Summary
Här beskriver vi en magnetisk separationsassisterad höghastighetshomogeniseringsmetod för storskalig produktion av endosom-härledda nanovesiklar som en ny typ av exosomhärmare (EM) som delar samma biologiska ursprung och liknande struktur, morfologi och proteinsammansättning av nativa extracellulära vesiklar (EV).
Abstract
Extracellulära vesiklar (EV) har väckt stor uppmärksamhet inom fysiologisk och patologisk forskning, sjukdomsdiagnos och behandling; Den kliniska översättningen har dock begränsats av bristen på metoder för uppskalning. Därför tillhandahåller detta protokoll en magnetisk separationsassisterad höghastighetshomogeniseringsmetod för storskalig produktion av endosomhärledda nanovesiklar som en ny typ av exosomhärmare (EM) härledda från endosomerna, som har cirka 100 gånger högre utbyte än konventionell ultracentrifugeringsmetod. I denna metod internaliserades magnetiska nanopartiklar (MNP) av föräldracellerna via endocytos och ackumulerades därefter i deras endosomer. Därefter samlades MNP-laddade endosomer in och renades genom hypoton behandling och magnetisk separation. En höghastighetshomogenisator användes för att bryta MNP-laddade endosomer till monodispersa nanovesiklar. De resulterande endosomhärledda vesiklarna har samma biologiska ursprung och struktur, kännetecknade av analys av spårning av nanopartiklar, transmissionselektronmikroskop och western blotting. Deras morfologi och proteinsammansättning liknar nativa EVs, vilket indikerar att EMs potentiellt kan fungera som ett billigt och högavkastande surrogat för nativa EVs för kliniska översättningar.
Introduction
Extracellulära vesiklar (EV) är små vesiklar som utsöndras av nästan alla celler med ett storleksintervall på 30-150 nm, som innehåller rikligt med bioaktiva ämnen. Beroende på ursprungscellen uppvisar EV hög heterogenitet och har flera komponenter som är specifika för föräldraceller1. EV släpps ut i kroppsvätskor och transporteras till avlägsna platser där de tas upp av målceller för åtgärd2, som kan användas för att leverera ett brett spektrum av bioaktiva molekyler och läkemedel för vävnadsreparation, tumördiagnos och behandling och immunmodulering 3,4. Andra biologiska nanopartiklar (t.ex. lipoproteiner) och nanovesiklar (t.ex. EV som härrör från icke-endosomala vägar) med liknande biofysiska egenskaper i kroppsvätskor påverkar dock oundvikligen EV-isolering och rening. Hittills är ultracentrifugering fortfarande guldstandarden för EV-isolering, och andra isoleringsmetoder, inklusive sackarosdensitetsgradientcentrifugering, ultrafiltrering, polyetylenglykolutfällning, kromatografi och immunmagnetisk pärlisolering, har utvecklats5. Den nuvarande flaskhalsen som begränsar klinisk översättning och kommersialisering av EV-terapier är den allvarliga bristen på isoleringstekniker som möjliggör mycket skalbar och reproducerbar isolering av EV 6,7,8. Traditionella EV-isoleringstekniker (t.ex. ultracentrifugering och storleksuteslutningskromatografi) lider av lågt utbyte (1 x 107-1 x 108/1 x 10 6 celler), lång produktionscykel (24-48 timmar), dålig reproducerbarhet av produktkvalitet och kräver dyr och energikrävande produktionsutrustning som inte kan möta den nuvarande kliniska efterfrågan på EV6.
Exosommimics (EM), syntetiska surrogat för inhemska elbilar, har väckt stor uppmärksamhet på grund av deras mycket likartade struktur, funktion och skalbarhet i produktionen. Den huvudsakliga källan till EM är från direkt extrudering av hela föräldraceller med kontinuerlig snittning9,10, vilket visar potenta biologiska funktioner som nativa EV11,12. Till exempel har EM som härrör från mänskliga mesenkymala stamceller från navelsträngen (hUCMSC) liknande sårläkningseffekter som nativa EV och är rikare på proteinsammansättning13. Även om EM som härrör från hela celler har den biologiska komplexiteten hos EV, är deras största nackdel produkternas heterogenitet eftersom de oundvikligen är förorenade av olika cellulära organeller och cellrester. Proteinlokaliseringsanalys avslöjade vidare att EM som härrör från helcellsextrudering innehåller många icke-EVs-specifika proteiner från mitokondrier och det endoplasmatiska nätverket13. Dessutom kräver de flesta metoder för tillverkning av elektrometriska elektrometriker fortfarande ultracentrifugering, en mycket tids- och energikrävande process14. Med tanke på det faktum att exosomer uteslutande härrör från cellulära endosomer, antog vi att biokonstruerade endosom-härledda nanovesiklar bättre kan rekapitulera den biologiska homologin mellan exosomer och EM i jämförelse med de väletablerade cellmembran-härledda EM som produceras med helcellsextruderingsmetod14. Ändå är det svårt att tillverka endosom-härledda nanovesiklar på grund av bristen på genomförbara metoder.
Kliniska studier har genomförts genom att använda EV som ett surrogat för cellfri terapi och ett läkemedelsleveranssystem i nanoskala för behandling av olika sjukdomar. Till exempel har EV som härrör från benmärgens mesenkymala stamceller använts för att behandla allvarlig lunginflammation orsakad av covid-19 och har uppnått lovande resultat. Nyligen har genetiskt modifierade elbilar som bär CD24-proteiner också visat potenta terapeutiska fördelar för behandling av COVID-19-patienter15,16. Det kliniska kravet på EV-behandling kan dock fortfarande inte uppfyllas med traditionella isoleringsmetoder på grund av det låga utbytet och kostnaden. Denna studie rapporterar den storskaliga produktionen av endosom-härledda nanovesiklar via en magnetisk separationsassisterad höghastighetshomogeniseringsmetod. Den drar nytta av MNP:s endocytosväg för att isolera MNP-laddade endosomer via magnetisk separation, följt av höghastighetshomogenisering för att formulera endosomer till monodispersa nanovesiklar. Eftersom de typer av endosomer som samlas in av detta protokoll är olika, krävs ytterligare djupgående forskning fortfarande för att etablera god tillverkningspraxis (GMP) i branschen. Denna nya EM-beredningsmetod är mer tidseffektiv (5 min höghastighetshomogenisering) för att erhålla nanovesiklar som är homologa med nativa EV. Det producerar exponentiellt fler vesiklar från samma mängder celler än ultracentrifugering, som i allmänhet kan tillämpas på olika celltyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: En schematisk bild av metoden visas i figur 1.
1. EM-förberedelse och isolering
- Cellinternalisering av MNP
- Cellodling
- Suspend 1 × 106 mesenkymala stamceller från råttbenmärg (BMSC), 293T-celler eller ovariell epitelcancer hos mus (ID8) i DMEM komplett medium med 10 % fetalt bovint serum (FBS) och 5 % penicillin-streptomycinlösning (P/S) i 2 ml per sexhålsplatta (se materialförteckning).
- Odla cellerna över natten vid 37 °C och 5 % CO2 .
OBS: Antalet celler efter följsamhet var ca 1 × 106.
- Endocytos av MNP
- Minska medelvolymen för varje sexhålsplatta till 1 ml. Samodla cellerna med 10 nm polylysinmodifierade järnoxidnanopartiklar (IONP) (se materialtabell) i en koncentration av 100 μg/1 ×10 6 celler och inkubera vid 37 °C i en atmosfär som innehåller 5 % CO2 i 12 timmar så att cellerna kan endocytosera IONP fullt ut.
- Cellodling
- Isolering och homogenisering av endosomer
- Cellhypoton behandling
- Smält cellerna som har helt internaliserade IONPs med 0,5 ml/brunntrypsin i 3 minuter och avsluta matsmältningen genom att tillsätta 1 ml/brunn komplett medium.
- Centrifugera vid 1000 x g i 5 minuter och kassera supernatanten. Återsuspendera cellerna i fosfatbuffertsaltlösning (PBS) och centrifugera, upprepade gånger två gånger för att tvätta bort restmediet och oabsorberade jonp.
- Blanda slutligen pelleten i 8 ml i förberedd hypoton lösning (71,4 mM kaliumklorid, 1,3 mM natriumcitrat, pH 7,2-7,4) i 15 minuter (se materialförteckning).
- Frisättning av organeller genom homogenisering med låg hastighet
- Överför cellsuspensionen i hypoton lösning till ett provrör av glas och lossa organellerna med hjälp av en glashomogenisator (se materialtabell) med 20 stötar vid 1000 rpm.
- Magnetisk separation för att erhålla endosomer
- Överför 1 ml av den homogeniserade celllösningen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och placera i en magnetisk separator i 1 timme för att helt separera IONP-laddade endosomer från andra organeller (såsom kärna och mitokondrier) och cellrester.
- Samla upp de bruna pelletsen på kontaktytan på mikrocentrifugrören bredvid magnetramen (se materialtabell), dvs de IONP-laddade endosomerna. Kassera vätskan i mikrocentrifugrören och tillsätt 3 ml PBS för att återsuspendera endosomerna.
- Cellhypoton behandling
- Homogenisering med hög hastighet
- Överför lösningen som innehåller endosomerna till ett 15 ml centrifugrör med en vätskevolym mellan 3-10 ml.
- Förläng 10 mm sonden på höghastighetshomogenisatorn (se materialtabell) till botten av centrifugröret utan att vidröra botten. Justera hastighetsknappen under skärmen, ställ in hastigheten till 140 x g och justera tidsknappen för att ställa in tiden på 5 minuter och tryck sedan på OK-knappen .
- Tryck på Start-knappen för att utföra homogeniseringen efter att ha placerat en islåda under provet.
- Magnetisk sortering för EM
- Överför lösningen som innehåller nanovesiklar erhållen från höghastighetshomogenisering till 1,5 ml mikrocentrifugröret och lägg den i en magnetisk separator i 1 timme.
- Samla upp vätskan som innehåller de nödvändiga EM. Var försiktig så att du inte vidrör ytan på rören bredvid den magnetiska ramen, som adsorberar fria IONP:er och IONP-laddade EM:er.
2. EM-karakterisering (figur 2 och figur 3)
- Dynamisk ljusspridningsanalys (DLS)
- Injicera 1 ml EMs sample (20 μg/mL) längs väggen i kyvetten och placera den i instrumentet sample öppningen på DLS-instrumentet (se materialförteckning).
- Öppna DLS-programvaran, välj Partikelstorlekstest och börja testa.
- Mät proteinkoncentrationen med hjälp av ett BCA-proteinanalyskit (se materialtabell).
- Analys av spårning av nanopartiklar (NTA)
- Späd elektrolyker med PBS till en lösning vid 1 × 107-1 × 108 partiklar/ml och injicera dem i NTA-instrumentets kammare (se materialtabell) med en 1 ml spruta med en flödeshastighet på 500-1000 μL/min.
- Öppna de 488 laserkanalerna och se till att antalet EM i mjukvarugränssnittet ligger inom 100-300 och i Brownsk rörelse.
- Enligt tillverkarens protokoll, välj lämplig SOP (EV-488) för att säkerställa att instrumentets känslighet är lämplig för EM-detektion.
- Transmissionselektronmikroskopi (TEM)
- Fixera EM (1 mg/ml) med en lika stor volym av 5 % glutaraldehyd i 30 minuter och kvantifiera koncentrationen av EM till 1 mg/ml med BCA-proteinanalyssats.
- Placera en droppe EM på 10 μL på kolsidan av kopparnätet och ta bort överflödig vätska från sidan med filterpapper efter 10 minuter. Tillsätt 10 μl PBS och torka omedelbart med filtrerpapper. Upprepa två gånger för att ta bort överflödig glutaraldehyd.
- Droppa 5 μL uranylacetatkontrastmedel och fläcka negativt i 1 minut, ta sedan bort överskottet av kontrastmedel. Tvätta tre gånger med avjoniserat vatten och torka i rumstemperatur (RT).
- Spela in bilden med ett TEM vid en accelerationsspänning på 100 kV.
- Västra blotting
- Tillsätt 100 μl celllysbuffert och 5 μl av en cocktail av 50-faldiga proteashämmare till proverna (se materialförteckning). Blanda försiktigt med en pipettpistol och lägg på is i 30 min.
- Centrifugera lösningen vid 1000 x g i 10 minuter vid 4 °C, kvantifiera proteinkoncentrationen i supernatanten med en BCA-proteinanalyssats och samla upp den.
- Blanda supernatanten på 100 μl med 25 μl 5x proteinbuffert och värm vid 95 °C i 10 minuter.
- Förbered gelerna enligt instruktionerna för de förformade gelerna. Ladda 15 μg protein per brunn och kör med gelelektrofores vid 80 V. Vänta tills provet rinner till separationsgelen, byt till 100 V och överför sedan proteinet till ett nitrocellulosamembran vid 100 V, 60 minuter under isbad.
- Detektera de icke-EV-specifika markörerna (Calnexin) och EV-biomarkörerna (Annexin och CD63) genom western blotting (se materialtabell).
OBS: Antikropparna späds enligt tillverkarens rekommendationer.
3. Detektering av EM-funktion in vitro
- EMs märkning
- Blanda 1 μl PKH26 med 250 μL spädningsmedel C (1:250) för att göra 2x färgningslösning (4 × 10-6 M) (se materialtabell).
- Blanda 250 μL EM (1 mg/ml) med 250 μL 2x färgningslösning och blås snabbt med en pipetteringspistol.
- Inkubera vid RT i 2-5 minuter medan du försiktigt vänder centrifugröret.
- Tillsätt en lika stor volym serum eller 1 % bovint serumprotein och inkubera i 1 minut för att avsluta matsmältningen.
- Ta bort överskott av PKH26 genom ultrafiltrering med 1000 KD ultrafiltreringsrör vid 3000 x g i 30 minuter och upprepa tre gånger genom att tillsätta PBS. Återsuspendera den återstående vätskan till 500 μl med PBS och filtrera genom ett 0,22 μm filter.
- Analys av cellupptag
- Cellinokulering: Frö 1 × 106 celler i 35 mm konfokala skålar med 1 ml DMEM innehållande 10 % FBS och 5 % P/S, och inkubera vid 37 °C och 5 % CO2 över natten.
- Filtrera EM med 0,22 μm sterila sprutfilter för att avlägsna potentiell kontaminering.
- Behandla cellerna med PKH26-märkta EM (109 partiklar/ml) i 8 timmar.
- Tvätta tre gånger med PBS, tillsätt DAPI (10 ng/ml) och inkubera i 10 minuter vid RT.
- Ta fluorescensbilderna i konfokal laserskanningsfluorescensmikroskopi med hjälp av 405 nm och 561 nm laserkanaler (se materialtabell).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbetsflödet för EM-beredning genom magnetisk separationsassisterad höghastighetshomogenisering visas i figur 1. Celler internaliserar 10 nm polylysinmodifierade joner, som specifikt ackumuleras i endosomer via endocytos (figur 3A). Efter att ha behandlats med hypoton buffert och homogeniserats, frigörs de IONP-laddade endosomerna från cellerna och samlas därefter upp genom magnetisk separation. De isolerade endosomerna rekonstitueras vidare till monodispersa nanovesiklar, även kända som EM, genom höghastighetshomogenisering. Vi undersökte flera nyckelparametrar (t.ex. homogeniseringshastighet och -tid) för att identifiera optimerade EM-preparationsförhållanden (figur 2). Slutligen valdes en homogeniseringshastighet på 140 x g under 5 minuter som det optimerade betingelsen genom att ta hänsyn till partikelstorleken och utbytet av producerade EM. Fria IONP:er och IONP-laddade EM:er avlägsnas så småningom från den slutliga produktlösningen genom en andra omgång av magnetisk separation för att erhålla IONP-fria EM:er. Metoden producerar mycket enhetliga och monodispergerade nanovesiklar från föräldracellens endosomer, som delar samma biologiska ursprung som nativa EV.
För att jämföra EV erhållna genom ultracentrifugering med EM genererade med denna metod, förbereddes BMSC och 293T för EV och EM. Diametern och morfologin hos EM analyserades med NTA och TEM. BMSC-EM:s morfologi kännetecknas av en typisk skålformad vesikelliknande struktur och avgränsas av ett lipiddubbelskikt (figur 3A). Enligt NTA:s analys har både BMSC-EM och 293T-EM en liknande hydrodynamisk diameter som inhemska EV (BMSC-EV och 293T-EV) (figur 3B). BMSC-EMs utbyte av höghastighetshomogenisering var 8,16 × 10 8-1,42 × 109/1 × 10 6 celler, och utbytet av inhemska EV framställda genom ultracentrifugering var endast 7,2 × 10 7-1,12 × 108/1 × 106celler. På samma sätt var 293T-EMs utbyten av höghastighetshomogenisering 3,71 × 10 8-7,58 × 108/1 × 10 6 celler, vilket når upp till cirka 100 gånger högre än de för inhemska 293T-EV framställda med den konventionella ultracentrifugmetoden (≈5,5 × 10 6/1 × 10 6celler) (Figur 4A).
Dessutom visade western blotting-resultaten att BMSC-EM innehåller samma proteinbiomarkörer som EV (CD63 och Annexin). Både EM och EV är negativa för kalnexinuttryck, vilket tyder på att EM som produceras med denna metod nästan inte hade någon plasmamembrankontaminering (Figur 3C). Det finns ingen signifikant skillnad i proteinkoncentration mellan EM och EV, BMSC-EM och BMSC-EV uppvisade liknande totala proteinkoncentrationer, 11,15 μg/1 × 10 9 partiklar och 14,71 μg/1 × 109 partiklar via BCA-proteinanalyssatsen. Dessutom uppvisade 293T-EM och 293T-EV totala proteinkoncentrationer på cirka 31,8 μg/1 × 10 9 partiklar respektive 9,95 μg/1 × 109 partiklar (figur 4B). Dessa resultat indikerar att EM har en liknande proteinsammansättning som nativa EV. För att detektera om EM kan endocytoseras, inkuberades PKH26-märkta EM och EV tillsammans med BMSC och ID8 vid en koncentration av 1 × 109 partiklar/ml under 8 timmar, och cellerna observerades under konfokalfluorescensmikroskopi för att bekräfta att EM lätt kunde tas upp av cellerna för verkan såväl som EV (Figur 5).
Figur 1: Schematisk bild av den magnetiskt assisterade höghastighetshomogeniseringsmetoden. Steg 1: Celler internaliserar IONP till endosomer genom endocytos. Steg 2: Samla organeller, inklusive IONP-laddade endosomer, efter hypoton behandling och homogenisering. Steg 3: Rena IONP-laddade endosomer genom magnetisk separering. Steg 4: Endosomerna homogeniseras och rekonstitueras till monodispersa nanovesiklar. Steg 5: Ta bort fria IONP:er och IONP-laddade EM:er genom magnetisk separation för att samla upp IONP-fria EM:er. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Optimering av EM-preparationsförhållanden . (A) Diametern och PDI för BMSC-EM som svar på homogeniseringshastighetsförändringar när tiden är inställd på 5 minuter analyserades med DLS. (B) Diametern och PDI för BMSC-EM som svar på homogeniseringstidsförändringar när homogeniseringshastigheten är inställd på 140 x g analyserades med DLS. (C) Diametern och PDI för BMSC-EM vid olika lagringstidpunkter analyserades med DLS. (D) Diametern och koncentrationen av BMSC-EM som svar på homogeniseringshastighetsförändringar när tiden är inställd på 5 minuter analyserades av NTA. (E) Diametern och koncentrationen av BMSC-EM som svar på homogeniseringstidsförändringen när homogeniseringshastigheten är inställd på 140 x g analyserades med NTA. (F) Diametern och utbytet av BMSC-EM som svar på BMSC-cellers saminkubation med IONP med olika koncentrationer analyserades av NTA. p < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Karakterisering av EM. (A) TEM-karakterisering av morfologin hos föräldraceller med endocytoserade IONPs, endosomer och EMs. Skalstrecken representerar 500 nm. (B) Hydrodynamiska diametrar för BMSC-EM, BMSC-EV, 293T-EM och 293T-EV karakteriseras av NTA. (C) Western blot-analysresultat av BMSC-EMs, BMSC-EVs och BMSC-celllysat. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Utbytet av EM är högre än EV. (A) Utbytet av EM och EV framställt från BMSC och 293T analyserades av NTA. (B) Proteinutbyte för EM och EV framställda från BMSC och 293T. **p < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Representativa fluorescerande mikroskopbilder av PKH26-märkta EV och EM internaliserade av BMSC och ID8. Skalstaplarna representerar 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som ett surrogat för cellfri terapi och ett system för läkemedelstillförsel i nanoskala har elbilar ännu inte uppfyllt sina kliniska förväntningar, och ett huvudhinder är bristen på skalbara och reproducerbara produktions- och reningsmetoder6. Därför har olika typer av EM utvecklats som EV-analoger med liknande biologisk komplexitet14. Hittills är det mest använda exemplet på EM nanovesiklar från cellplasmamembran. Framställningen av sådana nanovesiklar är relativt enkel och okomplicerad genom att direkt extrudera hela moderceller17. Nanovesiklar som härrör från cellplasmamembran kan dock inte rekapitulera nativa EV på grund av två nackdelar: För det första är det biologiska ursprunget till dessa nanovesiklar från cellplasmamembran, som innehåller olika lipid- och proteinsammansättningar jämfört med nativa EV; För det andra, föroreningarna, inklusive proteiner, nukleinsyror och lipider från icke-EV-organeller och cellrester, vilket orsakar oundviklig EM-heterogenitet. I denna metod inkuberade vi celler med IONP och samlade in IONP-laddade endosomer genom magnetisk separation, genererade sedan monodispersa nanovesiklar via höghastighetshomogenisering, vilket så småningom erhöll IONP-fria EM genom en andra omgång av magnetisk separation. Dessutom optimerade vi EM-preparationsförhållandena genom att utforska effekten av olika parametrar, såsom homogeniseringshastighet och -tid, på EM-storlek och utbyte. Detta protokoll drar fördel av ett intressant biologiskt fenomen: MNP (t.ex. 10 nm IONP) kan effektivt internaliseras av nästan alla celler via endocytos och uteslutande ackumuleras i endosomer, inte andra organeller. Denna unika biologiska process möjliggjorde isolering av MNP-laddade endosomer utan icke-EV-kontaminering via magnetisk separation. I gengäld kan nanovesiklar som preparerats av dessa renade cellendosomer mer exakt rekapitulera den biologiska komplexiteten hos naturliga EV.
Dessutom är den gyllene standarden för EV-isoleringsmetoden ultracentrifugering, som kostar massiva cellodlingsmedier och en lång bearbetningstid på över 5 timmar och endast producerar 1 × 107-1 × 108 partiklar från 1 x 10 6 celler6. Traditionella extruderingsmetoder för hela föräldracellerna inkluderar flera steg som involverar ultrahögtrycksextrudering av membran och ultracentrifugering, som har ett relativt högre utbyte men kräver dyr utrustning17. EM-produktionens avkastning, effektivitet, kostnad och arbetskraft förbättras dock avsevärt genom att använda vårt protokoll. Höghastighetshomogenisatorn är en vanlig och billig utrustning för en kort bearbetningstid på 5 minuter i detta protokoll, och denna metod kan producera upp till 100 gånger fler EM från 1 × 106 celler jämfört med nativa EV. Denna metod har dock vissa begränsningar, såsom förlust av endosomala proteiner under höghastighetshomogenisering, och det har visats att MNP:er som endocytoseras av celler kan överföras till lysosomer, vilket skulle vara en potentiell kontaminering18.
I perspektiv kan EM konstrueras för att utöva viktiga biologiska funktioner som sina naturliga motsvarigheter, vilket kan fungera som en ny och lovande typ av biologiska terapier. Bioaktiva ämnen (t.ex. proteiner och nukleinsyror) kan integreras i EM genom att välja specifika föräldraceller (t.ex. stamceller19) eller genetisk modifiering (t.ex. fusionsproteiner20). Till exempel har cellbaserade nanovesiklar genom extrudering av levande embryonala stamceller en positiv effekt på återhämtnings- eller sårläkningsprocessen19. Genetisk modifiering är ett alternativt tillvägagångssätt för att generera EM med specifika biologiska funktioner. Till exempel, när celler transfekterades med vektorer av anti-epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR) nanokroppar sammansmälta med glykosylfosfatidylinositol (GPI) ankarsignalpeptider, kan EGFR-nanokropparna förankras på ytan av EV för att rikta in sig på EGFR-uttryckande tumörceller20. EM har fungerat bra som ett surrogat för cellfri terapi och ett läkemedelsleveranssystem i nanoskala i flera prekliniska studier14, men det saknas en omfattande mekanistisk förståelse av EM eller EV-baserad terapi med oro över heterogeniteten och reproducerbarheten av EV och EM i kliniska undersökningar. Sammantaget motiverar de biologiska funktionerna hos EM och deras kliniska implikationer ytterligare undersökningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D.W. och P.G. är meduppfinnare till en patentansökan som lämnats in av Institute of Basic Medicine and Cancer (IBMC), Chinese Academy of Sciences. Den andra författaren förklarar att han inte är jävig.
Acknowledgments
Författarna erkänner användningen av instrument vid Shared Instrumentation Core Facility vid Institute of Basic Medicine and Cancer (IBMC), Chinese Academy of Sciences. Denna studie stöddes av National Natural Science Foundation of China (NSFC; 82172598), Natural Science Foundation of Zhejiang-provinsen, Kina (LZ22H310001), 551 Health Talent Training Project of Health Commission of Zhejiang-provinsen, Kina, Agricultural and Social Development Research Project of Hangzhou Municipal Science and Technology Bureau (2022ZDSJ0474) och Qiantang Interdisciplinary Research Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin antibody | ABclonal | A11235 | Western blotting |
| BCA assay kit | Beyotime | P0012 | Protein concentration assay |
| Calnexin | GeneTex | HL1598 | Western blotting |
| CD63 antibody | ABclonal | A19023 | Western blotting |
| Cell lysis buffer for Western and IP | Beyotime | P0013 | Western blotting |
| Centrifuge | Beckman | Allegra X-30R | Cell centrifuge |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | NIKON | A1 HD25 | Photo the fluorescence picture |
| DMEM basic (1x) | GIBCO | C11995500BT | Cell culture |
| Dynamic light scattering (DLS) | Malvern | Zetasizer Nano ZS ZEN3600 | Diameter analysis |
| Electric glass homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | DY89-II | Low-speed homogenization |
| Exosome-depleted FBS | system Bioscience | EXO-FBS-50A-1 | Cell culture |
| High-speed homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | XHF-DY | High-speed homogenization |
| Magnetic grate | Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China) | NA | Magnetic separation |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT | The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C |
| Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs) | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag1100-10 | Cell culture |
| Potassium chloride | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Protease inhibitor cocktail | Beyotime | P1030 | Proteinase inhibitor |
| Sodium citrate | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Transmission electron microscopy (TEM) | JEOL | JEM-2100plus | Morphology image |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
| ZetaView nanoparticle tracking analyzers | Particle Metrix | PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
References
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), eaau6977 (2020).
- Hyenne, V., et al. RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion. J Cell Biol. 211 (1), 27-37 (2015).
- Farooqi, A. A., et al. Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds. Biotechnol Adv. 36 (1), 328-334 (2018).
- Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrol Dial Transplant. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Castilletti, C., et al. Coordinate induction of IFN-alpha and -gamma by SARS-CoV also in the absence of virus replication. Virology. 341 (1), 163-169 (2005).
- Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Cancer nanomedicines in an evolving oncology landscape. Trends Pharmacol Sci. 41 (10), 730-742 (2020).
- Jo, W., et al.
- Yoon, J., et al. Generation of nanovesicles with sliced cellular membrane fragments for exogenous material delivery. Biomaterials. 59, 12-20 (2015).
- Li, M., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells ablate neuroblastoma tumor in vitro and in vivo. Biomater Adv. 142, 213161 (2022).
- Wang, J., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells deliver doxorubicin to osteosarcoma in vitro and in vivo. Drug Deliv. 29 (1), 3291-3303 (2022).
- Zhang, Z., et al. Comprehensive proteomic analysis of exosome mimetic vesicles and exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 312 (2022).
- Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. J Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
- Yang, W., et al. Clinical characteristics of 310 SARS-CoV-2 Omicron variant patients and comparison with Delta and Beta variant patients in China. Virol Sin. 37 (5), 12 (2022).
- Shapira, S., et al. A novel platform for attenuating immune hyperactivity using EXO-CD24 in COVID-19 and beyond. EMBO Mol Med. 14 (9), 15997 (2022).
- Jang, S. C., et al. Bioinspired exosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery of chemotherapeutics to malignant tumors. ACS Nano. 7 (9), 7698-7710 (2013).
- Le, T. S., et al. Quick and mild isolation of intact lysosomes using magnetic-plasmonic hybrid nanoparticles. ACS Nano. 16 (1), 885-896 (2022).
- Jeong, D., et al. Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation. Biomaterials. 35 (34), 9302-9310 (2014).
- Kooijmans, S. A., et al. Display of GPI-anchored anti-EGFR nanobodies on extracellular vesicles promotes tumour cell targeting. J Extracell Vesicles. 5, 31053 (2016).
