Высокоскоростной метод гомогенизации с помощью магнитной сепарации для крупномасштабного производства везикул, полученных из эндосом
Summary
В данной работе мы описываем метод высокоскоростной гомогенизации с помощью магнитной сепарации для крупномасштабного производства нановезикул, полученных из эндосом, как нового типа имитаторов экзосом (ЭМ), которые имеют то же биологическое происхождение и сходную структуру, морфологию и белковый состав нативных внеклеточных везикул (ВВ).
Abstract
Внеклеточные везикулы (ВВ) привлекли значительное внимание в физиологических и патологических исследованиях, диагностике и лечении заболеваний; Тем не менее, их клиническая трансляция была ограничена отсутствием подходов к масштабному производству. Таким образом, этот протокол обеспечивает высокоскоростной метод гомогенизации с помощью магнитной сепарации для крупномасштабного производства нановезикул, полученных из эндосом, в качестве нового типа имитаторов экзосом (ЭМ), полученных из эндосом, которые имеют примерно в 100 раз более высокий выход, чем традиционный метод ультрацентрифугирования. В этом методе магнитные наночастицы (MNP) интернализировались родительскими клетками посредством эндоцитоза и впоследствии накапливались в их эндосомах. Затем были собраны эндосомы с MNP, загруженные MNP, и очищены с помощью гипотонической обработки и магнитной сепарации. Высокоскоростной гомогенизатор был использован для разбиения эндосом, загруженных MNP, на монодисперсные нановезикулы. Полученные везикулы, полученные из эндосом, имеют одинаковое биологическое происхождение и структуру, характеризуются анализом отслеживания наночастиц, просвечивающим электронным микроскопом и вестерн-блоттингом. Их морфология и белковый состав аналогичны нативным ВВ, что указывает на то, что ЭМ потенциально могут служить недорогим и высокопродуктивным суррогатом нативных ВВ для клинических трансляций.
Introduction
Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой небольшие везикулы, секретируемые почти всеми клетками с диапазоном размеров 30-150 нм, содержащие большое количество биологически активных веществ. В зависимости от исходной клетки ВВ демонстрируют высокую гетерогенность, обладая несколькими компонентами, специфичными для родительских клеток1. ВВ высвобождаются в жидкости организма и транспортируются в отдаленные участки, где они поглощаются клетками-мишенями для действия2, которое может быть использовано для доставки широкого спектра биологически активных молекул и лекарств для восстановления тканей, диагностики и лечения опухолей, а также иммуномодуляции 3,4. Однако другие биологические наночастицы (например, липопротеины) и нановезикулы (например, ВВ, полученные из неэндосомальных путей) с аналогичными биофизическими свойствами в жидкостях организма неизбежно влияют на выделение и очистку ВВ. На сегодняшний день ультрацентрифугирование остается золотым стандартом для изоляции ВВ, ибыли разработаны другие методы изоляции, включая центрифугирование с градиентом плотности сахарозы, ультрафильтрацию, осаждение полиэтиленгликоля, хроматографию и иммуномагнитную изоляцию шариков. В настоящее время узким местом, ограничивающим клиническую трансляцию и коммерциализацию терапевтических средств для лечения ВВ, является острая нехватка методов выделения, которые позволяют обеспечить высокомасштабируемую и воспроизводимую изоляцию ВВ 6,7,8. Традиционные методы выделения ВВ (например, ультрацентрифугирование и эксклюзионная хроматография) страдают от низкого выхода (1 x 107-1 x 108/1 x 106 клеток), длительного производственного цикла (24-48 ч), плохой воспроизводимости качества продукции и требуют дорогостоящего и энергоемкого производственного оборудования, которое не может удовлетворить текущий клинический спрос на электромобили6.
Имитаторы экзосом (ЭМ), синтетические суррогаты нативных электромобилей, привлекли важное внимание из-за их очень похожей структуры, функций и масштабируемости в производстве. Основным источником ЭМ является прямая экструзия целых родительских клеток с непрерывным секционированием9,10, демонстрирующая мощные биологические функции нативных ВВ11,12. Например, ЭМ, полученные из мезенхимальных стволовых клеток пуповины человека (hUCMSCs), оказывают такое же ранозаживляющее действие, как и нативные ВВ, и более богаты белковым составом13. Несмотря на то, что ЭМ, полученные из цельных клеток, имеют биологическую сложность ВВ, их основным недостатком является гетерогенность продуктов, поскольку они неизбежно загрязняются различными клеточными органеллами и клеточным мусором. Анализ локализации белков также показал, что ЭМ, полученные в результате экструзии цельных клеток, содержат много неспецифичных для ВВ белков из митохондрий и эндоплазматического ретикулума13. Кроме того, большинство методов производства ЭМ по-прежнему требуют ультрацентрифугирования, что является очень трудоемким и энергоемкимпроцессом14. Принимая во внимание тот факт, что экзосомы происходят исключительно из клеточных эндосом, мы предположили, что биоинженерные нановезикулы, полученные из эндосом, могут лучше повторять биологическую гомологию между экзосомами и ЭМ по сравнению с хорошо зарекомендовавшими себя ЭМ, полученными из клеточных мембран, полученными методом экструзии цельных клеток14. Тем не менее, производство нановезикул, полученных из эндосом, затруднено из-за отсутствия жизнеспособных подходов.
Клинические исследования проводились с использованием ВВ в качестве суррогата бесклеточной терапии и наноразмерной системы доставки лекарств для лечения различных заболеваний. Например, ВВ, полученные из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, использовались для лечения тяжелой пневмонии, вызванной COVID-19, и достигли многообещающих результатов. Недавно генетически модифицированные электромобили, несущие белки CD24, также продемонстрировали мощные терапевтические преимущества для лечения пациентов с COVID-1915,16. Тем не менее, клинические требования к терапии ВВ все еще не могут быть удовлетворены традиционными методами изоляции из-за низкой производительности и стоимости. В этом исследовании сообщается о крупномасштабном производстве нановезикул, полученных из эндосом, с помощью высокоскоростной гомогенизации с помощью магнитной сепарации. Он использует эндоцитозный путь MNP для выделения эндосом, загруженных MNP, с помощью магнитной сепарации с последующей высокоскоростной гомогенизацией для формирования эндосом в монодисперсные нановезикулы. Поскольку типы эндосом, собранных в рамках этого протокола, разнообразны, все еще необходимы дальнейшие углубленные исследования для установления надлежащей производственной практики (GMP) в отрасли. Этот новый подход к ЭМ-подготовке является более эффективным по времени (5 минут высокоскоростной гомогенизации) для получения нановезикул, гомологичных нативным ВВ. Он производит экспоненциально больше везикул из тех же количеств клеток, чем ультрацентрифугирование, которое в целом может быть применено к различным типам клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Являясь суррогатом бесклеточной терапии и наноразмерной системы доставки лекарств, ВВ еще не оправдали своих клинических ожиданий, и основным препятствием является отсутствие масштабируемых и воспроизводимыхметодов производства и очистки. Поэтому в качестве аналогов В…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают использование приборов в Центре совместного использования контрольно-измерительных приборов в Институте фундаментальной медицины и рака (IBMC) Китайской академии наук. Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC; 82172598), Фондом естественных наук провинции Чжэцзян, Китай (LZ22H310001), Проектом 551 по подготовке кадров в области здравоохранения Комиссии по здравоохранению провинции Чжэцзян, Китай, Исследовательским проектом по сельскохозяйственному и социальному развитию Муниципального научно-технического бюро Ханчжоу (2022ZDSJ0474) и Междисциплинарным исследовательским грантом Цяньтан.
Materials
| Annexin antibody | ABclonal | A11235 | Western blotting |
| BCA assay kit | Beyotime | P0012 | Protein concentration assay |
| Calnexin | GeneTex | HL1598 | Western blotting |
| CD63 antibody | ABclonal | A19023 | Western blotting |
| Cell lysis buffer for Western and IP | Beyotime | P0013 | Western blotting |
| Centrifuge | Beckman | Allegra X-30R | Cell centrifuge |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | NIKON | A1 HD25 | Photo the fluorescence picture |
| DMEM basic (1x) | GIBCO | C11995500BT | Cell culture |
| Dynamic light scattering (DLS) | Malvern | Zetasizer Nano ZS ZEN3600 | Diameter analysis |
| Electric glass homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | DY89-II | Low-speed homogenization |
| Exosome-depleted FBS | system Bioscience | EXO-FBS-50A-1 | Cell culture |
| High-speed homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | XHF-DY | High-speed homogenization |
| Magnetic grate | Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China) | NA | Magnetic separation |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT | The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C |
| Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs) | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag1100-10 | Cell culture |
| Potassium chloride | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Protease inhibitor cocktail | Beyotime | P1030 | Proteinase inhibitor |
| Sodium citrate | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Transmission electron microscopy (TEM) | JEOL | JEM-2100plus | Morphology image |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
| ZetaView nanoparticle tracking analyzers | Particle Metrix | PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
References
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), eaau6977 (2020).
- Hyenne, V., et al. RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion. J Cell Biol. 211 (1), 27-37 (2015).
- Farooqi, A. A., et al. Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds. Biotechnol Adv. 36 (1), 328-334 (2018).
- Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrol Dial Transplant. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Castilletti, C., et al. Coordinate induction of IFN-alpha and -gamma by SARS-CoV also in the absence of virus replication. Virology. 341 (1), 163-169 (2005).
- Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Cancer nanomedicines in an evolving oncology landscape. Trends Pharmacol Sci. 41 (10), 730-742 (2020).
- Jo, W., et al. Large-scale generation of cell-derived nanovesicles. Nanoscale. 6 (20), 12056-12064 (2014).
- Yoon, J., et al. Generation of nanovesicles with sliced cellular membrane fragments for exogenous material delivery. Biomaterials. 59, 12-20 (2015).
- Li, M., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells ablate neuroblastoma tumor in vitro and in vivo. Biomater Adv. 142, 213161 (2022).
- Wang, J., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells deliver doxorubicin to osteosarcoma in vitro and in vivo. Drug Deliv. 29 (1), 3291-3303 (2022).
- Zhang, Z., et al. Comprehensive proteomic analysis of exosome mimetic vesicles and exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 312 (2022).
- Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. J Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
- Yang, W., et al. Clinical characteristics of 310 SARS-CoV-2 Omicron variant patients and comparison with Delta and Beta variant patients in China. Virol Sin. 37 (5), 12 (2022).
- Shapira, S., et al. A novel platform for attenuating immune hyperactivity using EXO-CD24 in COVID-19 and beyond. EMBO Mol Med. 14 (9), 15997 (2022).
- Jang, S. C., et al. Bioinspired exosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery of chemotherapeutics to malignant tumors. ACS Nano. 7 (9), 7698-7710 (2013).
- Le, T. S., et al. Quick and mild isolation of intact lysosomes using magnetic-plasmonic hybrid nanoparticles. ACS Nano. 16 (1), 885-896 (2022).
- Jeong, D., et al. Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation. Biomaterials. 35 (34), 9302-9310 (2014).
- Kooijmans, S. A., et al. Display of GPI-anchored anti-EGFR nanobodies on extracellular vesicles promotes tumour cell targeting. J Extracell Vesicles. 5, 31053 (2016).
