Summary
Burada, aynı biyolojik kökeni ve doğal hücre dışı veziküllerin (EV'ler) benzer yapısını, morfolojisini ve protein bileşimini paylaşan yeni bir tür eksozom taklitleri (EM'ler) olarak endozomdan türetilmiş nanoveziküllerin büyük ölçekli üretimi için manyetik ayırma destekli yüksek hızlı bir homojenizasyon yöntemini açıklıyoruz.
Abstract
Hücre dışı veziküller (EV'ler) fizyolojik ve patolojik araştırmalarda, hastalık teşhisinde ve tedavisinde büyük ilgi görmüştür; Bununla birlikte, klinik çevirileri, ölçek büyütme üretim yaklaşımlarının eksikliği nedeniyle sınırlı kalmıştır. Bu nedenle, bu protokol, geleneksel ultrasantrifüjleme yönteminden yaklaşık 100 kat daha yüksek verime sahip olan endozomlardan türetilen yeni bir eksozom taklitleri (EM'ler) türü olarak endozom türevli nanoveziküllerin büyük ölçekli üretimi için manyetik ayırma destekli yüksek hızlı bir homojenizasyon yöntemi sağlar. Bu yöntemde, manyetik nanopartiküller (MNP'ler) ebeveyn hücreleri tarafından endositoz yoluyla içselleştirildi ve daha sonra endozomlarında biriktirildi. Daha sonra MNP yüklü endozomlar toplanarak hipotonik tedavi ve manyetik ayırma ile saflaştırıldı. MNP yüklü endozomları monodispers nanoveziküllere ayırmak için yüksek hızlı bir homojenizatör kullanıldı. Elde edilen endozom türevli veziküller, nanopartikül izleme analizi, transmisyon elektron mikroskobu ve western blotlama ile karakterize edilen aynı biyolojik kökene ve yapıya sahiptir. Morfolojileri ve protein bileşimleri doğal EV'lere benzer, bu da EM'lerin potansiyel olarak klinik çeviriler için yerel EV'lerin düşük maliyetli ve yüksek verimli bir vekili olarak hizmet edebileceğini gösterir.
Introduction
Hücre dışı veziküller (EV'ler), hemen hemen tüm hücreler tarafından salgılanan, 30-150 nm boyut aralığında, bol miktarda biyoaktif madde içeren küçük veziküllerdir. Orijin hücreye bağlı olarak, EV'ler yüksek heterojenlik gösterir ve ana hücrelere özgü birden fazla bileşene sahiptir1. EV'ler vücut sıvılarına salınır ve doku onarımı, tümör teşhisi ve tedavisi ve bağışıklık modülasyonu için çok çeşitli biyoaktif moleküller ve ilaçlar sağlamak için kullanılabileneylem 2 için hedef hücreler tarafından alındıkları uzak bölgelere taşınır 3,4. Bununla birlikte, vücut sıvılarında benzer biyofiziksel özelliklere sahip diğer biyolojik nanopartiküller (örneğin, lipoproteinler) ve nanoveziküller (örneğin, endozomal olmayan yollardan türetilen EV'ler) kaçınılmaz olarak EV izolasyonunu ve saflaştırılmasını etkiler. Bugüne kadar, ultrasantrifüjleme, EV izolasyonu için altın standart olmaya devam etmektedir ve sükroz yoğunluk gradyan santrifüjü, ultrafiltrasyon, polietilen glikol çökeltme, kromatografi ve immünomanyetik boncuk izolasyonu dahil olmak üzere diğer izolasyon yöntemleri geliştirilmiştir5. EV terapötiklerinin klinik çevirisini ve ticarileştirilmesini sınırlayan mevcut darboğaz, EV'lerinyüksek düzeyde ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir izolasyonuna izin veren izolasyon tekniklerinin ciddi eksikliğidir 6,7,8. Geleneksel EV izolasyon teknikleri (örneğin, ultrasantrifüjleme ve boyut dışlama kromatografisi) düşük verimden (1 x 107-1 x 108/1 x 10 6 hücre), uzun üretim döngüsünden (24-48 saat), ürün kalitesinin zayıf tekrarlanabilirliğinden muzdariptir ve EV'ler için mevcut klinik talebi karşılayamayan pahalı ve enerji yoğun üretim ekipmanı gerektirir6.
Yerel EV'lerin sentetik vekilleri olan eksozom taklitleri (EM'ler), üretimdeki oldukça benzer yapıları, işlevleri ve ölçeklenebilirlikleri nedeniyle büyük ilgi görmüştür. EM'lerin ana kaynağı, doğal EV'ler11,12 olarak güçlü biyolojik işlevler gösteren, sürekli kesitleme 9,10 ile tüm ebeveyn hücrelerinin doğrudan ekstrüzyonudur. Örneğin, insan göbek kordonu mezenkimal kök hücrelerinden (hUCMSC'ler) türetilen EM'ler, doğal EV'lerle benzer yara iyileştirici etkiler gösterir ve protein bileşimi bakımından daha zengindir13. Tüm hücrelerden türetilen EM'ler, EV'lerin biyolojik karmaşıklığına sahip olsa da, ana dezavantajları, ürünlerin heterojenliğidir, çünkü kaçınılmaz olarak çeşitli hücresel organeller ve hücre kalıntıları tarafından kontamine olurlar. Protein lokalizasyon analizi ayrıca, tam hücre ekstrüzyonundan türetilen EM'lerin, mitokondri ve endoplazmik retikulumdan EV'lere özgü olmayan birçok protein içerdiğini ortaya koydu13. Ayrıca, EM'leri üretmek için kullanılan yöntemlerin çoğu, oldukça zaman ve enerji tüketen bir süreç olan ultrasantrifüjleme gerektirir14. Eksozomların yalnızca hücresel endozomlardan türetildiği gerçeğini göz önünde bulundurarak, biyomühendislik ürünü endozomdan türetilen nanoveziküllerin, tüm hücre ekstrüzyon yöntemi14 tarafından üretilen iyi kurulmuş hücre zarından türetilmiş EM'lere kıyasla eksozomlar ve EM'ler arasındaki biyolojik homolojiyi daha iyi özetleyebileceğini varsaydık. Bununla birlikte, endozom türevi nanoveziküllerin üretimi, uygulanabilir yaklaşımların olmaması nedeniyle zordur.
Klinik çalışmalar, çeşitli hastalıkların tedavisi için hücresiz tedavinin bir vekili ve nano ölçekli bir ilaç dağıtım sistemi olarak EV'ler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Örneğin, kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinden elde edilen EV'ler, COVID-19'un neden olduğu şiddetli pnömoniyi tedavi etmek için kullanılmış ve umut verici sonuçlar elde etmiştir. Son zamanlarda, CD24 proteinleri taşıyan genetiği değiştirilmiş EV'ler de COVID-19 hastalarının tedavisi için güçlü terapötik faydalar göstermiştir15,16. Bununla birlikte, EV tedavisinin klinik gereksinimi, düşük verim ve maliyet nedeniyle geleneksel izolasyon yöntemleriyle hala karşılanamamaktadır. Bu çalışma, manyetik ayırma destekli yüksek hızlı homojenizasyon yaklaşımı yoluyla endozom türevli nanoveziküllerin büyük ölçekli üretimini bildirmektedir. MNP yüklü endozomları manyetik ayırma yoluyla izole etmek için MNP'lerin endositoz yolundan yararlanır, ardından endozomları monodispers nanoveziküller halinde formüle etmek için yüksek hızlı homojenizasyon yapar. Bu protokol tarafından toplanan endozom türleri çok çeşitli olduğundan, endüstride iyi üretim uygulamaları (GMP) oluşturmak için daha derinlemesine araştırmalara ihtiyaç vardır. Bu yeni EM hazırlama yaklaşımı, doğal EV'lere homolog nanoveziküller elde etmek için daha fazla zaman verimlidir (5 dakikalık yüksek hızlı homojenizasyon). Genellikle çeşitli hücre tiplerine uygulanabilen ultrasantrifüjlemeye göre aynı miktarda hücreden katlanarak daha fazla vezikül üretir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Yöntemin şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. EM hazırlığı ve izolasyonu
- MNP'lerin hücre içselleştirmesi
- Hücre kültürü
- 1 × 106 sıçan kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (BMSC), 293T hücreleri veya Fare yumurtalık epitel kanseri hücrelerini (ID8) DMEM tam ortamında% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 5 penisilin-streptomisin çözeltisi (P / S) altı oyuklu plaka başına 2 mL'de askıya alın (bkz.
- Hücreleri gece boyunca 37 °C ve% 5 CO2'de kültürleyin.
NOT: Yapışmadan sonraki hücre sayısı yaklaşık 1 × 106 idi.
- MNP'lerin endositozu
- Her altı oyuklu plakanın orta hacmini 1 mL'ye düşürün. Hücreleri, 100 μg/1 × 106 hücre konsantrasyonunda 10 nm polilisin ile modifiye edilmiş demir oksit nanopartikülleri (IONP'ler) (Malzeme Tablosuna bakınız) ile birlikte kültürleyin ve hücrelerin IONP'leri tamamen endositoz etmesine izin vermek için 12 saat boyunca% 5 CO2 içeren bir atmosferde 37 ° C'de inkübe edin.
- Hücre kültürü
- Endozomların izolasyonu ve homojenizasyonu
- Hücre hipotonik tedavisi
- IONP'leri tamamen içselleştirmiş hücreleri 3 dakika boyunca 0.5 mL/kuyucuklu tripsin ile sindirin ve 1 mL/kuyucuk tam ortam ekleyerek sindirimi sonlandırın.
- 5 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücreleri fosfat tamponu salin (PBS) ve santrifüj içinde, artık ortamı ve emilmemiş IONP'leri yıkamak için tekrar tekrar iki kez yeniden süspanse edin.
- Son olarak, peleti önceden hazırlanmış hipotonik çözelti (71.4 mM potasyum klorür, 1.3 mM sodyum sitrat, pH 7.2-7.4) içinde 8 mL'de 15 dakika boyunca yeniden süspanse edin (bkz.
- Düşük hızlı homojenizasyon ile organellerin serbest bırakılması
- Hipotonik çözelti içindeki hücre süspansiyonunu bir cam test tüpüne aktarın ve bir cam homojenizatör kullanarak organelleri serbest bırakın (Malzeme Tablosuna bakınız) 1000 rpm'de 20 şok.
- Endozomları elde etmek için manyetik ayırma
- Homojenize hücre çözeltisinin 1 mL'sini 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve IONP yüklü endozomları diğer organellerden (çekirdek ve mitokondri gibi) ve hücre kalıntılarından tamamen ayırmak için 1 saat manyetik bir ayırıcıya yerleştirin.
- Manyetik çerçevenin yanındaki mikrosantrifüj tüplerinin temas yüzeyindeki kahverengi peletleri toplayın (Malzeme Tablosuna bakınız), yani IONP yüklü endozomlar. Mikrosantrifüj tüplerindeki sıvıyı atın ve endozomları yeniden süspanse etmek için 3 mL PBS ekleyin.
- Hücre hipotonik tedavisi
- Yüksek hızlı homojenizasyon
- Endozomları içeren çözeltiyi, sıvı hacmi 3-10 mL arasında olan 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
- Yüksek hızlı homojenizatörün 10 mm'lik probunu ( bkz. Malzeme Tablosu) tabana dokunmadan santrifüj tüpünün dibine uzatın. Ekranın altındaki Hız düğmesini ayarlayın, hızı 140 x g'ye ayarlayın ve Zaman düğmesini 5 dakikalık süreyi ayarlayacak şekilde ayarlayın, ardından OK düğmesine basın.
- Numunenin altına bir buz kutusu yerleştirdikten sonra homojenizasyonu gerçekleştirmek için Başlat düğmesine basın.
- EM'ler için manyetik sıralama
- Yüksek hızlı homojenizasyondan elde edilen nanovezikül içeren çözeltiyi 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 1 saat boyunca manyetik bir ayırıcıya koyun.
- Gerekli EM'leri içeren sıvıyı toplayın. Serbest IONP'leri ve IONP yüklü EM'leri adsorbe eden manyetik çerçevenin yanındaki tüplerin yüzeyine dokunmamaya dikkat edin.
2. EM karakterizasyonu (Şekil 2 ve Şekil 3)
- Dinamik ışık saçılımı (DLS) analizi
- 1 mL EM numunesi (20 μg/mL) duvar boyunca küvete enjekte edin ve DLS cihazının cihaz s'sine yerleştirin.amp yuvası (Malzeme Tablosuna bakın).
- DLS yazılımını açın, Parçacık Boyutu Testi'ni seçin ve teste başlayın.
- Bir BCA protein tahlil kiti kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Nanopartikül izleme analizi (NTA)
- EM'leri PBS ile 1 × 107-1 × 108 partikül / mL'lik bir çözeltiye seyreltin ve bunları 500-1000 μL / dak akış hızında 1 mL'lik bir şırınga kullanarak NTA cihazının odasına (Malzeme Tablosuna bakınız) enjekte edin.
- 488 lazer kanalını açın ve yazılım arayüzündeki EM sayısının 100-300 arasında ve Brown hareketinde olduğundan emin olun.
- Üreticinin protokolüne göre, cihazın hassasiyetinin EM tespiti için uygun olduğundan emin olmak için uygun SOP'yi (EV-488) seçin.
- Transmisyon elektron mikroskobu (TEM)
- EM'leri (1 mg / mL) 30 dakika boyunca eşit hacimde% 5 glutaraldehit ile sabitleyin ve EM'lerin konsantrasyonunu BCA protein test kiti ile 1 mg / mL olarak ölçün.
- Bakır ağın karbon tarafına 10 μL'lik bir EM damlası yerleştirin ve 10 dakika sonra filtre kağıdı ile fazla sıvıyı temizleyin. 10 μL PBS ekleyin ve hemen filtre kağıdı ile kurulayın. Fazla glutaraldehiti çıkarmak için iki kez tekrarlayın.
- 5 μL uranil asetat kontrast maddesini damlatın ve 1 dakika boyunca negatif olarak boyayın, ardından fazla kontrast maddeyi çıkarın. Deiyonize su ile üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında (RT) kurutun.
- 100 kV ivme geriliminde bir TEM ile görüntü kaydedin.
- Batı lekeleme
- Numunelere 100 μL hücre lizis tamponu ve 5 μL 50x proteaz inhibitör kokteyli ekleyin (bkz. Bir pipet tabancasıyla hafifçe karıştırın ve 30 dakika boyunca buza koyun.
- Çözeltiyi 1000 ° C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin, süpernatantın protein konsantrasyonunu bir BCA protein test kiti ile ölçün ve toplayın.
- 100 μL'lik süpernatanı 25 μL 5x protein yükleme tamponu ile karıştırın ve 95 °C'de 10 dakika ısıtın.
- Jelleri önceden oluşturulmuş jellerin talimatlarına göre hazırlayın. Oyuk başına 15 μg protein yükleyin ve 80 V'ta jel elektroforezi ile çalıştırın. Numunenin ayırma jeline akmasını bekleyin, 100 V'a geçin ve ardından proteini buz banyosu altında 60 dakika 100 V'ta bir nitroselüloz membrana aktarın.
- EV'ye özgü olmayan belirteçleri (Calnexin) ve EV biyobelirteçlerini (Annexin ve CD63) western blotting ile tespit edin (bkz.
NOT: Antikorlar, üreticinin tavsiyelerine göre seyreltilir.
3. In vitro EM fonksiyon algılama
- EM etiketleme
- 1 μL PKH26'yı 250 μL seyreltici C (1:250) ile karıştırarak 2x boyama çözeltisi (4 × 10-6 M) yapın (bkz.
- 250 μL EM'yi (1 mg/mL) 250 μL 2x boyama solüsyonu ile karıştırın ve pipetleme tabancasıyla hızlıca üfleyin.
- Santrifüj tüpünü nazikçe ters çevirirken RT'de 2-5 dakika inkübe edin.
- Eşit hacimde serum veya% 1 sığır serum proteini ekleyin ve sindirimi sonlandırmak için 1 dakika inkübe edin.
- 30 dakika boyunca 3000 x g'da 1000 KD ultrafiltrasyon tüpleri ile ultrafiltrasyon ile fazla PKH26'yı çıkarın ve PBS ekleyerek üç kez tekrarlayın. Kalan sıvıyı PBS ile 500 μL'ye yeniden süspanse edin ve 0,22 μm'lik bir filtreden süzün.
- Hücre alım testi
- Hücre aşılaması: %10 FBS × %5 P/S içeren 1 mL DMEM içeren 35 mm'lik konfokal kaplarda 1 ila 106 hücreyi tohumlayın ve gece boyunca 37 °C ve %5CO2'de inkübe edin.
- Potansiyel kontaminasyonu gidermek için EM'leri 0,22 μm steril şırınga filtreleriyle filtreleyin.
- Hücreleri 8 saat boyunca PKH26 etiketli EM'lerle (109 partikül / mL) tedavi edin.
- PBS ile üç kez yıkayın, DAPI (10 ng / mL) ekleyin ve RT'de 10 dakika inkübe edin.
- 405 nm ve 561 nm lazer kanallarını kullanarak konfokal lazer taramalı floresan mikroskobunda floresan görüntüleri elde edin (bkz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Manyetik ayırma destekli yüksek hızlı homojenizasyon ile EM hazırlamanın iş akışı Şekil 1'de gösterilmektedir. Hücreler, endositoz yoluyla endozomlarda spesifik olarak biriken 10 nm polilisin ile modifiye edilmiş IONP'leri içselleştirir (Şekil 3A). Hipotonik tampon ile muamele edildikten ve homojenize edildikten sonra, IONP yüklü endozomlar hücrelerden salınır ve daha sonra manyetik ayırma ile toplanır. İzole edilen endozomlar, yüksek hızlı homojenizasyon ile EM'ler olarak da bilinen monodispers nanoveziküller halinde yeniden oluşturulur. Optimize edilmiş EM hazırlama koşullarını belirlemek için birden fazla anahtar parametreyi (örneğin, homojenizasyon hızı ve süresi) araştırdık (Şekil 2). Son olarak, üretilen EM'lerin partikül boyutu ve verimi dikkate alınarak optimize edilmiş koşul olarak 5 dakika boyunca 140 x g'lık bir homojenizasyon hızı seçilmiştir. Serbest IONP'ler ve IONP yüklü EM'ler, IONP'siz EM'ler elde etmek için ikinci bir manyetik ayırma turu ile nihai ürün çözeltisinden çıkarılır. Yöntem, doğal EV'lerle aynı biyolojik kökeni paylaşan ebeveyn hücre endozomlarından oldukça düzgün ve monodispers nanoveziküller üretir.
Ultrasantrifüjleme ile elde edilen EV'leri bu yöntemle üretilen EM'lerle karşılaştırmak için, EV'ler ve EM'ler için BMSC ve 293T hazırlandı. EM'lerin çapı ve morfolojisi NTA ve TEM ile analiz edildi. BMSC-EM'lerin morfolojisi, tipik bir kase şeklinde vezikül benzeri yapı özelliğine sahiptir ve bir lipit çift tabakası ile sınırlandırılmıştır (Şekil 3A). NTA tarafından analiz edildiği gibi, hem BMSC-EM'ler hem de 293T-EM'ler, yerel EV'lere (BMSC-EV'ler ve 293T-EV'ler) benzer bir hidrodinamik çapa sahiptir (Şekil 3B). BMSC-EM'lerin yüksek hızlı homojenizasyon verimleri 8.16 × 10 8-1.42 × 109/1 × 10 6 hücreleriydi ve ultrasantrifüjleme ile hazırlanan doğal EV'lerin verimi sadece 7.2 × 107-12 × 108/1 × 10 6hücreydi. Benzer şekilde, 293T-EM'lerin yüksek hızlı homojenizasyon verimleri, 108/1 × 10 6 hücrelerden yaklaşık 100 kat daha yüksek olan 108/1 × 10 6 hücrelerden 3.71 × 8-7.58 idi ve bu, geleneksel ultrasantrifüj yöntemiyle hazırlanan doğal 293T-EV'lerden yaklaşık 100 kat daha yüksekti (≈5.5 × 10 6/1 × 10 6hücre) (Şekil 4A).
Ayrıca, batı lekeleme sonuçları, BMSC-EM'lerin EV'lerle (CD63 ve Annexin) aynı protein biyobelirteçlerini içerdiğini göstermiştir. Hem EM'ler hem de EV'ler Calnexin ekspresyonu için negatiftir, bu da bu yöntemle üretilen EM'lerin neredeyse hiç plazma membranı kontaminasyonuna sahip olmadığını düşündürmektedir (Şekil 3C). EM ve EV arasında protein konsantrasyonunda önemli bir fark yoktur, BMSC-EM'ler ve BMSC-EV'ler, BCA protein test kiti aracılığıyla benzer toplam protein konsantrasyonları, 11.15 μg/1 × 10 9 partikülleri ve 14.71 μg/1 × 109 partikülleri sergilemiştir. Ayrıca, 293T-EM'ler ve 293T-EV'ler, sırasıyla yaklaşık 31.8 μg/1 × 10 9 partikül ve 9.95 μg/1 × 109 partikül toplam protein konsantrasyonları sergilemiştir (Şekil 4B). Bu sonuçlar, EM'lerin doğal EV'lerle benzer bir protein bileşimine sahip olduğunu göstermektedir. EM'lerin endositoze edilip edilemeyeceğini tespit etmek için, PKH26 etiketli EM'ler ve EV'ler, 8 saat boyunca 1 × 109 partikül / mL konsantrasyonda BMSC ve ID8 ile birlikte inkübe edildi ve hücreler, EM'lerin EV'lerin yanı sıra hücreler tarafından da kolayca alınabileceğini doğrulamak için konfokal floresan mikroskobu altında gözlemlendi (Şekil 5).
Şekil 1: Manyetik destekli yüksek hızlı homojenizasyon yönteminin şematik diyagramı. Adım 1: Hücreler, IONP'leri endositoz yoluyla endozomlara içselleştirir. Adım 2: Hipotonik tedavi ve homojenizasyondan sonra IONP yüklü endozomlar da dahil olmak üzere organelleri toplayın. Adım 3: IONP yüklü endozomları manyetik ayırma ile saflaştırın. Adım 4: Endozomlar homojenize edilir ve monodispers nanoveziküller halinde yeniden oluşturulur. Adım 5: IONP içermeyen EM'leri toplamak için serbest IONP'leri ve IONP yüklü EM'leri manyetik ayırma yoluyla çıkarın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: EM hazırlama koşullarının optimizasyonu . (A) Süre 5 dakika olarak ayarlandığında homojenizasyon hızı değişikliklerine yanıt olarak BMSC-EM'lerin çapı ve PDI'si DLS ile analiz edildi. (B) Homojenizasyon hızı 140 x g olarak ayarlandığında homojenizasyon süresi değişikliklerine yanıt olarak BMSC-EM'lerin çapı ve PDI'si DLS ile analiz edilmiştir. (C) Farklı depolama zaman noktalarındaki BMSC-EM'lerin çapı ve PDI'si DLS ile analiz edildi. (D) Süre 5 dakikaya ayarlandığında homojenizasyon hızı değişikliklerine yanıt olarak BMSC-EM'lerin çapı ve konsantrasyonu NTA tarafından analiz edildi. (E) Homojenizasyon hızı 140 x g olarak ayarlandığında homojenizasyon süresi değişikliğine yanıt olarak BMSC-EM'lerin çapı ve konsantrasyonu NTA ile analiz edilmiştir. (F) BMSC hücrelerinin farklı konsantrasyonlardaki IONP'lerle birlikte inkübasyonuna yanıt olarak BMSC-EM'lerin çapı ve verimi NTA ile analiz edildi. p < 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: EM'lerin karakterizasyonu. (A) Endositozlu IONP'ler, endozomlar ve EM'ler ile ebeveyn hücrelerinin morfolojisinin TEM karakterizasyonu. Ölçek çubukları 500 nm'yi temsil eder. (B) BMSC-EM, BMSC-EV, 293T-EM ve 293T-EV'nin hidrodinamik çapları NTA ile karakterize edilir. (C) BMSC-EM'lerin, BMSC-EV'lerin ve BMSC hücre lizatlarının Western blot analiz sonuçları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: EM'lerin verimi EV'lerden daha yüksektir. (A) BMSC ve 293T'den hazırlanan EM'lerin ve EV'lerin verimi NTA tarafından analiz edilmiştir. (B) BMSC ve 293T'den hazırlanan EM'lerin ve EV'lerin protein verimi. **p < 0.01. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: BMSC ve ID8 tarafından içselleştirilen PKH26 etiketli EV'lerin ve EM'lerin temsili floresan mikroskop görüntüleri. Ölçek çubukları 10 μm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücresiz terapinin ve nano ölçekli bir ilaç dağıtım sisteminin bir vekili olarak, EV'ler henüz klinik beklentilerini karşılamamıştır ve ana engel, ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir üretim ve saflaştırma yöntemlerinin olmamasıdır6. Bu nedenle, benzer biyolojik karmaşıklığa sahip EV analogları olarak çeşitli EM türleri geliştirilmiştir14. Bugüne kadar, en yaygın kullanılan EM örneği, hücre plazma zarından türetilmiş nanoveziküllerdir. Bu tür nanoveziküllerin hazırlanması, tüm ana hücrelerin doğrudan ekstrüde edilmesiyle nispeten kolay ve basittir17. Bununla birlikte, hücre plazma zarından türetilen nanoveziküller, iki dezavantaj nedeniyle doğal EV'leri özetleyemez: Birincisi, bu nanoveziküllerin biyolojik kökeni, doğal EV'lere kıyasla farklı lipit ve protein bileşimleri içeren hücre plazma zarındandır; İkincisi, EV olmayan organellerden ve hücre kalıntılarından proteinler, nükleik asitler ve lipitler dahil olmak üzere kontaminasyonlar, kaçınılmaz EM heterojenliğine neden olur. Bu yöntemde, hücreleri IONP'lerle inkübe ettik ve manyetik ayırma yoluyla IONP yüklü endozomları topladık, daha sonra yüksek hızlı homojenizasyon yoluyla monodispers nanoveziküller ürettik ve sonunda ikinci bir manyetik ayırma turu ile IONP içermeyen EM'ler elde ettik. Ayrıca, homojenizasyon hızı ve süresi gibi farklı parametrelerin EM boyutu ve verimi üzerindeki etkisini keşfederek EM hazırlama koşullarını optimize ettik. Bu protokol ilginç bir biyolojik fenomenden yararlanır: MNP'ler (örneğin, 10 nm IONP'ler) endositoz yoluyla hemen hemen tüm hücreler tarafından verimli bir şekilde içselleştirilebilir ve diğer organellerde değil, yalnızca endozomlarda biriktirilebilir. Bu benzersiz biyolojik süreç, MNP yüklü endozomların manyetik ayırma yoluyla EV olmayan kontaminasyonlar olmadan izole edilmesini sağladı. Buna karşılık, bu saflaştırılmış hücre endozomları tarafından hazırlanan nanoveziküller, doğal EV'lerin biyolojik karmaşıklığını daha sadık bir şekilde özetleyebilir.
Ayrıca, EV izolasyon yönteminin altın standardı, büyük hücre kültürü ortamına ve 5 saatin üzerinde uzun bir işlem süresine mal olan ve 1 x 10 6 hücreden sadece 1 × 107-1 × 108 partikül üretenultrasantrifüjlemedir 6. Geleneksel tüm ebeveyn hücre ekstrüzyon yöntemleri, nispeten daha yüksek verime sahip olan ancak pahalı ekipman gerektiren ultra yüksek basınçlı membran ekstrüzyonu ve ultrasantrifüjlemeyi içeren çok sayıda adımı içerir17. Bununla birlikte, EM üretim verimi, verimliliği, maliyeti ve insan gücü, protokolümüz kullanılarak önemli ölçüde iyileştirilmiştir. Yüksek hızlı homojenizatör, bu protokolde 5 dakikalık kısa bir işlem süresi için yaygın ve düşük maliyetli bir ekipmandır ve bu yöntem, yerel EV'lere kıyasla 1 ×ila 106 hücreden 100 kata kadar daha fazla EM üretebilir. Bununla birlikte, bu yöntemin yüksek hızlı homojenizasyon sırasında endozomal proteinlerin kaybı gibi bazı sınırlamaları vardır ve hücreler tarafından endositozlanan MNP'lerin lizozomlara aktarılabileceği gösterilmiştir, bu da potansiyel bir kontaminasyon olacaktır18.
Perspektif olarak, EM'ler, yeni ve umut verici bir biyolojik terapötik türü olarak hizmet edebilecek doğal muadilleri olarak önemli biyolojik işlevleri yerine getirmek üzere tasarlanabilir. Biyoaktif maddeler (örneğin, proteinler ve nükleik asitler), spesifik ebeveyn hücreleri (örneğin, kök hücreler19) veya genetik modifikasyon (örneğin, füzyon proteinleri20) seçilerek EM'lere entegre edilebilir. Örneğin, canlı embriyonik kök hücrelerin ekstrüde edilmesiyle hücre kaynaklı nanoveziküller, iyileşme veya yara iyileşme süreci üzerinde olumlu bir etkiye sahiptir19. Genetik modifikasyon, belirli biyolojik işlevlere sahip EM'ler üretmek için alternatif bir yaklaşımdır. Örneğin, hücreler, glikosilfosfatidilinositol (GPI) çapa sinyal peptitlerine kaynaşmış anti-epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) nano gövdelerinin vektörleri ile transfekte edildiğinde, EGFR nano gövdeleri, EGFR eksprese eden tümör hücrelerini hedeflemek için EV'lerin yüzeyine sabitlenebilir20. EM'ler, çok sayıda klinik öncesi çalışmada hücresiz tedavinin ve nano ölçekli bir ilaç dağıtım sisteminin vekili olarak iyi performans göstermiştir14, ancak klinik araştırmalarda EV'lerin ve EM'lerin heterojenliği ve tekrarlanabilirliği ile ilgili endişelerle birlikte EM veya EV tabanlı tedavinin kapsamlı bir mekanik anlayışı yoktur. Birlikte ele alındığında, EM'lerin biyolojik işlevleri ve klinik etkileri daha fazla araştırmayı gerektirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D.W. ve P.G., Çin Bilimler Akademisi Temel Tıp ve Kanser Enstitüsü (IBMC) tarafından yapılan bir patent başvurusunun ortak mucitleridir. Diğer yazar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Yazarlar, Çin Bilimler Akademisi, Temel Tıp ve Kanser Enstitüsü'ndeki (IBMC) Paylaşılan Enstrümantasyon Çekirdek Tesisi'nde aletlerin kullanıldığını kabul ediyor. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NSFC; 82172598), Çin'in Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (LZ22H310001), Çin'in Zhejiang Eyaleti Sağlık Komisyonu'nun 551 Sağlık Yeteneği Eğitim Projesi, Hangzhou Belediye Bilim ve Teknoloji Bürosu Tarımsal ve Sosyal Kalkınma Araştırma Projesi (2022ZDSJ0474) ve Qiantang Disiplinlerarası Araştırma Bursu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin antibody | ABclonal | A11235 | Western blotting |
| BCA assay kit | Beyotime | P0012 | Protein concentration assay |
| Calnexin | GeneTex | HL1598 | Western blotting |
| CD63 antibody | ABclonal | A19023 | Western blotting |
| Cell lysis buffer for Western and IP | Beyotime | P0013 | Western blotting |
| Centrifuge | Beckman | Allegra X-30R | Cell centrifuge |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | NIKON | A1 HD25 | Photo the fluorescence picture |
| DMEM basic (1x) | GIBCO | C11995500BT | Cell culture |
| Dynamic light scattering (DLS) | Malvern | Zetasizer Nano ZS ZEN3600 | Diameter analysis |
| Electric glass homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | DY89-II | Low-speed homogenization |
| Exosome-depleted FBS | system Bioscience | EXO-FBS-50A-1 | Cell culture |
| High-speed homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | XHF-DY | High-speed homogenization |
| Magnetic grate | Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China) | NA | Magnetic separation |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT | The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C |
| Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs) | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag1100-10 | Cell culture |
| Potassium chloride | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Protease inhibitor cocktail | Beyotime | P1030 | Proteinase inhibitor |
| Sodium citrate | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Transmission electron microscopy (TEM) | JEOL | JEM-2100plus | Morphology image |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
| ZetaView nanoparticle tracking analyzers | Particle Metrix | PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
References
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), eaau6977 (2020).
- Hyenne, V., et al. RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion. J Cell Biol. 211 (1), 27-37 (2015).
- Farooqi, A. A., et al. Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds. Biotechnol Adv. 36 (1), 328-334 (2018).
- Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrol Dial Transplant. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Castilletti, C., et al. Coordinate induction of IFN-alpha and -gamma by SARS-CoV also in the absence of virus replication. Virology. 341 (1), 163-169 (2005).
- Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Cancer nanomedicines in an evolving oncology landscape. Trends Pharmacol Sci. 41 (10), 730-742 (2020).
- Jo, W., et al.
- Yoon, J., et al. Generation of nanovesicles with sliced cellular membrane fragments for exogenous material delivery. Biomaterials. 59, 12-20 (2015).
- Li, M., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells ablate neuroblastoma tumor in vitro and in vivo. Biomater Adv. 142, 213161 (2022).
- Wang, J., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells deliver doxorubicin to osteosarcoma in vitro and in vivo. Drug Deliv. 29 (1), 3291-3303 (2022).
- Zhang, Z., et al. Comprehensive proteomic analysis of exosome mimetic vesicles and exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 312 (2022).
- Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. J Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
- Yang, W., et al. Clinical characteristics of 310 SARS-CoV-2 Omicron variant patients and comparison with Delta and Beta variant patients in China. Virol Sin. 37 (5), 12 (2022).
- Shapira, S., et al. A novel platform for attenuating immune hyperactivity using EXO-CD24 in COVID-19 and beyond. EMBO Mol Med. 14 (9), 15997 (2022).
- Jang, S. C., et al. Bioinspired exosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery of chemotherapeutics to malignant tumors. ACS Nano. 7 (9), 7698-7710 (2013).
- Le, T. S., et al. Quick and mild isolation of intact lysosomes using magnetic-plasmonic hybrid nanoparticles. ACS Nano. 16 (1), 885-896 (2022).
- Jeong, D., et al. Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation. Biomaterials. 35 (34), 9302-9310 (2014).
- Kooijmans, S. A., et al. Display of GPI-anchored anti-EGFR nanobodies on extracellular vesicles promotes tumour cell targeting. J Extracell Vesicles. 5, 31053 (2016).
