 다음 15,000 x g 에서 30분 동안 두 번째 회전. 두 스핀을 모두 4°C로 유지합니다.
  2. 마이크로솜막 소포를 분리하려면 상층액을 초원심분리 튜브로 옮기고 4°C에서 1.5시간 동안 2,00,000 x g 에서 초원심분리를 실시합니다.
    1. dounce 균질화기를 사용하여 50mL의 완충액 A(50mM Tris-Cl pH 8.0, 100mM NaCl 및 10% 글리세롤)에 멤브레인 펠릿을 재현탁시킵니다. 현탁액을 -80 °C에서 보관하십시오.

3. 단백질 준비 - 헤테로다이머의 정제

  1. 얼어붙은 마이크로솜막을 해동하고 가용화 완충액을 사용하여 농도를 4-6mg/mL로 조정합니다. 완충액은 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 100mM NaCl, 10% 글리세롤, 1%(w/v) β-도데실 말토시드(β-DDM), 0.5%(w/v) 콜레이트, 0.1%(w/v) 콜레스테릴 헤미숙시네이트(CHS), 5mM 이미다졸, 5mM β-메르캅토에탄올(β-ME), 2μg/mL 류펩틴, 2μg/mL 펩스타틴 A 및 2mM PMSF를 포함해야 합니다( 재료 표 참조).
    참고: 동일한 부피의 멤브레인 제제와 가용화 완충액을 혼합하거나 단백질 분해효소 억제제 및 환원제 없이 2배 가용화 완충액을 사용할 수 있습니다. 완충액을 짧게 끓이면 CHS를 효율적으로 용해시키는 데 도움이 됩니다. 정제 시에는 4°C 냉각 버퍼만 사용하십시오.
    1. 혼합물을 4°C에서 1시간 동안 중간 속도로 저어줍니다. 실온(RT)에서 20-30분 동안 추가로 저어줍니다.
    2. 혼합물을 1,00,000 x g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리하여 불용성 멤브레인을 제거합니다. 가용화된 상층액을 수집하고 20mM 이미다졸 및 0.1mM TCEP를 첨가합니다.
  2. 친화성 컬럼 크로마토그래피26 수행: 가용화된 상층액을 버퍼 A(단계 2.2.1)에서 밤새 사전 평형화된 Ni-NTA 비드(10-15mL)( 재료 표 참조)에 결합합니다.
    참고: 이 시점부터 버퍼를 실행할 때 글리세롤을 사용하지 마십시오.
    1. 25mM 이미다졸을 함유한 Buffer B(50mM HEPES, pH 7.5, 100mM NaCl, 0.1%(w/v) β-DDM, 0.05%(w/v) cholate, 0.01%(w/v) CHS, 0.1mM TCEP)의 10컬럼 부피로 컬럼을 2회 세척합니다.
    2. 50mM 이미다졸을 함유한 10 컬럼 부피의 Buffer B로 컬럼을 세척합니다.
    3. 완충액 C(200mM 이미다졸이 포함된 완충액 B)를 사용하여 단백질을 용출합니다.
    4. 용리된 단백질에 1mM TCEP(재료 표 참조)와 10mM MgCl2를 추가합니다.
    5. SDS-PAGE 겔에서 용리된 분획을 검증하여 올바른 단백질 크기26을 확인합니다.
      참고: 일반적인 단백질 수율(1st Ni-NTA): 6L 배양액당 10-20mg의 단백질. 임계 미셀 농도 (CMC)의 10x 또는 5x (약 0.01 %)에서 DDM을 사용하십시오. 이 프로토콜은 0.1% DDM을 사용합니다.
    6. Ni-NTA 용리의 피크 분획을 동일한 부피의 완충액 D1(1mM CaCl 2, 1mM MgCl2의 완충액 B)으로 희석하고, 혼합하고, 단백질 분획을 CBP 세척 완충액 D1로 사전 평형을 이룬 CBP 컬럼(3-5mL)(재료 표 참조)에 로드합니다.
    7. 완충액 D1 및 D2(1mM CaCl2, 1mMMgCl2, 0.1%(w/v) 데실-말토스 네오펜틸 글리콜(DMNG)을 사용한 완충액 B, β-DDM 없음)을 사용하여 세제를 교환하기 위해 CBP 컬럼에서 순차 세척을 수행: 먼저 D1 컬럼 부피 3개로 세척합니다. 둘째, D1:D2(3:1, v/v)의 3컬럼 부피로 세척합니다. 셋째, D1:D2(1:1, v/v)의 3열 부피로 세척합니다. 네 번째 단계, D1:D2 컬럼 부피 3개(1:3, v/v)로 세척한 다음 D2 컬럼 부피 6-10개로 세척합니다.
    8. CBP 컬럼(총 10mL)에서 1mL 분획에 300mM NaCl이 포함된 CBP 세척 완충액 D2를 사용하여 단백질을 용리합니다. 용출된 분획을 1-2mL로 농축합니다.
      참고: 일반적인 단백질 수율(1st CBP)은 6L 배양액당 5-15mg의 단백질입니다. 말토스 네오펜틸 글리콜(MNG) 세제는 4°C에서 정제된 단백질 저장을 향상시킵니다. DMNG와 Lauryl MNG(LMNG)가 모두 사용되었으며, DMNG는 더 나은 X선 회절 결정을 산출했습니다. 임계 미셀 농도(CMC)의 10-20배인 약 0.003%에서 DMNG를 사용합니다. 이 프로토콜은 0.1% DMNG를 사용했습니다. CBP 용리액의 일부를 겔 여과 크로마토그래피(4.4단계)로 추가로 정제하여 단백질의 ATPase 활성을 분석하거나 투과 전자 현미경(TEM)을 통해 단분산성을 평가할 수 있습니다.

4. 단백질 준비 - 사전 결정화 처리

  1. 엔도글리코시다아제 H(Endo H, 10-15mg 정제 단백질당 ~0.2mg) 및 HRV-3C 프로테아제(10-15mg 정제 단백질당 ~2mg)를 각각 사용하여 N-결합 글라이칸 및 CBP 태그를 절단합니다( 재료 표 참조). 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
  2. Endo H 및 3C 프로테아제 배양 중에 통합된 단백질에 대해 환원성 알킬화를 수행합니다. 4°C에서 밤새 20mM 요오도아세트아미드( 재료 표 참조)로 배양하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 얼음에 추가로 2mM 요오드아세트아미드를 넣고 1시간 배양합니다.
    참고: 이 단계는 4°C에서 최대 1개월 동안 단백질 저장을 더욱 안정화합니다.
  3. 두 번째 CBP 컬럼(1-2mL)을 사용하여 절단된 CBP 태그를 분리합니다. 이 프로세스에는 버퍼 D2를 사용합니다.
    참고: 일반적인 단백질 수율(2차 CBP)은 6L 배양액당 5-10mg의 단백질입니다.
  4. 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 CBP 태그가 없는 단백질을 정제합니다. 완충액은 10mM HEPES, pH 7.5, 100mM NaCl, 0.1%(w/v) DMNG, 0.05%(w/v) 콜레이트 및 0.01%(w/v) CHS를 함유해야 합니다.
    참고: 일반적인 단백질 수율(겔 여과)은 6L 배양액당 2-8mg의 단백질입니다. 이 단계에서 겔 여과 중 DDM 피크(~65kD)가 없으면 DMNG로의 세제 교환이 성공했음을 나타냅니다.
  5. 환원성 메틸화를 통해 통합된 단백질 분획을 변형: 단백질에 20mM 디메틸아민 보란(DMAB, 재료 표 참조)과 40mM 포름알데히드를 추가합니다. 진동 쉐이커에서 4 °C에서 2 시간 동안 배양합니다. 10mM DMAB를 추가합니다.
    1. 10mM DMAB의 첨가를 포함하여 4.5단계를 반복하고 4°C에서 밤새(12-18시간) 배양합니다.
    2. 100mM Tris-Cl, pH 7.5를 첨가하여 반응을 중단하십시오.
  6. 메틸화된 단백질을 100mM Tris-Cl, pH 8.0 및 100mM NaCl로 사전 평형화된 2mL Ni-NTA 컬럼에 로드합니다.
    1. 10컬럼 용량의 세척 완충액(10mM HEPES, pH 7.5, 100mM NaCl, 0.5mg/mL DOPC: DOPE(3:1, w/w), 0.1%(w/v) DMNG, 0.05%(w/v) 콜레이트, 0.01%(w/v) CHS)를 사용하여 컬럼을 세척합니다.
    2. 용출 완충액(10mM HEPES, pH 7.5, 100mM NaCl, 200mM 이미다졸, 0.5mg/mL DOPC)을 사용하여 지질 단백질을 용리합니다. DOPE(1:1, w/w), 0.1%(w/v) DMNG, 0.05%(w/v) 콜레이트, 0.01%(w/v) CHS).
      참고: 일반적인 단백질 수율(2nd Ni-NTA)은 6L 배양액당 1-5mg의 단백질입니다.
    3. 4.4단계에서 사용된 완충액과 사전 평형을 이룬 PD-10 탈염 컬럼을 통해 단백질 용리액을 통과시킵니다.
  7. 탈염 및 지질 단백질을 콜레스테롤(이소프로판올 또는 에탄올로 제조)과 함께 밤새 ~20μM의 최종 농도로 배양합니다.
    1. 다음날 아침, 4°C에서 10분 동안 1,50,000 x g 의 초원심분리에 의해 침전제를 제거한다. 상층액을 수집합니다.
    2. 100kDa 차단 원심 농축기를 사용하여 단백질을 30-50mg/mL의 최종 농도로 농축합니다.
    3. 탁상용 냉장 원심분리기를 사용하여 30°C에서 4분 동안 최고 속도로 침전제를 제거합니다.
    4. 상층액을 4°C의 얼음 위에 유지하고 이두박근에서 결정화 조건을 설정합니다.
      참고: 농축 단백질은 일주일 이내에 결정 성장을 위해 사용되어야 합니다. 단백질을 얼리지 마십시오.

5. bicelles에 있는 단백질 결정화

  1. DMPC 지질과 CHAPSO 세제를 3:1(w/w) 비율로 사용하여 10% bicelle 원액을 준비합니다( 재료 표 참조).
    알림: 임계 미셀 농도(CMC)의 5배인 약 0.5%에서 CHAPSO를 사용하십시오. 이것은 단백질-bicelle 혼합물에서 CMC 주변의 세제 농도를 유지합니다(단계 5.2).
    1. 탈이온화된 H2O-용해 세제(CHAPSO)를 사전 건조된 지질(5 mol% 콜레스테롤과 95 mol% DMPC의 혼합물)에 첨가합니다.
      알림: 클로로포름으로 다양한 지질 조성물을 준비하고 RT에서 질소 가스 스트림을 사용하여 유리 시험관에서 건조합니다. 잔류 용매를 진공 챔버에 밤새 넣어 얇은 지질층을 형성하여 제거합니다.
    2. 수조 초음파 발생기를 사용하여 지질과 세제를 재현탁시킵니다.
    3. 용액이 투명해질 때까지 지속적인 전력을 사용하여 얼음으로 식힌 물에 bicelle 혼합물을 초음파 처리합니다.
      알림: 청력 보호구를 사용하고 혼합물을 액상으로 유지하기 위해 충분한 얼음 공급을 확인하십시오.
    4. 0.2μm 원심 필터로 용해되지 않은 구성 요소를 제거합니다( 재료 표 참조).
      알림: 분취된 bicelle 용액을 -80°C에서 보관하십시오.
  2. 10% 이두(단계 5.1.4)와 단백질(단계 4.7.4)을 1:4(v/v) 비율로 부드럽게 결합하여 얼음 위에 단백질/이체 혼합물을 만들어 최종 단백질 농도가 5-10mg/mL 사이가 되도록 합니다.
  3. 단백질과 bicelle 혼합물을 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
  4. 48웰 플레이트를 사용하여 행잉 드롭 증기 확산 형식으로 결정화 조건을 설정합니다.
    1. 1.6 M-2.0 M 황산암모늄, 100 mM MES(pH 6.5), 0%-4% PEG 400 및 1 mM TCEP를 포함하는 동일한 부피(0.5 또는 1 μL)의 단백질/바이셀 혼합물과 결정화 저장 용액을 혼합합니다( 재료 표 참조).
      알림: 각 실험 전에 저장 용액의 매트릭스를 만들고 황산암모늄(1.6-2.0M) 및 PEG 400(0%-4%)을 조정합니다.
    2. 20°C에서 결정화를 위해 배양합니다.
    3. 다음날 결정화 트레이를 점검하여 덮개 유리가 제대로 밀봉되었는지 확인하십시오.
    4. 적어도 하루에 한 번 결정 성장을 모니터링하십시오. 고품질 결정은 일반적으로 50-150 μm x 20-50 μm x 2-5 μm 크기의 1-2 주 이내에 나타납니다.
      참고: 결정은 낮은 단백질 농도에서 형성되는 데 더 오래 걸릴 수 있습니다. 성숙한 결정은 한 달 이내에 수확해야 합니다.
    5. 단백질 결정을 0.2M 말로네이트 나트륨에 담그고 50 또는 100 μm 극저온 루프를 사용하여 액체 질소에 급속 동결합니다.
      참고: X선 회절분석기를 사용할 수 있는 경우 15-30분 X선 빔 노출로 몇 개의 결정을 테스트하여 최대 5Å의 회절을 나타냅니다. 고분해능 회절에는 싱크로트론 광원이 필요합니다. 0.2M 말로네이트 나트륨을 동결 보호제로 사용하는 100μm x 50μm x 2μm 크기의 결정은 싱크로트론 X선으로 약 90개의 회절 이미지 프레임을 제공할 수 있습니다.

Representative Results

재조합 ABC 반수송체, 인간 ABCG5 및 ABCG8은 Pichia pastoris 효모에서 동시 발현됩니다. 그런 다음 효모막 분획은 원심분리를 통해 분획됩니다. 이 프로토콜에 요약된 바와 같이, 이종이량체 단백질은 탠덤 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 추출됩니다. 그 후, 화학적으로 전처리된 단백질은 인지질/콜레스테롤 이세포로 배양하여 결정화됩니다. 정제 및 결정화 공정의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.

정제된 단백질의 단분산성을 평가하기 위해 0.01-0.05mg/mL의 단백질을 포함하는 샘플을 1%-2% 우라닐 아세테이트로 염색합니다. 그런 다음 음성 염색 TEM을 사용하여 이러한 샘플을 검사합니다(그림 2A). 동결-해동 주기를 거치지 않고 단백질 안정성을 평가하기 위해 분석 겔 여과 크로마토그래피가 사용됩니다. 이 분석에는 단백질의 작고 동일한 부피의 부분 표본을 사용하여 정제된 단백질의 시간 과정 저장을 모니터링하는 것이 포함됩니다(그림 2B). 4°C에서 일주일 동안 배양한 후 피크 분획에서 단백질이 약간 손실될 수 있으며, 이는 잔류 가용성 단백질 응집체로 인한 것일 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 전체 단백질 수율은 결정 성장에 충분합니다. 음성 염색 TEM 및 분석 겔 여과 크로마토그래피의 사용은 특히 다양한 엔지니어링 구조에서 결정화에 대한 단백질의 적합성을 평가하기 위한 표준 관행입니다.

컬럼 크로마토그래피 공정의 각 단계에서뿐만 아니라 사전 결정화 화학 처리 후 단백질 품질을 평가하기 위해 2개의 Ni-NTA 컬럼, 2개의 CBP 컬럼, 1개의 겔 여과 및 환원성 알킬화에 해당하는 분획의 분취액을 10% SDS-PAGE 겔에 로드합니다(그림 3). 또한 알킬화에 사용되는 동일한 반응 환경을 에틸 수은(EMTS)을 사용한 수은 라벨링에 적용할 수 있지만 이는 현재 연구의 범위를 벗어납니다.

결정의 성장은 편광판이 장착된 탁상용 실체 현미경을 사용하여 매일 모니터링됩니다. 성숙하고 데이터 수집에 적합한 결정은 일반적으로 50μm x 100μm x 2μm의 크기를 달성합니다(그림 4). 결정 수확 과정에서 더 작은 결정이나 클러스터는 의도적으로 피합니다.

Figure 1
그림 1: 이종 이량체 ABCG5/G8의 정제(A) 및 이체 결정화(B)에 대한 개략도. 재조합 인간 ABCG5(hG5) 및 ABCG8(hG8)의 구축물은 각각 RGS-H 6-G-H6 및 3C-CBP 태그를 가지고 있습니다(A, 상단). 탠덤 친화성 컬럼 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피에 이어 이종 정제를 달성합니다(A, 하단). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 정제된 단백질의 단분산성 (A) 및 안정성(B) 평가. (A) TEM을 사용한 음성으로 염색된 ABCG5/G8(G5G8) 이종이량체의 전자 현미경 사진. 대표적인 입자는 흰색 원으로 강조 표시됩니다. 스케일 바 = 100nm. (B) 4°C에서 보관된 알킬화 단백질은 한 달 동안 분석 겔 여과 크로마토그래피로 분석되었으며 일주일 후 단백질이 약간 손실되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 컬럼 크로마토그래피 및 환원성 알킬화의 단백질 용리액에 대한 SDS-PAGE 분석. 다양한 부피(1-10μL)의 단백질 분획을 10% Tris/Glycine 겔에 로드하고 200V의 일정한 전압에서 45분 동안 실행했습니다. 겔을 Coomassie blue로 염색하고, 탈색하고, 공기 건조하고, 탁상용 스캐너로 스캔했습니다. 1° & 2° Ni: 첫 번째 및 두 번째 Ni-NTA 컬럼; 1° 및 2° CBP: 첫 번째 및 두 번째 CBP 컬럼; 피크 분획 실선: 결정화를 위한 합동 분획; 피크 분수 점선: 어깨 분수; EMTS : 에틸 수은 티오 살리시 네이트; IA: 요오드아세다마이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 광학 현미경을 이용한 단백질 결정 성숙 평가. 결정화 방울에서 나온 ABCG5/G8의 성숙한 결정은 탁상과 편광판이 장착된 실체 현미경으로 시각화되었습니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

막 단백질의 결정화와 관련된 문제는 bicelle27 또는 lipid cubic phase (LCP)14 접근법과 같은 지질 이중층 기반 결정화 방법의 개발을 촉진했습니다. 그러나 막 단백질의 성공적인 결정화를 달성하는 것은 여전히 단백질 준비의 중요하고 때로는 병목 현상이 발생하는 단계에 달려 있습니다. 특히, ABC 수송체는 X선 결정학에 적합한 결정을 성장시키는 데 만만치 않은 장애물을 제시합니다. 이 프로토콜은 인간 ABCG5/G8 스테롤 수송체의 준비를 간소화하고 이체 결정화 접근법을 통해 결정 성장을 촉진하기 위한 포괄적인 실습 지침을 제공합니다.

이 프로토콜을 고안할 때 주요 고려 사항은 단백질 정제의 초기 단계에서 상당한 단백질 수율을 달성하여 사전 결정화 처리 중에 어느 정도의 단백질 손실을 허용하는 것이었습니다(그림 3). 이 문제를 해결하기 위한 일반적인 전략에는 광범위한 단백질 엔지니어링, 다양한 발현 숙주의 활용, ortholog 또는 homolog 탐색 등이 포함됩니다. 그럼에도 불구하고, 겉보기에 복잡해 보이는 이 절차를 통해, 프로토콜의 성공을 뒷받침하고 다른 ABC 수송체 또는 막 단백질을 일반적으로 연구할 때 발생할 수 있는 잠재적 한계에 대한 통찰력을 제공하는 여러 중추적인 단계가 확인되었습니다.

첫째, 이 프로토콜은 단백질 응집을 최소화하기 위해 각 단계에서 철저한 원심분리를 사용합니다. 또한 정제된 단백질의 열안정성을 지속적으로 모니터링하는 것이 중요합니다. 전자 현미경은 단백질 단분산성을 검증하는 데 사용되며, 분석 겔 여과는 시간 경과에 따른 단백질 안정성을 추적합니다(그림 2). 원형 이색법(CD) 또는 시차 주사 열량계(DSC)와 같은 대체 기술도 통합할 수 있습니다. 또한, 특정 단계에서 지질의 통합은 정제된 ABCG5/G8의 활성과 결정형성을 모두 극대화하는 데 필수적입니다. 예를 들어, 콜레이트 및 CHS는 측정 가능한 ATP 가수분해를 나타내는 데 필요합니다. 인지질은 메틸화 단백질의 안정성을 유지하는 데 없어서는 안될 필수 요소입니다. 콜레스테롤은 이체 용액의 필수 구성 요소로, 고분해능 X선 회절에 적합한 결정 성장을 촉진합니다(그림 4).

본질적으로 전체 절차는 일주일의 노력으로 완료할 수 있습니다. LCP와 달리, 행잉 드롭 결정화 트레이에서 크리스탈을 회수하는 것은 간단합니다. 상당한 단백질 수율(약 10mg)을 제공하는 이 프로토콜은 ABCG5/G8 돌연변이 또는 기타 수송 단백질과 관련된 결정학적 연구를 개발하는 데 쉽게 적응할 수 있습니다. 이는 현재 전자 현미경을 통한 시각화를 피하는 경우에 특히 적합합니다.

Disclosures

저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 연구는 JYL에 대한 자연 과학 및 공학 연구 위원회 디스커버리 그랜트(RGPIN 2018-04070)와 캐나다 보건 연구소 연구 프로젝트 그랜트(PJT-180640)의 지원을 받습니다. 이 프로토콜은 Farhat et al.22 및 Lee et al.23에 의해 이전에 보고된 ABCG5/G8 결정 구조의 원본 보고서를 기반으로 합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABCG5 National Institute of Health collection  NCBI accession number NM_022436
ABCG8 National Institute of Health collection  NCBI accession number NM_022437
ÄKTA FPLC system  Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences)
CaCl2 Wisent 600-024-CG Anhydrous
CBP Agilent 214303 Calmodulin binding peptide affinity resin
Centrifugal concentrators (Vivaspin) Sartorius
CHAPSO  Anatrace C317 Anagrade
Cholesterol Anatrace CH200
CHS Steraloids C6823-000
DMAB MilliporeSigma 180238 97%
DMNG Anatrace NG322
DMPC Anatrace D514
DOPC Avanti 850375
DOPC Anatrace D518
DOPE Avanti 850725
DTT Fisher BP172
Dual Thickness MicroLoops MiTeGen
EDTA BioShop EDT003 Disodium salt, dihydrate
EGTA MilliporeSigma 324626
Emulsifier (EmulsiFex-C3) Avestin
Endo H New England Biolabs P0702
Ethanol Greenfield P016EAAN Ethyl Alcohol Anhydrous
Formaldehyde MilliporeSigma 252549 ACS Reagent
Glycerol BioShop GLY004
HEPES BioShop HEP001
HRV-3C protease Homemade
Imidazole BioShop IMD510 Reagent grade
Iodoacetamide MilliporeSigma I1149 BioUltra
Isopropanol Fisher BP2618212
Leupeptin BioShop LEU001
MES MilliporeSigma 69892 BioUltra
Methanol Fisher A412P
MgCl2 Wisent 800-070-CG Hydrated
microfluidizer (LM 20) Microfluidics
NaCl BioShop SOD002
NH4OH Fisher A669-212 ACS Reagent
Ni-NTA superflow Qiagen 30430 Nickel-charged resins
PEG 400 MilliporeSigma 202398
Pepstatin BioShop PEP605
PMSF MilliporeSigma P7626
pSGP18 and pLIC  Homemade (derived from pPICZ, Invitrogen)
SDS BioShop SDS003
Sodium cholate Fisher 229101
Sodium malonate MilliporeSigma 63409
Sucrose Wisent 800-081-WG Ultra pure
Superdex 200 30/100 GL Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences) 28990944 Prepacked gel-filtration column
TCEP
TEM FEI, Technai
Tris Base Fisher BP152
β-DDM Anatrace D310S Sol Grade
β-mercaptoethanol MilliporeSigma
ε-aminocaproic acid Fisher AAA1471936

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References

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ABCG5/G8 지질 이체 X선 결정학 막 단백질 지질 이중층 세제 안정성 균일성 구조적 특성화 이중세포 인지질 고품질 회절 결정 고분해능 구조 기본 형태 기능성 3차원 결정 세제 가용화 이종이성체 ABCG5/G8 DMPC/CHAPSO 이중세포 콜레스테롤 증기 확산 단백질 결정화
X선 결정학을 위한 지질 이중세포 환경에서의 ABCG5/G8 결정화
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Wazir, S., Farhat, D., Srinivasan, M., Lee, J. Y. ABCG5/G8 Crystallization in a Lipidic Bicelle Environment for X-Ray Crystallography. J. Vis. Exp. (198), e65828, doi:10.3791/65828 (2023).

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