Summary
In dieser Arbeit beschreiben wir eine magnetische Separations-gestützte Hochgeschwindigkeits-Homogenisierungsmethode für die großtechnische Produktion von Endosomen-abgeleiteten Nanovesikeln als eine neue Art von Exosomen-Mimikern (EMs), die den gleichen biologischen Ursprung und die gleiche Struktur, Morphologie und Proteinzusammensetzung von nativen extrazellulären Vesikeln (EVs) aufweisen.
Abstract
Extrazelluläre Vesikel (EVs) haben in der physiologischen und pathologischen Forschung, Krankheitsdiagnose und -behandlung große Aufmerksamkeit erregt. Ihre klinische Umsetzung wurde jedoch durch das Fehlen von Scale-up-Fertigungsansätzen eingeschränkt. Daher bietet dieses Protokoll eine magnetische Separations-unterstützte Hochgeschwindigkeits-Homogenisierungsmethode für die großtechnische Herstellung von Endosomen-abgeleiteten Nanovesikeln als eine neue Art von Exosomen-Mimiks (EMs), die von den Endosomen abgeleitet sind und eine etwa 100-mal höhere Ausbeute als die herkömmliche Ultrazentrifugationsmethode aufweisen. Bei dieser Methode wurden magnetische Nanopartikel (MNPs) von den Elternzellen mittels Endozytose internalisiert und anschließend in ihren Endosomen akkumuliert. Anschließend wurden MNPs-beladene Endosomen gesammelt und durch hypotone Behandlung und magnetische Trennung gereinigt. Ein Hochgeschwindigkeits-Homogenisator wurde verwendet, um MNP-beladene Endosomen in monodisperse Nanovesikel zu zerlegen. Die resultierenden Endosomen-abgeleiteten Vesikel weisen den gleichen biologischen Ursprung und die gleiche Struktur auf, die durch Nanopartikel-Tracking-Analyse, Transmissionselektronenmikroskop und Western Blot gekennzeichnet sind. Ihre Morphologie und Proteinzusammensetzung ähneln nativen EVs, was darauf hindeutet, dass EMs möglicherweise als kostengünstiger und ertragreicher Ersatz für native EVs für klinische Translationen dienen können.
Introduction
Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind kleine Vesikel, die von fast allen Zellen mit einem Größenbereich von 30-150 nm abgesondert werden und reichlich bioaktive Substanzen enthalten. Abhängig von der Ursprungszelle weisen EVs eine hohe Heterogenität auf und besitzen mehrere Komponenten, die spezifisch für Elternzellensind 1. EVs werden in Körperflüssigkeiten freigesetzt und an entfernte Orte transportiert, wo sie von Zielzellen für Aktion2 aufgenommen werden, die zur Verabreichung einer breiten Palette von bioaktiven Molekülen und Medikamenten für die Gewebereparatur, die Tumordiagnose und -behandlung sowie die Immunmodulation verwendet werdenkönnen 3,4. Andere biologische Nanopartikel (z. B. Lipoproteine) und Nanovesikel (z. B. EVs, die aus nicht-endosomalen Signalwegen stammen) mit ähnlichen biophysikalischen Eigenschaften in Körperflüssigkeiten beeinflussen jedoch unweigerlich die Isolierung und Reinigung von EV. Bis heute ist die Ultrazentrifugation der Goldstandard für die Isolierung von Elektrofahrzeugen, und es wurden andere Isolationsmethoden entwickelt, darunter Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation, Ultrafiltration, Polyethylenglykolfällung, Chromatographie und immunmagnetische Bead-Isolierung5. Der derzeitige Engpass, der die klinische Translation und Kommerzialisierung von EV-Therapeutika einschränkt, ist der gravierende Mangel an Isolationstechniken, die eine hochgradig skalierbare und reproduzierbare Isolierung von EVs ermöglichen 6,7,8. Herkömmliche EV-Isolationstechniken (z. B. Ultrazentrifugation und Größenausschlusschromatographie) leiden unter einer geringen Ausbeute (1 x 107-1 x 108/1 x 106 Zellen), einem langen Produktionszyklus (24-48 h), einer schlechten Reproduzierbarkeit der Produktqualität und erfordern teure und energieintensive Produktionsanlagen, die die derzeitige klinische Nachfrage nach Elektrofahrzeugen nicht deckenkönnen 6.
Exosomen-Mimics (EMs), synthetische Surrogate nativer Elektrofahrzeuge, haben aufgrund ihrer sehr ähnlichen Struktur, Funktion und Skalierbarkeit in der Produktion große Aufmerksamkeit erregt. Die Hauptquelle für EMs ist die direkte Extrusion ganzer Elternzellen mit kontinuierlicher Sektion9,10, was starke biologische Funktionen als native EVs zeigt11,12. Zum Beispiel üben EMs, die aus mesenchymalen Stammzellen der menschlichen Nabelschnur (hUCMSCs) gewonnen werden, ähnliche Wundheilungseffekte aus wie native EVs und sind reicher in der Proteinzusammensetzung13. Obwohl EMs, die aus ganzen Zellen gewonnen werden, die biologische Komplexität von EVs aufweisen, ist ihr Hauptnachteil die Heterogenität der Produkte, da sie unweigerlich durch verschiedene Zellorganellen und Zelltrümmer kontaminiert werden. Die Analyse der Proteinlokalisierung ergab außerdem, dass EMs, die aus der Ganzzellextrusion stammen, viele nicht-EVs-spezifische Proteine aus Mitochondrien und dem endoplasmatischen Retikulum enthalten13. Darüber hinaus erfordern die meisten Verfahren zur Herstellung von EMs immer noch eine Ultrazentrifugation, ein sehr zeit- und energieaufwändiger Prozess14. In Anbetracht der Tatsache, dass Exosomen ausschließlich von zellulären Endosomen abgeleitet werden, stellten wir die Hypothese auf, dass biotechnologisch hergestellte Endosomen-abgeleitete Nanovesikel die biologische Homologie zwischen Exosomen und EMs besser rekapitulieren können als die etablierten EMs aus der Zellmembran, die durch die Ganzzellextrusionsmethode hergestellt werden14. Dennoch ist die Herstellung von Endosomen-abgeleiteten Nanovesikeln aufgrund des Mangels an praktikablen Ansätzen schwierig.
Klinische Studien wurden durchgeführt, indem EVs als Surrogat für eine zellfreie Therapie und als nanoskaliges Arzneimittelverabreichungssystem für die Behandlung verschiedener Krankheiten verwendet wurden. So wurden beispielsweise aus mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks gewonnene EVs zur Behandlung schwerer Lungenentzündungen eingesetzt, die durch COVID-19 verursacht wurden, und haben vielversprechende Ergebnisse erzielt. In jüngster Zeit haben gentechnisch veränderte Elektrofahrzeuge, die CD24-Proteine tragen, auch einen starken therapeutischen Nutzen bei der Behandlung von COVID-19-Patienten gezeigt15,16. Der klinische Bedarf der EV-Therapie kann jedoch aufgrund der geringen Ausbeute und Kosten immer noch nicht mit herkömmlichen Isolationsmethoden erfüllt werden. Diese Studie berichtet über die großtechnische Produktion von Endosomen-abgeleiteten Nanovesikeln über einen magnetabscheidungsunterstützten Hochgeschwindigkeits-Homogenisierungsansatz. Es nutzt den Endozytoseweg von MNPs, um MNP-beladene Endosomen durch magnetische Trennung zu isolieren, gefolgt von einer Hochgeschwindigkeitshomogenisierung, um Endosomen zu monodispersen Nanovesikeln zu formulieren. Da die Arten von Endosomen, die von diesem Protokoll gesammelt werden, vielfältig sind, ist noch weitere eingehende Forschung erforderlich, um gute Herstellungspraktiken (GMP) in der Industrie zu etablieren. Dieser neuartige EM-Präparationsansatz ist zeiteffizienter (5 Minuten Hochgeschwindigkeitshomogenisierung), um Nanovesikel zu erhalten, die homolog zu nativen EVs sind. Es produziert exponentiell mehr Vesikel aus der gleichen Anzahl von Zellen als die Ultrazentrifugation, die im Allgemeinen auf verschiedene Zelltypen angewendet werden kann.
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Protocol
HINWEIS: Ein Schema des Verfahrens ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. EM-Vorbereitung und Isolierung
- Zellinternalisierung von MNPs
- Zellkultur
- 1 ×10 6 mesenchymale Stammzellen (BMSC), 293T-Zellen oder Eierstockkrebszellen der Maus (ID8) in DMEM-Komplettmedium mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 5 % Penicillin-Streptomycin-Lösung (P/S) in 2 ml pro Sechs-Well-Platte suspendieren (siehe Materialtabelle).
- Die Zellen werden über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert.
HINWEIS: Die Anzahl der Zellen nach der Adhärenz betrug etwa 1 × 106.
- Endozytose von MNPs
- Reduzieren Sie das mittlere Volumen jeder Sechs-Well-Platte auf 1 ml. Die Zellen werden mit 10 nm Polylysin-modifizierten Eisenoxid-Nanopartikeln (IONPs) (siehe Materialtabelle) in einer Konzentration von 100 μg/1 × 106 Zellen co-kultiviert und bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5 % CO2 für 12 h inkubiert, damit die Zellen IONPs vollständig endozytieren können.
- Zellkultur
- Isolierung und Homogenisierung von Endosomen
- Zellhypotone Behandlung
- Verdauen Sie die Zellen, die IONPs vollständig internalisiert haben, mit 0,5 ml/Well-Trypsin für 3 Minuten und beenden Sie den Aufschluss durch Zugabe von 1 ml/Well-Komplettmedium.
- Bei 1000 x g 5 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Resuspendieren Sie die Zellen in Phosphatpuffersalzlösung (PBS) und zentrifugieren Sie sie wiederholt zweimal, um das Restmedium und die nicht absorbierten IONPs auszuwaschen.
- Zum Schluss wird das Pellet in 8 ml in vorgefertigter hypotoner Lösung (71,4 mM Kaliumchlorid, 1,3 mM Natriumcitrat, pH 7,2-7,4) für 15 Minuten resuspendiert (siehe Materialtabelle).
- Freisetzung von Organellen durch Homogenisierung mit niedriger Geschwindigkeit
- Die Zellsuspension in hypotoner Lösung wird in ein Glasreagenzglas überführt und die Organellen mit einem Glashomogenisator (siehe Materialtabelle) durch 20 Stöße bei 1000 U/min freigesetzt.
- Magnetische Trennung zur Gewinnung von Endosomen
- 1 ml der homogenisierten Zelllösung in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen und 1 Stunde lang in einen Magnetabscheider geben, um IONP-beladene Endosomen vollständig von anderen Organellen (wie Zellkern und Mitochondrien) und Zelltrümmern zu trennen.
- Sammeln Sie die braunen Pellets auf der Kontaktfläche der Mikrozentrifugenröhrchen neben dem Magnetrahmen (siehe Materialtabelle), d. h. die IONP-beladenen Endosomen. Entsorgen Sie die Flüssigkeit in den Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 3 ml PBS hinzu, um die Endosomen zu resuspendieren.
- Zellhypotone Behandlung
- Hochgeschwindigkeits-Homogenisierung
- Die Lösung, die die Endosomen enthält, wird in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit einem Flüssigkeitsvolumen zwischen 3-10 ml überführt.
- Verlängern Sie die 10-mm-Sonde des Hochgeschwindigkeits-Homogenisators (siehe Materialtabelle) bis zum Boden des Zentrifugenröhrchens, ohne den Boden zu berühren. Stellen Sie die Taste "Geschwindigkeit" unter dem Bildschirm ein, stellen Sie die Geschwindigkeit auf 140 x g ein, stellen Sie die Taste "Zeit" ein, um die Zeit von 5 Minuten einzustellen, und drücken Sie dann die Taste "OK".
- Drücken Sie die Start-Taste , um die Homogenisierung durchzuführen, nachdem Sie eine Eisbox unter die Probe gelegt haben.
- Magnetische Sortierung für EMs
- Die aus der Hochgeschwindigkeitshomogenisierung gewonnene Lösung mit Nanovesikeln wird in das 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und 1 h lang in einen Magnetabscheider gegeben.
- Sammeln Sie die Flüssigkeit, die die erforderlichen EMs enthält. Achten Sie darauf, die Oberfläche der Röhrchen neben dem Magnetrahmen nicht zu berühren, die freie IONPs und IONP-geladene EMs adsorbieren.
2. EM-Charakterisierung (Abbildung 2 und Abbildung 3)
- Analyse der dynamischen Lichtstreuung (DLS)
- Injizieren Sie 1 ml EMs-Probe (20 μg/ml) entlang der Wand in die Küvette und legen Sie sie in den Probenschlitz des DLS-Instruments (siehe Materialtabelle).
- Öffnen Sie die DLS-Software, wählen Sie Partikelgrößentest und starten Sie den Test.
- Messen Sie die Proteinkonzentration mit einem BCA-Protein-Assay-Kit (siehe Materialtabelle).
- Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA)
- EMs mit PBS zu einer Lösung von 1 × 107-1 × 108 Partikeln/ml verdünnt und mit einer 1-ml-Spritze bei einer Durchflussrate von 500-1000 μl/min in die Kammer des NTA-Instruments (siehe Materialtabelle) injiziert.
- Öffnen Sie die 488 Laserkanäle und stellen Sie sicher, dass die Anzahl der EMs in der Softwareschnittstelle zwischen 100 und 300 liegt und sich in Brownscher Bewegung befindet.
- Wählen Sie gemäß dem Protokoll des Herstellers die geeignete SOP (EV-488) aus, um sicherzustellen, dass die Empfindlichkeit des Geräts für die EM-Detektion geeignet ist.
- Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
- Fixieren Sie EMs (1 mg/ml) mit einem gleichen Volumen von 5 % Glutaraldehyd für 30 Minuten und quantifizieren Sie die Konzentration der EMs mit 1 mg/ml mit dem BCA-Protein-Assay-Kit.
- Geben Sie einen 10-μl-Tropfen EMs auf die Kohlenstoffseite des Kupfergewebes und entfernen Sie nach 10 Minuten überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier von der Seite. 10 μl PBS zugeben und sofort mit Filterpapier abtupfen. Wiederholen Sie dies zweimal, um überschüssiges Glutaraldehyd zu entfernen.
- Geben Sie 5 μl Uranylacetat-Kontrastmittel und färben Sie es 1 Minute lang negativ, dann entfernen Sie das überschüssige Kontrastmittel. Dreimal mit entionisiertem Wasser waschen und bei Raumtemperatur trocknen.
- Aufnahme eines Bildes mit einem TEM bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV.
- Western-Blotting
- Zu den Proben werden 100 μl Zelllysepuffer und 5 μl eines 50-fachen Proteaseinhibitor-Cocktails hinzugefügt (siehe Materialtabelle). Mit einer Pipettenpistole vorsichtig mischen und 30 Minuten auf Eis legen.
- Die Lösung wird bei 1000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, die Proteinkonzentration des Überstandes mit einem BCA-Protein-Assay-Kit quantifiziert und gesammelt.
- Mischen Sie den 100-μl-Überstand mit 25 μl 5-fachem Proteinladepuffer und erhitzen Sie ihn 10 Minuten lang bei 95 °C.
- Bereiten Sie die Gele gemäß den Anweisungen der vorgeformten Gele vor. Laden Sie 15 μg Protein pro Vertiefung und lassen Sie es durch Gelelektrophorese bei 80 V laufen. Warten Sie, bis die Probe zum Trenngel läuft, wechseln Sie auf 100 V und übertragen Sie das Protein dann auf eine Nitrozellulosemembran bei 100 V, 60 Minuten unter Eisbad.
- Nachweis der nicht-EV-spezifischen Marker (Calnexin) und EV-Biomarker (Annexin und CD63) mittels Western Blot (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Die Antikörper werden gemäß den Empfehlungen des Herstellers verdünnt.
3. In-vitro-EM-Funktionserkennung
- EM-Kennzeichnung
- Mischen Sie 1 μl PKH26 mit 250 μl Verdünnungsmittel C (1:250), um 2x Färbelösung (4 × 10-6 M) herzustellen (siehe Materialtabelle).
- Mischen Sie 250 μl EMs (1 mg/ml) mit 250 μl 2-facher Färbelösung und blasen Sie schnell mit einer Pipettierpistole.
- Bei RT für 2-5 Minuten inkubieren, während das Zentrifugenröhrchen vorsichtig umgedreht wird.
- Fügen Sie ein gleiches Volumen Serum oder 1 % Rinderserumprotein hinzu und inkubieren Sie 1 Minute lang, um die Verdauung zu beenden.
- Entfernen Sie überschüssiges PKH26 durch Ultrafiltration mit 1000 KD-Ultrafiltrationsröhrchen bei 3000 x g für 30 Minuten und wiederholen Sie dies dreimal durch Zugabe von PBS. Resuspendieren Sie die verbleibende Flüssigkeit mit PBS auf 500 μl und filtrieren Sie sie durch einen 0,22-μm-Filter.
- Zellaufnahme-Assay
- Zellinokulation: 1 × 106 Zellen in konfokalen 35-mm-Schalen mit 1 ml DMEM mit 10 % FBS und 5 % P/S aussäen und bei 37 °C und 5 %CO2 über Nacht inkubieren.
- Filtern Sie die EMs mit sterilen 0,22 μm Spritzenfiltern, um mögliche Verunreinigungen zu entfernen.
- Behandeln Sie die Zellen 8 Stunden lang mit PKH26-markierten EMs (109 Partikel/ml).
- Dreimal mit PBS waschen, DAPI (10 ng/ml) zugeben und 10 Minuten bei RT inkubieren.
- Erfassen Sie die Fluoreszenzbilder in der konfokalen Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskopie mit den 405-nm- und 561-nm-Laserkanälen (siehe Materialtabelle).
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Representative Results
Der Arbeitsablauf der EM-Präparation durch magnetabscheidungsgestützte Hochgeschwindigkeitshomogenisierung ist in Abbildung 1 dargestellt. Zellen internalisieren 10 nm Polylysin-modifizierte IONPs, die spezifisch durch Endozytose in Endosomen akkumuliert werden (Abbildung 3A). Nach der Behandlung mit hypotonem Puffer und der Homogenisierung werden die IONP-beladenen Endosomen aus den Zellen freigesetzt und anschließend durch magnetische Trennung gesammelt. Die isolierten Endosomen werden durch Hochgeschwindigkeitshomogenisierung weiter in monodisperse Nanovesikel rekonstituiert, die auch als EMs bezeichnet werden. Wir untersuchten mehrere Schlüsselparameter (z. B. Homogenisierungsgeschwindigkeit und -zeit), um optimierte EM-Präparationsbedingungen zu identifizieren (Abbildung 2). Schließlich wurde eine Homogenisierungsgeschwindigkeit von 140 x g für 5 min unter Berücksichtigung der Partikelgröße und der Ausbeute der erzeugten EMs als optimierte Bedingung gewählt. Freie IONPs und IONP-beladene EMs werden schließlich durch eine zweite Runde der magnetischen Trennung aus der Endproduktlösung entfernt, um IONP-freie EMs zu erhalten. Die Methode erzeugt sehr gleichmäßige und monodisperse Nanovesikel aus Endosomen der Elternzelle, die den gleichen biologischen Ursprung wie native EVs haben.
Um durch Ultrazentrifugation erhaltene EVs mit EMs zu vergleichen, die mit dieser Methode erzeugt wurden, wurden BMSC und 293T für EVs und EMs hergestellt. Der Durchmesser und die Morphologie der EMs wurden mittels NTA und TEM analysiert. Die Morphologie der BMSC-EMs weist das Merkmal einer typischen schalenförmigen vesikelartigen Struktur auf und wird durch eine Lipiddoppelschicht begrenzt (Abbildung 3A). Wie von der NTA analysiert, haben sowohl BMSC-EMs als auch 293T-EMs einen ähnlichen hydrodynamischen Durchmesser wie native EVs (BMSC-EVs und 293T-EVs) (Abbildung 3B). Die BMSC-EMs-Ausbeuten der Hochgeschwindigkeitshomogenisierung betrugen 8,16 × 10 8-1,42 × 109/1 × 106Zellen, und die Ausbeute nativer EVs, die durch Ultrazentrifugation hergestellt wurden, betrug nur 7,2 × 10 7-1,12 × 108/1 × 106 Zellen. In ähnlicher Weise betrugen die 293T-EMs-Ausbeuten der Hochgeschwindigkeitshomogenisierung 3,71 × 10 8-7,58 × 108/1 × 10 6 Zellen, was bis zu etwa 100-fach höher ist als die von nativen 293T-EVs, die mit der herkömmlichen Ultrazentrifugenmethode hergestellt wurden (≈5,5 × 106/1 × 106 Zellen) (Abbildung 4A).
Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse des Western Blotting, dass BMSC-EMs die gleichen Protein-Biomarker wie EVs (CD63 und Annexin) enthalten. Sowohl EMs als auch EVs sind negativ für die Calnexin-Expression, was darauf hindeutet, dass EMs, die mit dieser Methode hergestellt wurden, fast keine Plasmamembrankontamination aufwiesen (Abbildung 3C). Es gibt keinen signifikanten Unterschied in der Proteinkonzentration zwischen EM und EV, BMSC-EMs und BMSC-EVs wiesen ähnliche Gesamtproteinkonzentrationen auf, 11,15 μg/1 × 10 9 Partikel und 14,71 μg/1 × 109 Partikel über das BCA-Protein-Assay-Kit. Darüber hinaus wiesen 293T-EMs und 293T-EVs Gesamtproteinkonzentrationen von ca. 31,8 μg/1 × 10 9 Partikeln bzw. 9,95 μg/1 × 109 Partikeln auf (Abbildung 4B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass EMs eine ähnliche Proteinzusammensetzung wie native EVs aufweisen. Um festzustellen, ob EMs endozytiert werden können, wurden PKH26-markierte EMs und EVs mit BMSC und ID8 in einer Konzentration von 1 × 109 Partikeln/ml für 8 h co-inkubiert, und die Zellen wurden unter konfokaler Fluoreszenzmikroskopie beobachtet, um zu bestätigen, dass EMs von den Zellen ebenso leicht aufgenommen werden können wie EVs (Abbildung 5).
Abbildung 1: Schematische Darstellung des magnetgestützten Hochgeschwindigkeits-Homogenisierungsverfahrens. Schritt 1: Zellen internalisieren IONPs durch Endozytose in Endosomen. Schritt 2: Sammeln Sie Organellen, einschließlich IONP-beladener Endosomen, nach hypotoner Behandlung und Homogenisierung. Schritt 3: Reinigen Sie IONP-beladene Endosomen durch magnetische Trennung. Schritt 4: Die Endosomen werden homogenisiert und zu monodispersen Nanovesikeln rekonstituiert. Schritt 5: Entfernen Sie freie IONPs und IONP-geladene EMs durch magnetische Trennung, um IONP-freie EMs zu sammeln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Die Optimierung der EM-Präparationsbedingungen . (A) Der Durchmesser und der PDI von BMSC-EMs als Reaktion auf Änderungen der Homogenisierungsgeschwindigkeit bei Einstellung der Zeit auf 5 min wurden mit DLS analysiert. (B) Der Durchmesser und der PDI von BMSC-EMs als Reaktion auf Änderungen der Homogenisierungszeit, wenn die Homogenisierungsgeschwindigkeit auf 140 x g eingestellt wird, wurden mittels DLS analysiert. (C) Der Durchmesser und der PDI von BMSC-EMs zu verschiedenen Lagerzeitpunkten wurden mittels DLS analysiert. (D) Der Durchmesser und die Konzentration von BMSC-EMs als Reaktion auf Änderungen der Homogenisierungsgeschwindigkeit, wenn die Zeit auf 5 min eingestellt wird, wurden von NTA analysiert. (E) Der Durchmesser und die Konzentration von BMSC-EMs als Reaktion auf die Änderung der Homogenisierungszeit bei Einstellung der Homogenisierungsgeschwindigkeit auf 140 x g wurden mittels NTA analysiert. (F) Der Durchmesser und die Ausbeute von BMSC-EMs als Reaktion auf die Co-Inkubation von BMSC-Zellen mit IONPs unterschiedlicher Konzentrationen wurden von NTA analysiert. p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Charakterisierung von EMs. (A) TEM-Charakterisierung der Morphologie von Elternzellen mit endozytierten IONPs, Endosomen und EMs. Die Maßstabsbalken stellen 500 nm dar. (B) Die hydrodynamischen Durchmesser von BMSC-EM, BMSC-EV, 293T-EM und 293T-EV sind durch NTA charakterisiert. (C) Ergebnisse der Western-Blot-Analyse von BMSC-EMs, BMSC-EVs und BMSC-Zelllysaten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Die Ausbeute von Schwellenländern ist höher als die von Elektrofahrzeugen. (A) Die Ausbeute von Schwellenländern und Elektrofahrzeugen, die aus BMSC und 293T hergestellt wurden, wurde von der NTA analysiert. (B) Proteinausbeute von EMs und EVs, die aus BMSC und 293T hergestellt wurden. **p < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Repräsentative fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von PKH26-markierten EVs und EMs, die von BMSC und ID8 internalisiert wurden. Die Maßstabsbalken stellen 10 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Als Surrogat der zellfreien Therapie und eines nanoskaligen Arzneimittelverabreichungssystems müssen EVs ihre klinischen Erwartungen noch erfüllen, und ein Haupthindernis ist der Mangel an skalierbaren und reproduzierbaren Produktions- und Reinigungsmethoden6. Daher wurden verschiedene Arten von EMs als EV-Analoga mit ähnlicher biologischer Komplexität entwickelt14. Das bisher am häufigsten verwendete EM-Beispiel sind Nanovesikel aus Zellplasmamembranen. Die Herstellung solcher Nanovesikel ist relativ einfach und unkompliziert durch direktes Extrudieren ganzer Elternzellen17. Aus Zellplasmamembranen gewonnene Nanovesikel können jedoch aufgrund von zwei Nachteilen keine nativen EVs rekapitulieren: Erstens liegt der biologische Ursprung dieser Nanovesikel in der Zellplasmamembran, die im Vergleich zu nativen EVs andere Lipid- und Proteinzusammensetzungen enthält; Zweitens führen die Kontaminationen, einschließlich Proteine, Nukleinsäuren und Lipide aus Nicht-EV-Organellen und Zelltrümmern, zu einer unvermeidlichen EM-Heterogenität. Bei dieser Methode inkubierten wir Zellen mit IONPs und sammelten IONP-beladene Endosomen durch magnetische Trennung, erzeugten dann monodisperse Nanovesikel durch Hochgeschwindigkeitshomogenisierung und erhielten schließlich IONP-freie EMs durch eine zweite Runde der magnetischen Trennung. Darüber hinaus haben wir die EM-Präparationsbedingungen optimiert, indem wir den Einfluss verschiedener Parameter, wie z. B. Homogenisierungsgeschwindigkeit und -zeit, auf die EM-Größe und -Ausbeute untersucht haben. Dieses Protokoll macht sich ein interessantes biologisches Phänomen zunutze: MNPs (z.B. 10 nm IONPs) können von fast allen Zellen über Endozytose effizient internalisiert werden und sich ausschließlich in Endosomen anreichern, nicht in anderen Organellen. Dieses einzigartige biologische Verfahren ermöglichte die Isolierung von MNP-beladenen Endosomen ohne Nicht-EV-Kontaminationen durch magnetische Trennung. Im Gegenzug könnten Nanovesikel, die von diesen gereinigten Zellendosomen hergestellt werden, die biologische Komplexität nativer EVs genauer rekapitulieren.
Darüber hinaus ist der goldene Standard der EV-Isolationsmethode die Ultrazentrifugation, die massive Zellkulturmedien und eine lange Verarbeitungszeit von über 5 h kostet und nur 1 × 107-1 × 108 Partikel aus 1 x 106 Zellen6 erzeugt. Herkömmliche Extrusionsmethoden für ganze Elternzellen umfassen mehrere Schritte mit Ultrahochdruckmembranextrusion und Ultrazentrifugation, die eine relativ höhere Ausbeute aufweisen, aber teure Ausrüstung erfordern17. Die Ausbeute, die Effizienz, die Kosten und die Arbeitskraft der Schwellenländer werden jedoch durch die Verwendung unseres Protokolls erheblich verbessert. Der Hochgeschwindigkeitshomogenisator ist ein gängiges und kostengünstiges Gerät für eine kurze Verarbeitungszeit von 5 Minuten in diesem Protokoll, und diese Methode kann im Vergleich zu nativen Elektrofahrzeugen bis zu 100-mal mehr EMs von 1 ×10 6 Zellen erzeugen. Diese Methode weist jedoch einige Einschränkungen auf, wie z. B. den Verlust endosomaler Proteine während der Hochgeschwindigkeitshomogenisierung, und es wurde gezeigt, dass MNPs, die von Zellen endozytiert wurden, auf Lysosomen übertragen werden können, was eine potenzielle Kontamination darstellen würde18.
Perspektivisch können EMs so konstruiert werden, dass sie wichtige biologische Funktionen wie ihre nativen Gegenstücke ausüben, was als neuartige und vielversprechende Art von biologischen Therapeutika dienen kann. Bioaktive Substanzen (z. B. Proteine und Nukleinsäuren) können durch die Selektion spezifischer Elternzellen (z. B. Stammzellen19) oder durch genetische Modifikation (z. B. Fusionsproteine20) in EMs integriert werden. So wirken sich beispielsweise aus Zellen gewonnene Nanovesikel durch Extrusion lebender embryonaler Stammzellen positiv auf den Heilungs- oder Wundheilungsprozess aus19. Die genetische Modifikation ist ein alternativer Ansatz, um EMs mit spezifischen biologischen Funktionen zu erzeugen. Wenn beispielsweise Zellen mit Vektoren von Anti-Epidermal-Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR)-Nanobodies transfiziert wurden, die mit Glykosylphosphatidylinositol (GPI)-Ankersignalpeptiden fusioniert wurden, können die EGFR-Nanobodies auf der Oberfläche von EVs verankert werden, um EGFR-exprimierende Tumorzellen anzuvisieren20. EMs haben sich in mehreren präklinischen Studien als Surrogat für eine zellfreie Therapie und ein nanoskaliges Wirkstoffverabreichungssystem bewährt14, aber es fehlt ein umfassendes mechanistisches Verständnis von EM oder EV-basierter Therapie, da Bedenken hinsichtlich der Heterogenität und Reproduzierbarkeit von EVs und EMs in klinischen Studien bestehen. Zusammengenommen rechtfertigen die biologischen Funktionen von EMs und ihre klinischen Implikationen weitere Untersuchungen.
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Disclosures
D.W. und P.G. sind Miterfinder einer Patentanmeldung, die vom Institute of Basic Medicine and Cancer (IBMC) der Chinesischen Akademie der Wissenschaften eingereicht wurde. Der andere Autor erklärt, dass keine Interessenkonflikte vorliegen.
Acknowledgments
Die Autoren würdigen den Einsatz von Instrumenten in der Shared Instrumentation Core Facility am Institute of Basic Medicine and Cancer (IBMC) der Chinesischen Akademie der Wissenschaften. Diese Studie wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (NSFC; 82172598), der Natural Science Foundation of Zhejiang Province, China (LZ22H310001), dem 551 Health Talent Training Project der Gesundheitskommission der Provinz Zhejiang, China, dem Agricultural and Social Development Research Project des Hangzhou Municipal Science and Technology Bureau (2022ZDSJ0474) und dem Qiantang Interdisciplinary Research Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin antibody | ABclonal | A11235 | Western blotting |
| BCA assay kit | Beyotime | P0012 | Protein concentration assay |
| Calnexin | GeneTex | HL1598 | Western blotting |
| CD63 antibody | ABclonal | A19023 | Western blotting |
| Cell lysis buffer for Western and IP | Beyotime | P0013 | Western blotting |
| Centrifuge | Beckman | Allegra X-30R | Cell centrifuge |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | NIKON | A1 HD25 | Photo the fluorescence picture |
| DMEM basic (1x) | GIBCO | C11995500BT | Cell culture |
| Dynamic light scattering (DLS) | Malvern | Zetasizer Nano ZS ZEN3600 | Diameter analysis |
| Electric glass homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | DY89-II | Low-speed homogenization |
| Exosome-depleted FBS | system Bioscience | EXO-FBS-50A-1 | Cell culture |
| High-speed homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | XHF-DY | High-speed homogenization |
| Magnetic grate | Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China) | NA | Magnetic separation |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT | The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C |
| Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs) | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag1100-10 | Cell culture |
| Potassium chloride | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Protease inhibitor cocktail | Beyotime | P1030 | Proteinase inhibitor |
| Sodium citrate | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Transmission electron microscopy (TEM) | JEOL | JEM-2100plus | Morphology image |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
| ZetaView nanoparticle tracking analyzers | Particle Metrix | PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
References
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