Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

ABCG5/G8 Kristallisation i lipidisk bicellmiljö för röntgenkristallografi

Published: August 25, 2023 doi: 10.3791/65828
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, Faculty of Medicine, University of Ottawa, 2Department of Biochemistry, Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta

Summary

Detta protokoll beskriver en uppställning för kristallisation av steroltransportören ABCG5/G8. ABCG5/G8 rekonstitueras till biceller för hängdroppskristallisation. Protokollet kräver inga specialiserade material eller substrat, vilket gör det tillgängligt och lätt att anpassa i alla laboratorier för att bestämma proteinstrukturen genom röntgenkristallografi.

Abstract

ATP-bindande kassetttransportörer (ABC) utgör lipidinbäddade membranproteiner. Extraktion av dessa membranproteiner från lipiddubbelskiktet till en vattenhaltig miljö uppnås vanligtvis genom att använda rengöringsmedel. Dessa rengöringsmedel sönderdelar lipiddubbelskiktet och löser proteinerna. Den inneboende livsmiljön för membranproteiner i lipiddubbelskiktet utgör en utmaning när det gäller att upprätthålla deras stabilitet och enhetlighet i lösning för strukturell karakterisering. Biceller, som består av en blandning av lång- och kortkedjiga fosfolipider och rengöringsmedel, replikerar den naturliga lipidstrukturen. Användningen av lipidbiceller och tvättmedel fungerar som ett lämpligt modellsystem för att erhålla diffraktionskristaller av hög kvalitet, speciellt för att bestämma den högupplösta strukturen hos membranproteiner. Genom dessa syntetiska mikromiljöer bevarar membranproteiner sin ursprungliga konformation och funktionalitet, vilket underlättar bildandet av tredimensionella kristaller. I detta tillvägagångssätt återintegrerades den tvättmedelslösliga heterodimeriska ABCG5/G8 i DMPC/CHAPSO-biceller, kompletterad med kolesterol. Denna uppställning användes i den experimentella ångdiffusionsproceduren för proteinkristallisation.

Introduction

ATP-bindande kassetttransportörer (ABC) utgör en superfamilj av membranproteiner som ansvarar för olika ATP-beroende transportprocesser över biologiska membran 1,2,3,4,5. Dessa transportproteiner är inblandade i hjärt-kärlsjukdomar och spelar en viktig roll för att underlätta kolesterolutflödet till gallan för efterföljande utsöndring i levern. Följaktligen har kolesterolmetabolism och kolesterolbalans väckt stort intresse under årenslopp 6. En specifik mekanism som är involverad i elimineringen av kolesterol och andra steroler från kroppen involverar medlemmar av den humana ABCG-underfamiljen, särskilt den heterodimera ABCG5/G8 7,8,9,10. Mutationer i någon av dessa gener stör heterodimeren, vilket leder till funktionsförlust och orsakar sitosterolemi, en sjukdom som påverkar sterolhandeln11,12,13. Med tanke på sjukdomens relevans och deras roll för att främja kolesterolutflöde har steroltransportörer väckt stor uppmärksamhet. Ändå är de intrikata detaljerna i deras molekylära mekanism och substratselektivitet i stort sett inte avslöjade. Således är klargörandet av kristallstrukturen hos ABCG5/G8 ett avgörande steg mot att förstå mekanismerna och nedströmsfunktionerna i kolesteroltransport.

Membranproteiner kräver förankring i membran för att veckas och fungera korrekt. Följaktligen resulterar extraktion av membranproteiner från deras naturliga miljö ofta i proteininstabilitet, felveckning och förlust av funktion14,15. Dessa utmaningar understryker de primära hindren för kristallisering av membranproteiner. Emellertid har rekonstituering av proteiner till syntetiska tvättmedelsskikt, som biceller, visat sig vara en lösning på detta problem, vilket gör det möjligt att upprätthålla membranproteiner i en naturligt liknande dubbelskiktsmiljö. Biceller är sammansättningar av syntetiska fosfolipider och rengöringsmedel suspenderade och solubiliserade i vatten. Noterbart är att de antar en tvåskiktsstruktur som efterliknar biologiska membran16,17,18. Biceller kan övergå mellan vätske- och gelfaser baserat på temperatur och viskositet. Bicellkristallisering drar nytta av de små tvåskiktsskivorna och den låga viskositeten vid reducerade temperaturer, vilket underlättar en grundlig blandning av proteiner och bicellelösningar. Storleken på bicellerna beror på förhållandet mellan tvättmedel och lipider under beredningen19,20. De vanligaste tvättmedlen för bicellbildning inkluderar 3-[(3-kolamidopropyl)dimetylammonio]-2-hydroxi-1-propansulfonat (CHAPSO), tillsammans med 3-[(3-kolamidopropyl)dimetylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS) och 1,2-ditridecanoyl-sn-glycerol-3-fosfokolin (DHPC)21. Dessa rengöringsmedel används tillsammans med lipider som di-myristoyl-fosfatidylkolin (DMPC) och 1-palmitoyl-2-oleoyl-fosfatidylkolin (POPC). Dessutom har nyligen genomförda studier visat att membranproteiner i biceller fungerar fullt ut under fysiologiska förhållanden. Till exempel har Lee och kollegor framgångsrikt kristalliserat och rapporterat kristallstrukturen för ABCG5/ABCG8 baserat på ett lipiddubbelskikt22,23. I kristallisationsprocessen kan protein-bicelleblandningar anpassas med hjälp av standardutrustning, inklusive kristallisationsrobotar med hög genomströmning24. Möjligheten att använda biceller beror dock på proteinernas termostabilitet på grund av kristallisationsförhållandena vid högre temperaturer. Icke desto mindre, jämfört med andra tekniker, förblir de nödvändiga kristallisationsförhållandena för membranproteiner i allmänhet milda, med låga koncentrationer av fällningsmedel, salt och buffert. Detta gör både protein-bicelleblandningar och ångdiffusion till effektiva och lättimplementerade verktyg för strukturstudier av membranproteiner.

Detta protokoll beskriver viktiga steg i proteinberedning och bicellkristallisation för att bestämma röntgenkristallstrukturen för ABCG5/G8 med hög upplösning (figur 1).

Protocol

1. Kloning och proteinuttryck

  1. Klona den humana ABCG5/G8-genen till Pichia pastoris-jäst enligt tidigare protokoll25,26. Kortfattat härleda pSGP18 och pLIC-uttrycksvektorer från pPICZB. Lägg till en tagg som kodar för ett rhinovirus 3C-proteasställe följt av en kalmodulinbindande peptid (CBP) till C-terminalen för ABCG8 cDNA (pSGP18-G8-3C-CBP).
    1. Lägg till en tagg med sex histidin separerad av ett glycin(His 6 GlyHis6) till C-terminalen av ABCG5 cDNA (pLIC-G5-H12). Samtransformera plasmiderna till Pichia-stammen KM71H med hjälp av elektroporering.
      OBS: Se materialtabellen för detaljer om plasmider, media och buffertar som används.
    2. Odla transformerade jästceller på MD-agarplattor vid 28 °C.
  2. Efter 1-2 dagar, välj 10-12 kolonier och inokulera dem i 10 ml minimalt glyceroljästkvävebasmedia (MGY) med 50 ml centrifugrör för småskalig odling.
    1. Gör tre små hål i centrifugrörets lock för bättre luftning. Låt cellerna växa vid 28 °C med konstant skakning vid 250 rpm tills den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) når 10, vanligtvis 1-2 nätter.
      OBS: Celltillväxt tar vanligtvis mellan 12-24 timmar.
  3. Nästa dag tar du 1 l sterilt MGY-medium och inokulerar det med primärkulturen i en 2,4 l kolv. Inkubera kolven vid 28 °C i en skakinkubator vid 250 rpm i 24 timmar.
    1. För att hålla pH mellan 5-6, tillsätt 10% ammoniumhydroxid (NH4OH) tills pH stabiliseras.
  4. Justera pH-värdet och inducera proteinuttryck genom att tillsätta 1 ml ren metanol per 1 l kultur (0,1 % (v/v) metanol).
    Mata cellerna därefter med 5 ml ren metanol per liter kultur (0,5 % (v/v) metanol) var 12:e timme under en total tid av 36-48 timmar.
  5. Skörda cellerna genom centrifugering vid 15 000 x g i 30 minuter vid 4 °C.
  6. Samla upp cellpellets och återsuspendera dem i lysbuffert (0,33 M sackaros, 0,3 M Tris-Cl pH 7,5, 0,1 M aminohexansyra, 1 mM EDTA och 1 mM EGTA) till en koncentration av 0,5 g/ml. Förvara suspensionen vid -80 °C. Vanligtvis kan man återvinna 30 ± 5 g cellmassa från 1 L odlade celler.
    OBS: Förvara cellpellets direkt i frysen eller utför omedelbar omblandning i lysbuffert för membranberedningar.

2. Beredning av mikrosomalt membran

  1. Tina cellerna och tillsätt proteashämmare (2 μg/ml leupeptin, 2 μg/ml pepstatin A, 2 mM PMSF, se Materialförteckning).
    1. För att ytterligare lysera celler, använd ett iskylt emulgeringsmedel eller mikrofluidiserare (se materialförteckning) vid 25 000-30 000 psi. Upprepa denna process 3-4 gånger.
    2. Centrifugera för att ta bort cellrester: centrifugera med 3 500-4 000 x g i 15 minuter, följt av en andra centrifugering med 15 000 x g i 30 minuter. Håll båda centrifugeringarna vid 4 °C.
  2. För att isolera mikrosomala membranvesiklar överförs supernatanten till ultracentrifugrör och utsätts för ultracentrifugering vid 2,00,000 x g i 1,5 timmar vid 4 °C.
    1. Återsuspendera membranpelleten i 50 ml buffert A (50 mM Tris-Cl pH 8,0, 100 mM NaCl och 10 % glycerol) med hjälp av en dounce homogenisator. Förvara suspensionen vid -80 °C.

3. Proteinberedning-rening av heterodimerer

  1. Tina de frysta mikrosomala membranen och justera koncentrationen till 4-6 mg/ml med hjälp av solubiliseringsbuffert. Bufferten ska innehålla 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 % glycerol, 1 % (w/v) β-dodecylmaltosid (β-DDM), 0,5 % (w/v) kolat, 0,1 % (w/v) kolesterylhemisuccinat (CHS), 5 mM imidazol, 5 mM β-merkaptoetanol (β-ME), 2 μg/ml leupeptin, 2 μg/ml pepstatin A och 2 mM PMSF (se Materialförteckning).
    OBS: Man kan blanda lika stora volymer av membranberedningen och solubiliseringsbufferten, eller använda 2x solubiliseringsbuffert utan proteashämmare och reduktionsmedel. Kortkokning av bufferten hjälper till att lösa upp CHS effektivt. Använd endast den 4 °C kylda bufferten för rening.
    1. Rör om blandningen på medelhastighet i 1 timme vid 4 °C. Följ detta med ytterligare omrörning i rumstemperatur (RT) i 20-30 min.
    2. Centrifugera blandningen vid 1,00,000 x g i 30 minuter vid 4 °C för att avlägsna olösliga membran. Samla upp den solubiliserade supernatanten och tillsätt 20 mM imidazol och 0,1 mM TCEP.
  2. Utför affinitetskolonnkromatografi26: bind den solubiliserade supernatanten till förjämviktade Ni-NTA-pärlor (10-15 ml) (se materialtabell) i buffert A (steg 2.2.1) över natten.
    OBS: Undvik att använda glycerol i löpande buffertar från och med nu.
    1. Tvätta kolonnen två gånger med 10 kolonnvolymer buffert B (50 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 % (w/v) β-DDM, 0,05 % (w/v) kolat, 0,01 % (w/v) CHS, 0,1 mM TCEP) innehållande 25 mM imidazol.
    2. Tvätta kolonnen med 10 kolonner volym buffert B innehållande 50 mM imidazol.
    3. Eluera proteinet med hjälp av buffert C (buffert B med 200 mM imidazol).
    4. Tillsätt 1 mM TCEP (se Materialförteckning) och 10 mM MgCl2 till de eluerade proteinerna.
    5. Validera de eluerade fraktionerna på en SDS-PAGE-gel för att bekräfta rätt proteinstorlek26.
      OBS: Typiskt proteinutbyte (1st Ni-NTA): 10-20 mg protein per 6 L odling. Använd DDM vid 10x eller 5x av dess kritiska micellkoncentration (CMC), cirka 0.01%. Detta protokoll använder 0,1 % DDM.
    6. Späd toppfraktionerna från Ni-NTA-eluering med en lika stor volym buffert D1 (buffert B med 1 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2), blanda och ladda proteinfraktionerna på en CBP-kolonn (3-5 ml) (se materialtabell) som har förjämplats med CBP-tvättbuffert D1.
    7. Utför sekventiella tvättar på CBP-kolonnen för att byta tvättmedel med buffert D1 och D2 (buffert B med 1 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 0.1 % (vikt/v) decylmaltos neopentylglykol (DMNG), utan β-DDM): tvätta först med 3 kolonnvolymer D1; för det andra, tvätta med 3 kolonnvolymer av D1:D2 (3:1, v/v); för det tredje, tvätta med 3 kolonnvolymer av D1:D2 (1:1, v/v); Fjärde steget, tvätta med 3 kolonnvolymer D1:D2 (1:3, v/v), följt av 6-10 kolonnvolymer D2.
    8. Eluera proteinet med hjälp av CBP wash Buffer D2 med 300 mM NaCl i 1 ml fraktioner från CBP-kolonnen (totalt 10 ml). Koncentrera de eluerade fraktionerna till 1-2 ml.
      OBS: Det typiska proteinutbytet (1st CBP) är 5-15 mg protein per 6 L kultur. Maltos neopentylglykol (MNG) rengöringsmedel förbättrar lagringen av renat protein vid 4 °C. Både DMNG och Lauryl MNG (LMNG) användes, där DMNG gav bättre röntgendiffraktionskristaller. Använd DMNG vid 10-20x av dess kritiska micellkoncentration (CMC), cirka 0.003%. Detta protokoll använde 0,1 % DMNG. En fraktion av CBP-eluatet kan renas ytterligare genom gelfiltreringskromatografi (steg 4.4.) för att analysera proteiners ATPasaktivitet eller bedöma monodispersitet genom transmissionselektronmikroskopi (TEM).

4. Proteinberedning-förkristallisationsbehandling

  1. Klyv de N-bundna glykanerna och CBP-taggarna med hjälp av endlykosidas H (Endo H, ~0,2 mg per 10-15 mg renat protein) respektive HRV-3C-proteas (~2 mg per 10-15 mg renat protein) (se materialförteckning). Inkubera över natten vid 4 °C.
  2. Under inkubationen av Endo H- och 3C-proteaserna utförs reduktiv alkylering på de poolade proteinerna. Börja med att inkubera med 20 mM jodacetamid (se materialtabell) över natten vid 4 °C. Följ detta med en 1 timmes inkubation med ytterligare 2 mM jodacetamid på is.
    OBS: Detta steg stabiliserar proteinlagringen ytterligare i upp till en månad vid 4 °C.
  3. Använd en andra CBP-kolonn (1-2 ml) för att separera den kluvna CBP-taggen. Använd buffert D2 för den här processen.
    OBS: Det typiska proteinutbytet (2:a CBP) är 5-10 mg protein per 6 L kultur.
  4. Rena det taggfria proteinet från CBP med hjälp av gelfiltreringskromatografi. Bufferten ska innehålla 10 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 % (w/v) DMNG, 0,05 % (w/v) kolat och 0,01 % (w/v) CHS.
    OBS: Det typiska proteinutbytet (gelfiltrering) är 2-8 mg protein per 6 L kultur. Under detta steg indikerar frånvaron av en DDM-topp (~65 kD) under gelfiltrering framgångsrikt utbyte av tvättmedel till DMNG.
  5. Modifiera de poolade proteinfraktionerna genom reduktiv metylering: tillsätt 20 mM dimetylaminboran (DMAB, se Materialförteckning) och 40 mM formaldehyd till proteinet. Inkubera i 2 timmar vid 4 °C i en oscillerande skakapparat. Lägg till 10 mM DMAB.
    1. Upprepa steg 4.5, inklusive tillsats av 10 mM DMAB, och inkubera över natten (12-18 timmar) vid 4 °C.
    2. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 100 mM Tris-Cl, pH 7,5.
  6. Ladda det metylerade proteinet på en 2 ml Ni-NTA-kolonn som är förbalanserad med 100 mM Tris-Cl, pH 8,0 och 100 mM NaCl.
    1. Tvätta kolonnen med 10 kolonnvolymer tvättbuffert (10 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, med 0,5 mg/mL DOPC: DOPE (3:1, vikt/vikt), 0,1 % (vikt/volym) DMNG, 0,05 % (vikt/volym) kolat, 0,01 % (vikt/volym) CHS).
    2. Eluera det relipiderade proteinet med hjälp av elueringsbuffert (10 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 200 mM imidazol, 0,5 mg/ml dopc: dope (1:1, vikt/vikt), 0,1 % (vikt/volym) DMNG, 0,05 % (vikt/volym) kolat, 0,01 % (vikt/volym) CHS).
      OBS: Det typiska proteinutbytet (2:a Ni-NTA) är 1-5 mg protein per 6 L kultur.
    3. Låt proteineluaten passera genom en PD-10-avsaltningskolonn som är i förbalans med den buffert som användes i steg 4.4.
  7. Inkubera det avsaltade och relipiderade proteinet över natten med kolesterol (berett i isopropanol eller etanol) till en slutlig koncentration på ~20 μM.
    1. Nästa morgon avlägsnas fällningsmedlet genom ultracentrifugering vid 1,50 000 x g i 10 minuter vid 4 °C. Samla supernatanten.
    2. Koncentrera proteinet till en slutlig koncentration på 30-50 mg/ml med hjälp av en 100 kDa cutoff centrifugalkoncentrator.
    3. Avlägsna fällningsmedlet med en bänkkyld centrifug på högsta hastighet i 30 minuter vid 4 °C.
    4. Håll supernatanten på is vid 4 °C och etablera kristallisationsförhållanden i bicellerna.
      OBS: De koncentrerade proteinerna bör användas för kristalltillväxt inom en vecka. Frys inte proteinerna.

5. Proteinkristallisation i biceller

  1. Bered en 10 % bicelle-stamlösning med DMPC-lipider och CHAPSO-rengöringsmedel i förhållandet 3:1 (vikt/vikt) (se materialförteckning).
    OBS: Använd CHAPSO vid 5 gånger dess kritiska micellkoncentration (CMC), cirka 0.5 %. På så sätt bibehålls tvättmedelskoncentrationen runt CMC i protein-bicelleblandningen (steg 5.2).
    1. Tillsätt avjoniserat H2O-upplöst tvättmedel (CHAPSO) till förtorkade lipider (blandning av 5 mol% kolesterol och 95 mol% DMPC).
      OBS: Förbered olika lipidkompositioner i kloroform och torka dem i ett glasprovrör med hjälp av en kvävgasström vid RT. Eliminera kvarvarande lösningsmedel genom att placera dem i en vakuumkammare över natten och bilda ett tunt lipidskikt.
    2. Blanda lipider och rengöringsmedel med hjälp av en sonikator i vattenbad.
    3. Ultraljudsbehandla bicelleblandningen i iskallt vatten med kontinuerlig effekt tills lösningen blir genomskinlig.
      OBS: Använd hörselskydd och se till att det finns tillräckligt med is för att hålla blandningen i flytande fas.
    4. Ta bort olösta komponenter med ett 0.2 μm centrifugalfilter (se materialförteckning).
      OBS: Förvara den alikvoterade bicellelösningen vid -80 °C.
  2. Skapa en protein/bicelle-blandning på is genom att försiktigt kombinera 10 % biceller (steg 5.1.4) och proteiner (steg 4.7.4) i förhållandet 1:4 (v/v), vilket ger en slutlig proteinkoncentration mellan 5-10 mg/ml.
  3. Inkubera protein- och bicelleblandningen på is i 30 min.
  4. Ställ in kristallisationsförhållanden i ett hängande droppångdiffusionsformat med hjälp av 48-brunnars plattor.
    1. Blanda lika stora volymer (0,5 eller 1 μL) protein/bicelle-blandning och kristallisationsreservoarlösning innehållande 1,6 M-2,0 M ammoniumsulfat, 100 mM MES (pH 6,5), 0%-4% PEG 400 och 1 mM TCEP (se materialförteckning).
      OBS: Skapa en matris av reservoarlösningen före varje experiment, justera ammoniumsulfat (1.6-2.0 M) och PEG 400 (0%-4%).
    2. Inkubera för kristallisation vid 20 °C.
    3. Kontrollera kristalliseringsbrickorna nästa dag för att säkerställa korrekt tätning av täckglaset.
    4. Övervaka kristalltillväxten minst en gång dagligen. Kristaller av hög kvalitet uppträder vanligtvis inom 1-2 veckor och mäter 50-150 μm x 20-50 μm x 2-5 μm.
      OBS: Kristaller kan ta längre tid att bildas vid lägre proteinkoncentrationer. Mogna kristaller bör skördas inom en månad.
    5. Blötlägg proteinkristaller i 0,2 M natriummalonat och snabbfrys dem i flytande kväve med 50 eller 100 μm kryoslingor.
      OBS: Om en röntgendiffraktometer finns tillgänglig, testa några kristaller med en 15-30 min röntgenstrålexponering för att avslöja diffraktion upp till 5 Å. Diffraktion med högre upplösning kräver en synkrotronljuskälla. Med 0,2 M natriummalonat som kryoskyddsmedel kan en kristall som mäter 100 μm x 50 μm x 2 μm ge cirka 90 diffraktionsbildramar med synkrotronröntgen.

Representative Results

Rekombinanta ABC-halvtransportörer, humana ABCG5 och ABCG8, uttrycks samtidigt i Pichia pastoris-jäst . Jästmembranfraktionen fraktioneras sedan genom centrifugering. Som beskrivs i detta protokoll extraheras de heterodimeriska proteinerna med hjälp av tandemkolonnkromatografi. Därefter kristalliseras kemiskt förbehandlade proteiner genom att de inkuberas med fosfolipid/kolesterolbiceller. Schematiska översikter över renings- och kristallisationsprocesserna finns i figur 1.

För att bedöma monodispersiteten hos de renade proteinerna färgas prover som innehåller 0,01-0,05 mg/ml proteiner med 1%-2% uranylacetat. Dessa prover undersöks sedan med negativ infärgning av TEM (figur 2A). För att utvärdera proteinstabilitet utan att genomgå frys-upptiningscykler används analytisk gelfiltreringskromatografi. Denna analys innebär att man övervakar tidsförloppet för renade proteiner genom att använda små alikvoter av proteinerna (figur 2B). Det kan förekomma en liten förlust av proteiner vid toppfraktionerna efter en veckas inkubation vid 4 °C, möjligen på grund av kvarvarande lösliga proteinaggregat. Ändå är det totala proteinutbytet fortfarande tillräckligt för kristalltillväxt. Användningen av TEM med negativ färgning och analytisk gelfiltreringskromatografi är en standardpraxis för att bedöma proteiners lämplighet för kristallisation, särskilt från olika konstruerade konstruktioner.

För bedömning av proteinkvaliteten vid varje steg i kolonnkromatografiprocessen, liksom efter den kemiska förkristallisationsbehandlingen, laddas alikvoter av fraktioner motsvarande två Ni-NTA-kolonner, två CBP-kolonner, en gelfiltrering och reduktiv alkylering på en 10 % SDS-PAGE-gel (figur 3). Dessutom kan samma reaktionsmiljö som används för alkylering tillämpas för kvicksilvermärkning med etylkvicksilver (EMTS), även om detta ligger utanför ramen för den aktuella studien.

Tillväxten av kristaller övervakas dagligen med hjälp av ett stereomikroskop utrustat med en polarisator. Kristaller som är mogna och lämpliga för datainsamling uppnår i allmänhet dimensionerna 50 μm x 100 μm x 2 μm (figur 4). Under kristallskördsprocessen undviks medvetet mindre kristaller eller kluster.

Figure 1
Figur 1: Schematiska översikter för rening (A) och bicellkristallisation (B) av heterodimera ABCG5/G8. Konstruktioner av rekombinant humant ABCG5 (hG5) och ABCG8 (hG8) bär RGS-H 6-G-H6 respektive 3C-CBP-taggar (A, överst). Tandemaffinitetskolonnkromatografi, följt av gelfiltreringskromatografi för att uppnå heterodimär rening (A, nederst). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Utvärdering av monodispersitet (A) och stabilitet (B) hos renade proteiner . (A) Elektronmikroskop av negativt färgade ABCG5/G8 (G5G8) heterodimerer med användning av TEM. Representativa partiklar markeras i helvita cirklar. Skalstapel = 100 nm. B) Alkylerade proteiner lagrade vid 4 °C analyserade med analytisk gelfiltreringskromatografi under loppet av en månad med en lätt förlust av proteiner efter en vecka. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: SDS-PAGE-analys av proteineluat med kolonnkromatografi och reduktiv alkylering. Olika volymer (1-10 μL) proteinfraktioner laddades på en 10% Tris/Glycine gel och kördes i 45 minuter med en konstant spänning på 200 V. Gelen färgades med Coomassie blue, avfärgades, lufttorkades och skannades av en bordsskanner. 1° och 2° Ni: första och andra Ni-NTA-kolonnen; 1° och 2° CBP: första och andra CBP-kolonnen; Toppfraktioner heldragen linje: poolade fraktioner för kristallisation; Toppfraktioner streckad linje: axelfraktioner; EMTS: etylkvicksilvertiosalicynat; IA: jodacedamid. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Bedömning av proteinkristallmognad med ljusmikroskopi. Mogna kristaller av ABCG5/G8 från en kristallisationsdroppe visualiserades under en bordsskiva och polarisatorutrustat stereomikroskop. Skalstapel = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

De utmaningar som är förknippade med kristalliserande membranproteiner har föranlett utvecklingen av lipid-dubbelskiktsdrivna kristallisationsmetoder, såsom bicelle27 eller lipidkubisk fas (LCP)14-metoder . Att uppnå framgångsrik kristallisation av membranproteiner är dock fortfarande beroende av det kritiska och ibland flaskhalsade steget i proteinframställningen. Noterbart är att ABC-transportörer utgör ett formidabelt hinder för att odla kristaller som är lämpliga för röntgenkristallografi. Detta protokoll ger omfattande praktisk vägledning för att effektivisera beredningen av human ABCG5/G8-steroltransportör och främja kristalltillväxt genom bicellekristallisationsmetoden.

En viktig faktor vid utformningen av detta protokoll var nödvändigheten av ett betydande proteinutbyte i de inledande faserna av proteinrening, vilket möjliggör en viss grad av proteinförlust under förkristallisationsbehandling (figur 3). Vanliga strategier för att ta itu med denna utmaning involverar omfattande proteinteknik, användning av olika uttrycksvärdar och utforskning av ortologer eller homologer, bland andra metoder. Icke desto mindre, med denna till synes invecklade procedur, har ett antal avgörande steg identifierats som stöder protokollets framgång och även ger insikter om potentiella begränsningar som kan uppstå när man studerar andra ABC-transportörer eller membranproteiner i allmänhet.

För det första använder detta protokoll noggrann centrifugering vid varje steg för att minimera proteinaggregeringen. Dessutom är kontinuerlig övervakning av de renade proteinernas termostabilitet avgörande. Elektronmikroskopi används för att verifiera proteinets monodispersitet, medan analytisk gelfiltrering spårar proteinstabilitet över tid (figur 2). Alternativa tekniker som cirkulär dikroism (CD) eller differentiell skanningskalorimetri (DSC) kan också införlivas. Dessutom är inkorporering av lipider i specifika stadier avgörande för att maximera både aktiviteten och kristallogenesen av den renade ABCG5/G8. Till exempel är kolat och CHS nödvändiga för att uppvisa mätbar ATP-hydrolys; fosfolipider är oumbärliga för att upprätthålla stabiliteten hos metylerade proteiner; och kolesterol är en nödvändig komponent i bicellelösningen, vilket främjar kristalltillväxt som är lämplig för högupplöst röntgendiffraktion (figur 4).

I huvudsak kan hela proceduren utföras inom en veckas ansträngning. Till skillnad från LCP är det enkelt att hämta kristaller från kristallisationsbrickor med hängande droppar. Med ett betydande proteinutbyte (cirka 10 mg) är detta protokoll lätt att anpassa för att utveckla kristallografiska undersökningar som involverar ABCG5/G8-mutanter eller andra transportproteiner. Detta är särskilt relevant för fall som för närvarande undgår visualisering genom elektronmikroskopi.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av ett Natural Sciences and Engineering Research Council Discovery Grant (RGPIN 2018-04070) och ett Canadian Institutes of Health Research Project Grant (PJT-180640) till JYL. Detta protokoll är baserat på de ursprungliga rapporterna i ABCG5/G8 kristallstrukturer som tidigare rapporterats av Farhat et al.22 och Lee et al.23.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABCG5 National Institute of Health collection  NCBI accession number NM_022436
ABCG8 National Institute of Health collection  NCBI accession number NM_022437
ÄKTA FPLC system  Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences)
CaCl2 Wisent 600-024-CG Anhydrous
CBP Agilent 214303 Calmodulin binding peptide affinity resin
Centrifugal concentrators (Vivaspin) Sartorius
CHAPSO  Anatrace C317 Anagrade
Cholesterol Anatrace CH200
CHS Steraloids C6823-000
DMAB MilliporeSigma 180238 97%
DMNG Anatrace NG322
DMPC Anatrace D514
DOPC Avanti 850375
DOPC Anatrace D518
DOPE Avanti 850725
DTT Fisher BP172
Dual Thickness MicroLoops MiTeGen
EDTA BioShop EDT003 Disodium salt, dihydrate
EGTA MilliporeSigma 324626
Emulsifier (EmulsiFex-C3) Avestin
Endo H New England Biolabs P0702
Ethanol Greenfield P016EAAN Ethyl Alcohol Anhydrous
Formaldehyde MilliporeSigma 252549 ACS Reagent
Glycerol BioShop GLY004
HEPES BioShop HEP001
HRV-3C protease Homemade
Imidazole BioShop IMD510 Reagent grade
Iodoacetamide MilliporeSigma I1149 BioUltra
Isopropanol Fisher BP2618212
Leupeptin BioShop LEU001
MES MilliporeSigma 69892 BioUltra
Methanol Fisher A412P
MgCl2 Wisent 800-070-CG Hydrated
microfluidizer (LM 20) Microfluidics
NaCl BioShop SOD002
NH4OH Fisher A669-212 ACS Reagent
Ni-NTA superflow Qiagen 30430 Nickel-charged resins
PEG 400 MilliporeSigma 202398
Pepstatin BioShop PEP605
PMSF MilliporeSigma P7626
pSGP18 and pLIC  Homemade (derived from pPICZ, Invitrogen)
SDS BioShop SDS003
Sodium cholate Fisher 229101
Sodium malonate MilliporeSigma 63409
Sucrose Wisent 800-081-WG Ultra pure
Superdex 200 30/100 GL Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences) 28990944 Prepacked gel-filtration column
TCEP
TEM FEI, Technai
Tris Base Fisher BP152
β-DDM Anatrace D310S Sol Grade
β-mercaptoethanol MilliporeSigma
ε-aminocaproic acid Fisher AAA1471936

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hamada, H., Tsuruo, T. Purification of the 170- to 180-kilodalton membrane glycoprotein associated with multidrug resistance. 170- to 180-kilodalton membrane glycoprotein is an ATPase. Journal of Biological Chemistry. 263 (3), 1454-1458 (1988).
  2. Higgins, F., Hiles, D., Whalley, K., Jamieson, J. Nucleotide binding by membrane components of bacterial periplasmic binding protein-dependent transport systems. The EMBO Journal. 4 (4), 1033-1039 (1985).
  3. Higgins, F., et al. A family of related ATP-binding subunits coupled to many distinct biological processes in bacteria. Nature. 323 (6087), 448-450 (1986).
  4. Horio, M., Gottesman, M., Pastan, I. ATP-dependent transport of vinblastine in vesicles from human multidrug-resistant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (10), 3580-3584 (1988).
  5. Mimmack, L., et al. Energy coupling to periplasmic binding protein-dependent transport systems: stoichiometry of ATP hydrolysis during transport in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (21), 8257-8261 (1989).
  6. Grundy, M. Absorption and Metabolism of Dietary Cholesterol. Annual Review of Nutrition. 3 (1), 71-96 (1983).
  7. Berge, E., et al. Accumulation of dietary cholesterol in sitosterolemia caused by mutations in adjacent ABC transporters. Science. 290 (5497), 1771-1775 (2000).
  8. Repa, J., et al. Regulation of ATP-binding cassette sterol transporters ABCG5 and ABCG8 by the Liver X receptors α and β. Journal of Biological Chemistry. 277 (21), 18793-18800 (2002).
  9. Yu, L., et al. Stimulation of cholesterol excretion by the Liver X receptor agonist requires ATP-binding cassette transporters G5 and G8. Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15565-15570 (2003).
  10. Yu, L., et al. Expression of ABCG5 and ABCG8 is required for regulation of biliary cholesterol secretion. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 8742-8747 (2005).
  11. Lütjohann, D., Björkhem, I., Beil, F., von Bergmann, K. Sterol absorption and sterol balance in phytosterolemia evaluated by deuterium-labeled sterols: effect of sitostanol treatment. Journal of Lipid Research. 36 (8), 1763-1773 (1995).
  12. Miettinen, A. Phytosterolaemia, xanthomatosis and premature atherosclerotic arterial disease: a case with high plant sterol absorption, impaired sterol elimination and low cholesterol synthesis. European Journal of Clinical Investigation. 10 (1), 27-35 (1980).
  13. Salen, G., et al. Sitosterolemia. Journal of Lipid Research. 33 (7), 945-955 (1992).
  14. Caffrey, M. Membrane protein crystallization. Journal of Structural Biology. 142 (1), 108-132 (2003).
  15. Michel, H. Crystallization of membrane proteins. Trends in Biochemical Sciences. 8 (2), 56-59 (1983).
  16. Dürr, N., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelleslights up membrane protein structure. Chemical Reviews. 112 (11), 6054 (2012).
  17. Dürr, N., Soong, R., Ramamoorthy, A. When detergent meets bilayer: Birth and coming of age of lipid bicelles. Progress in nuclear magnetic resonance spectroscopy. 69 (1), 1-22 (2013).
  18. Dufourc, J. Bicelles and nanodiscs for biophysical chemistry. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1863 (1), 183478 (2021).
  19. Beaugrand, M., et al. Lipid concentration and molar ratio boundaries for the use of isotropic bicelles. Langmuir. 30 (21), 6162-6170 (2014).
  20. Sanders, R., Schwonek, P. Characterization of magnetically orientable bilayers in mixtures of dihexanoylphosphatidylcholine and dimyristoylphosphatidylcholine by solid-state NMR. Biochemistry. 31 (37), 8898-8905 (1992).
  21. Seddon, M., Curnow, P., Booth, J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  22. Farhat, D., et al. Structural analysis of cholesterol binding and sterol selectivity by ABCG5/G8. Journal of Molecular Biology. 434 (20), 167795 (2022).
  23. Lee, J. Y., et al. Crystal structure of the human sterol transporter ABCG5/ABCG8. Nature. 533 (7604), 561-564 (2016).
  24. Ujwal, R., Bowie, U. Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles. Methods. 55 (4), 337-341 (2011).
  25. Johnson, H., Lee, J. Y., Pickert, A., Urbatsch, L. Bile acids stimulate ATP hydrolysis in the purified cholesterol transporter ABCG5/G8. Biochemistry. 49 (16), 3403-3411 (2010).
  26. Wang, Z., et al. Purification and ATP hydrolysis of the putative cholesterol transporters ABCG5 and ABCG8. Biochemistry. 45 (32), 9929-9939 (2006).
  27. Faham, S. Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature. Protein Science. 14 (3), 836-840 (2005).

Tags

ABCG5/G8 Lipidbicelle röntgenkristallografi membranproteiner lipiddubbellager tvättmedel stabilitet enhetlighet strukturell karakterisering biceller fosfolipider högkvalitativa diffraktionskristaller högupplöst struktur naturlig konformation funktionalitet tredimensionella kristaller tvättmedelslöslig heterodimerisk ABCG5/G8 DMPC/CHAPSO-biceller kolesterol ångdiffusion proteinkristallisation
ABCG5/G8 Kristallisation i lipidisk bicellmiljö för röntgenkristallografi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wazir, S., Farhat, D., Srinivasan,… More

Wazir, S., Farhat, D., Srinivasan, M., Lee, J. Y. ABCG5/G8 Crystallization in a Lipidic Bicelle Environment for X-Ray Crystallography. J. Vis. Exp. (198), e65828, doi:10.3791/65828 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter