Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

ABCG5 / G8 krystallisering i et lipidisk bicellemiljø for røntgenkrystallografi

Published: August 25, 2023 doi: 10.3791/65828
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, Faculty of Medicine, University of Ottawa, 2Department of Biochemistry, Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta

Summary

Denne protokollen beskriver et oppsett for krystallisering av steroltransportøren ABCG5/G8. ABCG5/G8 rekonstitueres til biceller for hengende dråpekrystallisering. Protokollen krever ikke spesialiserte materialer eller substrater, noe som gjør den tilgjengelig og enkel å tilpasse i ethvert laboratorium for å bestemme proteinstrukturen gjennom røntgenkrystallografi.

Abstract

ATP-bindende kassett (ABC) transportører utgjør lipid-innebygde membranproteiner. Ekstrahering av disse membranproteinene fra lipid-dobbeltlaget til et vandig miljø oppnås vanligvis ved å bruke vaskemidler. Disse vaskemidlene desintegrerer lipid-dobbeltlaget og solubiliserer proteinene. Den inneboende habitat av membranproteiner i lipid-dobbeltlaget utgjør en utfordring for å opprettholde stabiliteten og ensartetheten i løsningen for strukturell karakterisering. Biceller, som består av en blanding av lange og kortkjedede fosfolipider og vaskemidler, replikerer den naturlige lipidstrukturen. Utnyttelsen av lipidbiceller og vaskemidler tjener som et egnet modellsystem for å oppnå diffraksjonskrystaller av høy kvalitet, spesielt for å bestemme membranproteinets høyoppløselige struktur. Gjennom disse syntetiske mikromiljøene bevarer membranproteiner sin opprinnelige konformasjon og funksjonalitet, noe som letter dannelsen av tredimensjonale krystaller. I denne tilnærmingen ble den vaskemiddelløselige heterodimere ABCG5/G8 reintegrert i DMPC/CHAPSO-biceller, supplert med kolesterol. Dette oppsettet ble ansatt i dampdiffusjonseksperimentell prosedyre for proteinkrystallisering.

Introduction

ATP-bindende kassett (ABC) transportører utgjør en superfamilie av membranproteiner som er ansvarlige for ulike ATP-avhengige transportprosesser over biologiske membraner 1,2,3,4,5. Disse transportørproteinene er involvert i kardiovaskulære sykdommer og spiller en viktig rolle i å lette kolesterolutstrømningen til gallen for påfølgende utskillelse i leveren. Følgelig har kolesterolmetabolisme og balanse fått betydelig interesse gjennom årene6. En spesifikk mekanisme involvert i eliminering av kolesterol og andre steroler fra kroppen involverer medlemmer av den menneskelige ABCG-underfamilien, spesielt den heterodimere ABCG5 / G8 7,8,9,10. Mutasjoner i et av disse genene forstyrrer heterodimeren, noe som fører til tap av funksjon og forårsaker sitosterolememi, en lidelse som påvirker sterolhandel11,12,13. Gitt sykdommens relevans og deres rolle i å fremme kolesterolutstrømning, har steroltransportører tiltrukket seg betydelig oppmerksomhet. Likevel forblir de intrikate detaljene i deres molekylære mekanisme og substratselektivitet stort sett ukjent. Dermed er belysningen av krystallstrukturen til ABCG5 / G8 et avgjørende skritt mot å forstå mekanismene og nedstrømsfunksjonene i kolesteroltransport.

Membranproteiner krever forankring i membraner for å folde seg og fungere riktig. Følgelig resulterer ekstrahering av membranproteiner fra deres naturlige miljø ofte i proteinustabilitet, feilfolding og tap av funksjon14,15. Disse utfordringene understreker de primære hindringene som står overfor i membranproteinkrystallisering. Imidlertid har rekonstituering av proteiner i syntetiske vaskemiddel-dobbeltlag, som biceller, dukket opp som en løsning på denne vanskeligheten, noe som muliggjør vedlikehold av membranproteiner i et innfødt-lignende dobbeltlagsmiljø16. Biceller er samlinger av syntetiske fosfolipider og vaskemidler suspendert og oppløselig i vann. Spesielt vedtar de en tolagsstruktur som etterligner biologiske membraner16,17,18. Bicelles kan overgå mellom væske- og gelfaser basert på temperatur og viskositet. Bicellekrystallisering utnytter de små dobbeltlagsskivene og lav viskositet ved reduserte temperaturer, noe som letter grundig blanding av proteiner og bicelleløsninger. Størrelsen på bicellene avhenger av forholdet mellom vaskemiddel og lipid under forberedelse19,20. De utbredte vaskemidlene for bicelledannelse inkluderer 3-[(3-kolamidopropyl)dimetylammonio]-2-hydroksy-1-propansulfonat (CHAPSO), sammen med 3-[(3-kolamidopropyl)dimetylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS) og 1,2-ditridecanoyl-sn-glyserol-3-fosfokolin (DHPC)21. Disse vaskemidlene brukes sammen med lipider som di-myristoyl-fosfatidylkolin (DMPC) og 1-palmitoyl-2-oleoyl-fosfatidylkolin (POPC). Videre har nyere studier vist full funksjonalitet av membranproteiner i biceller under fysiologiske forhold. For eksempel krystalliserte Lee og kolleger vellykket og rapporterte krystallstrukturen til ABCG5 / ABCG8 basert på et lipid-dobbeltlag22,23. I krystallisasjonsprosessen kan protein-bicelle-blandinger innkvarteres ved hjelp av standardutstyr, inkludert krystalliseringsroboter med høy gjennomstrømning24. Muligheten for å benytte biceller henger imidlertid på proteinets termostabilitet på grunn av krystallisasjonsforholdene ved høyere temperaturer. Likevel, sammenlignet med andre teknikker, forblir de nødvendige krystallisasjonsbetingelsene for membranproteiner generelt milde, noe som involverer lave konsentrasjoner av utfelling, salt og buffer. Dette gjør både protein-bicelle-blandinger og dampdiffusjon effektive og lett implementerbare verktøy for strukturelle studier av membranproteiner.

Denne protokollen skisserer viktige trinn i proteinpreparasjon og bicellekrystallisering for å bestemme røntgenkrystallstrukturen til ABCG5 / G8 ved høy oppløsning (figur 1).

Protocol

1. Kloning og proteinuttrykk

  1. Klon det menneskelige ABCG5/G8-genet inn i Pichia pastoris gjær etter tidligere protokoller25,26. Kort sagt, utlede pSGP18 og pLIC ekspresjonsvektorer fra pPICZB. Legg til en kode som koder for et rhinovirus 3C proteasested etterfulgt av et calmodulinbindende peptid (CBP) til C-terminalen av ABCG8 cDNA (pSGP18-G8-3C-CBP).
    1. Legg til en seks-histidin-tag atskilt med et glycin(Hans 6 GlyHis6) til C-terminalen av ABCG5 cDNA (pLIC-G5-H12). Samtransformere plasmidene til Pichia-stamme KM71H ved hjelp av elektroporering.
      MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer om plasmider, medier og buffere som brukes.
    2. Dyrk transformerte gjærceller på MD-agarplater ved 28 °C.
  2. Etter 1-2 dager, velg 10-12 kolonier og inokuler dem i 10 ml av minimal glyserol gjær nitrogen base (MGY) media ved hjelp av 50 ml sentrifuge rør for småskala kultur.
    1. Lag tre små hull i sentrifugerørlokket for bedre lufting. La cellene vokse ved 28 °C med konstant risting ved 250 o/min til den optiske tettheten ved 600 nm (OD600) når 10, og tar vanligvis 1-2 overnattinger.
      MERK: Cellevekst tar vanligvis mellom 12-24 timer.
  3. Neste dag, ta 1 l sterilt MGY-medium og inokuler det med primærkulturen i en 2,4 l kolbe. Inkuber kolben ved 28 °C i en shakerinkubator ved 250 o / min i 24 timer.
    1. For å opprettholde pH mellom 5-6, tilsett 10% ammoniumhydroksid (NH4OH) til pH stabiliserer seg.
  4. Juster pH og indusere proteinuttrykk ved å tilsette 1 ml ren metanol per 1 l kultur (0,1 % (v/v) metanol).
    MERK: Fôr celler deretter med 5 ml ren metanol per liter kultur (0,5 % (v / v) metanol) hver 12. time i en total varighet på 36-48 timer.
  5. Høst celler ved å sentrifugere ved 15 000 x g i 30 minutter ved 4 °C.
  6. Samle cellepellets og resuspendere dem i lysisbuffer (0,33 M sukrose, 0,3 M Tris-Cl pH 7,5, 0,1 M aminoheksansyre, 1 mM EDTA og 1 mM EGTA) til en konsentrasjon på 0,5 g / ml. Oppbevar suspensjonen ved -80 °C. Vanligvis kan man gjenopprette 30 ± 5 g cellemasse fra 1 liter dyrkede celler.
    MERK: Oppbevar cellepellets direkte i fryseren eller utfør umiddelbar resuspensjon i lysisbuffer for membranpreparater.

2. Fremstilling av mikrosomal membran

  1. Tine cellene og legge til proteasehemmere (2 μg/ml leupeptin, 2 μg/ml pepstatin A, 2 mM PMSF, se materialfortegnelse).
    1. For ytterligere lyse celler, bruk en iskjølt emulgator eller mikrofluidisator (se materialtabell) ved 25.000-30.000 psi. Gjenta denne prosessen 3-4 ganger.
    2. Sentrifuge for å fjerne celleavfall: spinn ved 3.500-4.000 x g i 15 minutter, etterfulgt av et nytt spinn på 15.000 x g i 30 minutter. Hold begge spinnene ved 4 °C.
  2. For å isolere mikrosomale membranvesikler, overfør supernatanten til ultrasentrifugerør og utsett den for ultrasentrifugering ved 2,00,000 x g i 1,5 timer ved 4 °C.
    1. Resuspender membranpelleten i 50 ml buffer A (50 mM Tris-Cl pH 8,0, 100 mM NaCl og 10% glyserol) ved hjelp av en dounce-homogenisator. Oppbevar suspensjonen ved -80 °C.

3. Proteinpreparasjon-rensing av heterodimerer

  1. Tine de frosne mikrosomale membranene, og juster konsentrasjonen til 4-6 mg / ml ved hjelp av solubiliseringsbuffer. Bufferen skal inneholde 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 % glyserol, 1 % (w/v) β-dodecylmaltosid (β-DDM), 0,5 % (w/v) kolat, 0,1 % (w/v) kolesterylhemisuccinat (CHS), 5 mM imidazol, 5 mM β-merkaptoetanol (β-ME), 2 μg/ml leupeptin, 2 μg/ml pepstatin A og 2 mM PMSF (se materialfortegnelse).
    MERK: Man kan blande like store volumer av membranpreparatet og oppløselighetsbufferen, eller bruke 2x oppløselighetsbuffer uten proteasehemmere og reduksjonsmidler. Kortkoking av bufferen bidrar til å løse opp CHS effektivt. For rensing må du bare bruke den 4 °C-avkjølte bufferen.
    1. Rør blandingen på middels hastighet i 1 time ved 4 °C. Følg opp med omrøring under romtemperatur (RT) i 20-30 min.
    2. Sentrifuger blandingen ved 1 00 000 x g i 30 minutter ved 4 °C for å fjerne uløselige membraner. Samle den løselige supernatanten og tilsett 20 mM imidazol og 0,1 mM TCEP.
  2. Utfør affinitetskolonnekromatografi26: bind den solubiliserte supernatanten til pre-likevekterte Ni-NTA-perler (10-15 ml) (se materialfortegnelse) i buffer A (trinn 2.2.1) over natten.
    MERK: Unngå å bruke glyserol i løpende buffere fra dette tidspunktet og fremover.
    1. Vask kolonnen to ganger med 10 kolonnevolumer buffer B (50 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 % (w/v) β-DDM, 0,05 % (w/v) kolat, 0,01 % (w/v) CHS, 0,1 mM TCEP) inneholdende 25 mM imidazol.
    2. Vask kolonnen med 10 kolonnevolumer buffer B inneholdende 50 ml imidazol.
    3. Eluer proteinet ved hjelp av buffer C (buffer B med 200 mM imidazol).
    4. Tilsett 1 mM TCEP (se materialfortegnelse) og 10 mM MgCl2 til de eluerte proteinene.
    5. Valider de eluerte fraksjonene på en SDS-PAGE gel for å bekrefte riktig proteinstørrelse26.
      MERK: Typisk proteinutbytte (1st Ni-NTA): 10-20 mg protein per 6 L kultur. Bruk DDM ved 10x eller 5x av sin kritiske micelle konsentrasjon (CMC), omtrent 0,01%. Denne protokollen bruker 0.1% DDM.
    6. Fortynn toppfraksjonene fra Ni-NTA-eluering med et likt volum buffer D1 (buffer B med 1 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2), bland og legg proteinfraksjonene på en CBP-kolonne (3-5 ml) (se materialtabell) som er forhåndslikevektet med CBP-vaskebuffer D1.
    7. Utfør sekvensiell vask på CBP-kolonnen for å bytte vaskemidler med buffer D1 og D2 (buffer B med 1 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 0,1 % (w/v) decylmaltose neopentylglykol (DMNG), uten β-DDM): vask først med 3 kolonnevolumer D1; for det andre, vask med 3 kolonnevolumer D1: D2 (3: 1, v / v); tredje, vask med 3 kolonnevolumer D1: D2 (1: 1, v / v); fjerde trinn, vask med 3 kolonnevolumer av D1: D2 (1: 3, v / v), etterfulgt av 6-10 kolonnevolumer av D2.
    8. Eluer proteinet ved hjelp av CBP, vask buffer D2 med 300 mM NaCl i 1 ml fraksjoner fra CBP-kolonnen (totalt 10 ml). Konsentrer de eluerte fraksjonene til 1-2 ml.
      MERK: Det typiske proteinutbyttet (1st CBP) er 5-15 mg protein per 6 liter kultur. Maltose neopentylglykol (MNG) vaskemidler forbedrer renset proteinlagring ved 4 °C. Både DMNG og Lauryl MNG (LMNG) ble brukt, med DMNG som ga bedre røntgendiffraksjonskrystaller. Bruk DMNG ved 10-20x av sin kritiske micellekonsentrasjon (CMC), ca. 0,003%. Denne protokollen brukte 0,1% DMNG. En fraksjon av CBP-eluatet kan renses ytterligere ved gelfiltreringskromatografi (trinn 4.4.) for å analysere proteiners ATPase-aktivitet eller vurdere monodispersjon gjennom transmisjonselektronmikroskopi (TEM).

4. Proteinpreparat-prekrystallisasjonsbehandling

  1. Spalten de N-bundne glykanene og CBP-kodene ved bruk av henholdsvis endoglykosidase H (Endo H, ~0,2 mg per 10-15 mg renset protein) og HRV-3C-protease (~2 mg per 10-15 mg renset protein) (se materialtabell). Inkuber over natten ved 4 °C.
  2. Under Endo H og 3C proteaseinkubasjon, utfør reduktiv alkylering på de samlede proteinene. Begynn med å inkubere med 20 mM iodoacetamid (se materialfortegnelse) over natten ved 4 °C. Følg opp med en 1 timers inkubasjon med ytterligere 2 mM iodoacetamid på is.
    MERK: Dette trinnet stabiliserer proteinlagringen ytterligere i opptil en måned ved 4 °C.
  3. Bruk en ekstra CBP-kolonne (1–2 ml) for å skille den spaltede CBP-taggen. Bruk buffer D2 til denne prosessen.
    MERK: Det typiske proteinutbyttet (2. CBP ) er 5-10 mg protein per 6 liter kultur.
  4. Rens CBP tag-fritt protein ved hjelp av gelfiltreringskromatografi. Bufferen skal inneholde 10 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 % (w/v) DMNG, 0,05 % (w/v) kolat og 0,01 % (w/v) CHS.
    MERK: Det typiske proteinutbyttet (gelfiltrering) er 2-8 mg protein per 6 liter kultur. I løpet av dette trinnet indikerer fraværet av en DDM-topp (~ 65 kD) under gelfiltrering vellykket vaskemiddelbytte til DMNG.
  5. Endre de samlede proteinfraksjonene gjennom reduktiv metylering: tilsett 20 mM dimetylaminboran (DMAB, se materialtabell) og 40 mM formaldehyd til proteinet. Inkuber i 2 timer ved 4 °C på en oscillerende shaker. Legg til 10 mM DMAB.
    1. Gjenta trinn 4.5, inkludert tilsetning av 10 mM DMAB, og inkuber over natten (12-18 timer) ved 4 °C.
    2. Stopp reaksjonen ved å tilsette 100 mM Tris-Cl, pH 7,5.
  6. Legg det metylerte proteinet på en 2 ml Ni-NTA-kolonne forhåndsbalansert med 100 mM Tris-Cl, pH 8,0 og 100 mM NaCl.
    1. Vask kolonnen med 10 kolonnevolumer vaskebuffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, med 0,5 mg/ml dopc: dope (3:1, w/w), 0,1 % (w/v) DMNG, 0,05 % (w/v) kolat, 0,01 % (w/v) CHS).
    2. Eluer det relipiderte proteinet ved bruk av elueringsbuffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 200 mM imidazol, 0,5 mg/ml dopc: dope (1:1, w/w), 0,1 % (w/v) DMNG, 0,05 % (w/v) kolat, 0,01 % (w/v) CHS).
      MERK: Det typiske proteinutbyttet (2. Ni-NTA) er 1-5 mg protein per 6 l kultur.
    3. Før proteineluatene gjennom en PD-10 avsaltingskolonne som er forhåndsbalansert med bufferen som brukes i trinn 4.4.
  7. Inkuber det avsaltede og relipiderte proteinet over natten med kolesterol (fremstilt i isopropanol eller etanol) til en endelig konsentrasjon på ~20 μM.
    1. Neste morgen fjerner du bunnfallet ved ultrasentrifugering ved 1,50 000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Samle supernatanten.
    2. Konsentrer proteinet til en endelig konsentrasjon på 30-50 mg/ml ved hjelp av en 100 kDa cutoff sentrifugalkonsentrator.
    3. Fjern bunnfallet ved hjelp av en stasjonær kjølesentrifuge ved toppfart i 30 minutter ved 4 °C.
    4. Hold supernatanten på is ved 4 °C og etabler krystallisasjonsbetingelser i bicellene.
      MERK: De konsentrerte proteinene skal brukes til krystallvekst innen en uke. Ikke frys proteinene.

5. Proteinkrystallisering i biceller

  1. Klargjør en 10 % bicelleoppløsning med DMPC-lipider og CHAPSO-vaskemiddel i forholdet 3:1 (w/w) (se materialfortegnelse).
    MERK: Bruk CHAPSO ved 5x av sin kritiske micellkonsentrasjon (CMC), ca. 0,5 %. Dette opprettholder vaskemiddelkonsentrasjonen rundt CMC i protein-bicelleblandingen (trinn 5.2).
    1. Tilsett avionisertH2O-oppløstvaskemiddel (CHAPSO) til forhåndstørkede lipider (blanding av 5 mol% kolesterol og 95 mol% DMPC).
      MERK: Forbered forskjellige lipidsammensetninger i kloroform, og tørk dem i et glassreagensrør ved hjelp av en nitrogengasstrøm ved RT. Eliminer gjenværende løsningsmidler ved å plassere dem i et vakuumkammer over natten, og danner et tynt lipidlag.
    2. Resuspend lipider og vaskemiddel ved hjelp av en vannbad sonikator.
    3. Sonikere bicelleblandingen i iskjølt vann med kontinuerlig kraft til løsningen blir gjennomsiktig.
      MERK: Bruk hørselvern og sørg for tilstrekkelig istilførsel til å holde blandingen i væskefase.
    4. Fjern uoppløste komponenter med et 0,2 μm sentrifugalfilter (se materialfortegnelse).
      MERK: Oppbevar aliquoted bicelle oppløsning ved -80 ° C.
  2. Lag en protein / bicelleblanding på is ved forsiktig å kombinere 10% biceller (trinn 5.1.4) og proteiner (trinn 4.7.4) i et 1: 4 (v / v) forhold, og oppnå en endelig proteinkonsentrasjon mellom 5-10 mg / ml.
  3. Inkuber protein- og bicelleblandingen på is i 30 minutter.
  4. Sett opp krystallisasjonsbetingelser i et hengende dråpedampdiffusjonsformat ved hjelp av 48-brønnsplater.
    1. Bland like store volumer (0,5 eller 1 μL) protein/bicelle-blanding og krystallisasjonsreservoaroppløsning inneholdende 1,6 M-2,0 M ammoniumsulfat, 100 mM MES (pH 6,5), 0%-4% PEG 400 og 1 mM TCEP (se materialfortegnelse).
      MERK: Lag en matrise av reservoarløsningen før hvert eksperiment, juster ammoniumsulfat (1,6-2,0 M) og PEG 400 (0% -4%).
    2. Inkuber for krystallisering ved 20 °C.
    3. Kontroller krystalliseringsbrettene neste dag for å sikre riktig forsegling av glassdekselet.
    4. Overvåk krystallvekst minst en gang daglig. Krystaller av høy kvalitet vises vanligvis innen 1-2 uker, og måler 50-150 μm x 20-50 μm x 2-5 μm.
      MERK: Krystaller kan ta lengre tid å danne ved lavere proteinkonsentrasjoner. Eldre krystaller skal høstes innen en måned.
    5. Bløtlegg proteinkrystaller i 0,2 M natriummalonat og blits frys dem i flytende nitrogen ved hjelp av 50 eller 100 μm kryo-sløyfer.
      MERK: Hvis et røntgendiffraktometer er tilgjengelig, test noen krystaller med en 15-30 min røntgenstråleeksponering for å avsløre diffraksjon opp til 5 Å. Diffraksjon med høyere oppløsning krever en synkrotronlyskilde. Ved å bruke 0,2 M natriummalonat som kryobeskyttelsesmiddel, kan en krystall som måler 100 μm x 50 μm x 2 μm gi rundt 90 diffraksjonsbilderammer med synkrotronrøntgen.

Representative Results

Rekombinante ABC-halvtransportører, humane ABCG5 og ABCG8, uttrykkes samtidig i Pichia pastoris gjær. Gjærmembranfraksjonen fraksjoneres deretter gjennom sentrifugering. Som beskrevet i denne protokollen ekstraheres de heterodimere proteinene ved hjelp av tandemkolonnekromatografi. Deretter krystalliseres kjemisk forbehandlede proteiner ved å inkubere dem med fosfolipid / kolesterolbiceller. Skjematiske oversikter over rense- og krystallisasjonsprosessene er gitt i figur 1.

For å vurdere monodispersiteten til de rensede proteinene, farges prøver som inneholder 0,01-0,05 mg / ml proteiner med 1% -2% uranylacetat. Disse prøvene undersøkes deretter med negativ flekk TEM (figur 2A). For å evaluere proteinstabilitet uten å gjennomgå fryse-tine-sykluser, brukes analytisk gelfiltreringskromatografi. Denne analysen innebærer overvåking av tidsforløpslagring av rensede proteiner ved bruk av små, like store alikoter av proteinene (figur 2B). Det kan være et lite tap av proteiner ved toppfraksjonene etter en uke med inkubasjon ved 4 °C, muligens på grunn av gjenværende løselige proteinaggregater. Ikke desto mindre forblir det totale proteinutbyttet tilstrekkelig for krystallvekst. Bruk av negativ flekk TEM og analytisk gelfiltreringskromatografi er en standard praksis for å vurdere egnetheten til proteiner for krystallisering, spesielt fra forskjellige konstruerte konstruksjoner.

For vurdering av proteinkvalitet ved hvert trinn i kolonnekromatografiprosessen, så vel som etter kjemisk behandling før krystallisering, lastes alikoter av fraksjoner som svarer til to Ni-NTA-kolonner, to CBP-kolonner, en gelfiltrering og reduktiv alkylering på en 10% SDS-PAGE gel (figur 3). I tillegg kan det samme reaksjonsmiljøet som brukes til alkylering brukes til kvikksølvmerking med etylkvikksølv (EMTS), selv om dette er utenfor omfanget av den nåværende studien.

Veksten av krystaller overvåkes daglig ved hjelp av et stereomikroskop utstyrt med polarisator. Krystaller som er modne og egnet for datainnsamling, oppnår vanligvis dimensjoner på 50 μm x 100 μm x 2 μm (figur 4). Under krystallhøstingsprosessen unngås mindre krystaller eller klynger bevisst.

Figure 1
Figur 1: Skjematiske oversikter for rensing (A) og bicellekrystallisasjon (B) av heterodimert ABCG5/G8. Konstruksjoner av rekombinant human ABCG5 (hG5) og ABCG8 (hG8) bærer henholdsvis RGS-H 6-G-H6 og 3C-CBP-koder (A, øverst). Tandemaffinitetskolonnekromatografi, etterfulgt av gelfiltreringskromatografi for å oppnå heterodimerisk rensing (A, bunn). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Evaluering av monodispersjon (A) og stabilitet (B) av rensede proteiner . (A) Elektronmikrografi av negativt farget ABCG5/G8 (G5G8) heterodimerer ved bruk av TEM. Representative partikler er uthevet i solide hvite sirkler. Skala bar = 100 nm. (B) Alkylerte proteiner lagret ved 4 °C analysert ved analytisk gelfiltreringskromatografi i løpet av en måned med et lite tap av proteiner etter en uke. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: SDS-PAGE-analyse av proteineluater av kolonnekromatografi og reduktiv alkylering. Ulike volumer (1-10 μL) proteinfraksjoner ble lastet på en 10% Tris / Glycine gel og kjørte i 45 minutter ved en konstant spenning på 200 V. Geleen ble farget med Coomassie-blå, farget, lufttørket og skannet av en bordskanner. 1° & 2° Ni: første og andre Ni-NTA-kolonner; 1° &2° CBP: første og andre CBP-kolonner; Peak Fractions solid linje: samlede fraksjoner for krystallisering; Peak Fractions stiplet linje: skulderfraksjoner; EMTS: etylkvikksølvtiosykynat; IA: jodoacedamid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Vurdering av proteinkrystallmodning ved lysmikroskopi. Modne krystaller av ABCG5 / G8 fra en krystallisasjonsdråpe ble visualisert under en bordplate og polarisatorutstyrt stereomikroskop. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Utfordringene knyttet til krystalliserende membranproteiner har ført til utvikling av lipid-dobbeltlagsdrevne krystallisasjonsmetoder, for eksempel bicelle27 eller lipid kubisk fase (LCP) 14 tilnærminger. Å oppnå vellykket krystallisering av membranproteiner er imidlertid fortsatt avhengig av det kritiske og noen ganger flaskehalsede trinnet med proteinpreparasjon. Spesielt presenterer ABC-transportører en formidabel hindring i voksende krystaller egnet for røntgenkrystallografi. Denne protokollen gir omfattende praktisk veiledning for å strømlinjeforme fremstillingen av human ABCG5 / G8 steroltransportør og fremme krystallvekst gjennom bicellekrystallisasjonsmetoden.

En sentral faktor ved utarbeidelsen av denne protokollen var imperativet for et betydelig proteinutbytte i de innledende fasene av proteinrensing, noe som muliggjorde en viss grad av proteintap under prekrystallisasjonsbehandling (figur 3). Vanlige strategier for å takle denne utfordringen involverer omfattende proteinteknikk, utnyttelse av ulike uttrykksverter og utforskning av ortologer eller homologer, blant andre tilnærminger. Likevel, med denne tilsynelatende intrikate prosedyren, har en rekke sentrale trinn blitt identifisert som underbygger protokollens suksess og gir også innsikt i potensielle begrensninger som kan oppstå når man studerer andre ABC-transportører eller membranproteiner generelt.

For det første bruker denne protokollen grundig sentrifugering på hvert trinn for å minimere proteinaggregering. I tillegg er kontinuerlig overvåking av termostabiliteten til de rensede proteinene avgjørende. Elektronmikroskopi brukes til å verifisere proteinmonodispersjon, mens analytisk gelfiltrering sporer proteinstabilitet over tid (figur 2). Alternative teknikker som sirkulær dikroisme (CD) eller differensialskanningskalorimetri (DSC) kan også innlemmes. Videre er inkorporering av lipider i bestemte stadier avgjørende for å maksimere både aktiviteten og krystallogenesen til den rensede ABCG5 / G8. For eksempel er kolat og CHS nødvendig for å utvise målbar ATP-hydrolyse; fosfolipider er uunnværlige for å opprettholde stabiliteten til metylerte proteiner; og kolesterol er en nødvendig komponent i bicelleløsningen, og fremmer krystallvekst egnet for høyoppløselig røntgendiffraksjon (figur 4).

I hovedsak kan hele prosedyren oppnås innen en ukes innsats. I motsetning til LCP er henting av krystaller fra krystallisasjonsbrett med hengende dråpe grei. Når vi ser fremover, med et betydelig proteinutbytte (ca. 10 mg), er denne protokollen lett tilpasningsdyktig for å utvikle krystallografiske undersøkelser som involverer ABCG5 / G8 mutanter eller andre transportørproteiner. Dette er spesielt relevant for tilfeller som i dag unndrar seg visualisering gjennom elektronmikroskopi.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet støttes av et Natural Sciences and Engineering Research Council Discovery Grant (RGPIN 2018-04070) og et Canadian Institutes of Health Research Project Grant (PJT-180640) til JYL. Denne protokollen er basert på de opprinnelige rapportene i ABCG5/G8 krystallstrukturer rapportert tidligere av Farhat et al.22 og Lee et al.23.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABCG5 National Institute of Health collection  NCBI accession number NM_022436
ABCG8 National Institute of Health collection  NCBI accession number NM_022437
ÄKTA FPLC system  Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences)
CaCl2 Wisent 600-024-CG Anhydrous
CBP Agilent 214303 Calmodulin binding peptide affinity resin
Centrifugal concentrators (Vivaspin) Sartorius
CHAPSO  Anatrace C317 Anagrade
Cholesterol Anatrace CH200
CHS Steraloids C6823-000
DMAB MilliporeSigma 180238 97%
DMNG Anatrace NG322
DMPC Anatrace D514
DOPC Avanti 850375
DOPC Anatrace D518
DOPE Avanti 850725
DTT Fisher BP172
Dual Thickness MicroLoops MiTeGen
EDTA BioShop EDT003 Disodium salt, dihydrate
EGTA MilliporeSigma 324626
Emulsifier (EmulsiFex-C3) Avestin
Endo H New England Biolabs P0702
Ethanol Greenfield P016EAAN Ethyl Alcohol Anhydrous
Formaldehyde MilliporeSigma 252549 ACS Reagent
Glycerol BioShop GLY004
HEPES BioShop HEP001
HRV-3C protease Homemade
Imidazole BioShop IMD510 Reagent grade
Iodoacetamide MilliporeSigma I1149 BioUltra
Isopropanol Fisher BP2618212
Leupeptin BioShop LEU001
MES MilliporeSigma 69892 BioUltra
Methanol Fisher A412P
MgCl2 Wisent 800-070-CG Hydrated
microfluidizer (LM 20) Microfluidics
NaCl BioShop SOD002
NH4OH Fisher A669-212 ACS Reagent
Ni-NTA superflow Qiagen 30430 Nickel-charged resins
PEG 400 MilliporeSigma 202398
Pepstatin BioShop PEP605
PMSF MilliporeSigma P7626
pSGP18 and pLIC  Homemade (derived from pPICZ, Invitrogen)
SDS BioShop SDS003
Sodium cholate Fisher 229101
Sodium malonate MilliporeSigma 63409
Sucrose Wisent 800-081-WG Ultra pure
Superdex 200 30/100 GL Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences) 28990944 Prepacked gel-filtration column
TCEP
TEM FEI, Technai
Tris Base Fisher BP152
β-DDM Anatrace D310S Sol Grade
β-mercaptoethanol MilliporeSigma
ε-aminocaproic acid Fisher AAA1471936

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hamada, H., Tsuruo, T. Purification of the 170- to 180-kilodalton membrane glycoprotein associated with multidrug resistance. 170- to 180-kilodalton membrane glycoprotein is an ATPase. Journal of Biological Chemistry. 263 (3), 1454-1458 (1988).
  2. Higgins, F., Hiles, D., Whalley, K., Jamieson, J. Nucleotide binding by membrane components of bacterial periplasmic binding protein-dependent transport systems. The EMBO Journal. 4 (4), 1033-1039 (1985).
  3. Higgins, F., et al. A family of related ATP-binding subunits coupled to many distinct biological processes in bacteria. Nature. 323 (6087), 448-450 (1986).
  4. Horio, M., Gottesman, M., Pastan, I. ATP-dependent transport of vinblastine in vesicles from human multidrug-resistant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (10), 3580-3584 (1988).
  5. Mimmack, L., et al. Energy coupling to periplasmic binding protein-dependent transport systems: stoichiometry of ATP hydrolysis during transport in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (21), 8257-8261 (1989).
  6. Grundy, M. Absorption and Metabolism of Dietary Cholesterol. Annual Review of Nutrition. 3 (1), 71-96 (1983).
  7. Berge, E., et al. Accumulation of dietary cholesterol in sitosterolemia caused by mutations in adjacent ABC transporters. Science. 290 (5497), 1771-1775 (2000).
  8. Repa, J., et al. Regulation of ATP-binding cassette sterol transporters ABCG5 and ABCG8 by the Liver X receptors α and β. Journal of Biological Chemistry. 277 (21), 18793-18800 (2002).
  9. Yu, L., et al. Stimulation of cholesterol excretion by the Liver X receptor agonist requires ATP-binding cassette transporters G5 and G8. Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15565-15570 (2003).
  10. Yu, L., et al. Expression of ABCG5 and ABCG8 is required for regulation of biliary cholesterol secretion. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 8742-8747 (2005).
  11. Lütjohann, D., Björkhem, I., Beil, F., von Bergmann, K. Sterol absorption and sterol balance in phytosterolemia evaluated by deuterium-labeled sterols: effect of sitostanol treatment. Journal of Lipid Research. 36 (8), 1763-1773 (1995).
  12. Miettinen, A. Phytosterolaemia, xanthomatosis and premature atherosclerotic arterial disease: a case with high plant sterol absorption, impaired sterol elimination and low cholesterol synthesis. European Journal of Clinical Investigation. 10 (1), 27-35 (1980).
  13. Salen, G., et al. Sitosterolemia. Journal of Lipid Research. 33 (7), 945-955 (1992).
  14. Caffrey, M. Membrane protein crystallization. Journal of Structural Biology. 142 (1), 108-132 (2003).
  15. Michel, H. Crystallization of membrane proteins. Trends in Biochemical Sciences. 8 (2), 56-59 (1983).
  16. Dürr, N., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelleslights up membrane protein structure. Chemical Reviews. 112 (11), 6054 (2012).
  17. Dürr, N., Soong, R., Ramamoorthy, A. When detergent meets bilayer: Birth and coming of age of lipid bicelles. Progress in nuclear magnetic resonance spectroscopy. 69 (1), 1-22 (2013).
  18. Dufourc, J. Bicelles and nanodiscs for biophysical chemistry. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1863 (1), 183478 (2021).
  19. Beaugrand, M., et al. Lipid concentration and molar ratio boundaries for the use of isotropic bicelles. Langmuir. 30 (21), 6162-6170 (2014).
  20. Sanders, R., Schwonek, P. Characterization of magnetically orientable bilayers in mixtures of dihexanoylphosphatidylcholine and dimyristoylphosphatidylcholine by solid-state NMR. Biochemistry. 31 (37), 8898-8905 (1992).
  21. Seddon, M., Curnow, P., Booth, J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  22. Farhat, D., et al. Structural analysis of cholesterol binding and sterol selectivity by ABCG5/G8. Journal of Molecular Biology. 434 (20), 167795 (2022).
  23. Lee, J. Y., et al. Crystal structure of the human sterol transporter ABCG5/ABCG8. Nature. 533 (7604), 561-564 (2016).
  24. Ujwal, R., Bowie, U. Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles. Methods. 55 (4), 337-341 (2011).
  25. Johnson, H., Lee, J. Y., Pickert, A., Urbatsch, L. Bile acids stimulate ATP hydrolysis in the purified cholesterol transporter ABCG5/G8. Biochemistry. 49 (16), 3403-3411 (2010).
  26. Wang, Z., et al. Purification and ATP hydrolysis of the putative cholesterol transporters ABCG5 and ABCG8. Biochemistry. 45 (32), 9929-9939 (2006).
  27. Faham, S. Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature. Protein Science. 14 (3), 836-840 (2005).

Tags

ABCG5/G8 lipidbicelle røntgenkrystallografi membranproteiner lipiddobbeltlag vaskemidler stabilitet ensartethet strukturkarakterisering biceller fosfolipider diffraksjonskrystaller av høy kvalitet høyoppløselig struktur naturlig konformasjon funksjonalitet tredimensjonale krystaller vaskemiddelløselige heterodimere ABCG5/G8 DMPC/CHAPSO-biceller kolesterol dampdiffusjon proteinkrystallisering
ABCG5 / G8 krystallisering i et lipidisk bicellemiljø for røntgenkrystallografi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wazir, S., Farhat, D., Srinivasan,… More

Wazir, S., Farhat, D., Srinivasan, M., Lee, J. Y. ABCG5/G8 Crystallization in a Lipidic Bicelle Environment for X-Ray Crystallography. J. Vis. Exp. (198), e65828, doi:10.3791/65828 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter