Summary
Establecemos un modelo murino de infección relacionada con el catéter (IRC) asociada a C. albicans, en el que se forma una biopelícula en el catéter, y la interacción entre C. albicans y el huésped se correlaciona bien con el IRC clínico. Este modelo ayuda a cribar terapias para el IRC asociado a la biopelícula de C. albicans , sentando las bases para la transformación clínica.
Abstract
La infección relacionada con catéteres (IRC) es una infección nosocomial común causada por candida albicans durante la implantación de catéteres. Por lo general, las biopelículas se forman en la superficie externa del catéter y conducen a infecciones diseminadas, que son fatales para los pacientes. No hay una prevención y un tratamiento eficaces en las clínicas. Por lo tanto, es urgente establecer un modelo animal de IRC para el cribado preclínico de nuevas estrategias para su prevención y tratamiento. En este estudio, se insertó un catéter de polietileno, un catéter médico ampliamente utilizado, en la parte posterior de los ratones BALB/c después de la depilación. Candida albicans Posteriormente, se inoculó ATCC MYA-2876 (SC5314) que expresa proteína fluorescente verde mejorada en la superficie de la piel a lo largo del catéter. Se observó una intensa fluorescencia en la superficie del catéter bajo un microscopio fluorescente 3 días después. Se encontraron biopelículas maduras y gruesas en la superficie del catéter mediante microscopía electrónica de barrido. Estos resultados indicaron la adhesión, colonización y formación de biopelículas de Candida albicans en la superficie del catéter. La hiperplasia de la epidermis y la infiltración de células inflamatorias en las muestras de piel indicaron los cambios histopatológicos de la piel asociada a la IRC. En resumen, se estableció con éxito un modelo CRI de ratón. Se espera que este modelo sea útil en la investigación y el desarrollo del manejo terapéutico para el IRC asociado a Candida albicans .
Introduction
En los últimos años, con el desarrollo y la aplicación de materiales biomédicos, las infecciones relacionadas con implantes están emergiendo como problemas clínicos difíciles 1,2. Con la amplia aplicación de catéteres médicos en las clínicas, el número de infecciones y muertes relacionadas es enorme cada año 3,4. Las vías de infección comunes de una infección relacionada con el catéter (IRC) incluyen: (1) los patógenos en la superficie de la piel se infiltran en el cuerpo y se adhieren a la superficie externa del catéter 5,6,7; (2) los patógenos derivados de la operación aséptica inadecuada invaden, se adhieren y colonizan el catéter; (3) los patógenos en la circulación sanguínea se adhieren y colonizan el catéter; (4) medicamentos contaminados por microorganismos patógenos.
La cándida es la tercera causa más común de IRC 8,9. Es muy probable que cause infección del torrente sanguíneo y otras candidiasis invasivas potencialmente mortales después de que se formen biopelículas en la superficie del implante. El pronóstico es malo y la tasa de mortalidad es alta2. Se ha reportado que se forman biopelículas en la superficie del catéter dentro de las 2 semanas posteriores a la inserción venosa central y en la luz del catéter unas semanas después10,11.
Las biopelículas de Candida albicans (C. albicans) formadas en catéteres médicos exhiben una red de doble capa compuesta por levaduras, estroma y micelio12,13. La formación de biopelículas de C. albicans no solo es clave para la resistencia a los medicamentos y la evasión inmune13, sino que también es vital para producir esporas diseminadas, lo que conduce a una mayor infección hematógena 2,12 y tiene consecuencias más graves e incluso potencialmente mortales. La IRC asociada a C. albicans es una de las principales causas de infecciones clínicas del torrente sanguíneo fúngico 7,14, y más del 40% de los pacientes con infección por C. albicans en el catéter venoso central desarrollarán bacteriemia15.
Según la Sociedad Americana de Enfermedades Infecciosas, el tratamiento recomendado para el CRI de Candida incluye (1) la extracción del catéter infectado; (2) someter a los pacientes a una terapia antifúngica sistémica de 14 días8; (3) Reimplante de un nuevo catéter4. Sin embargo, en aplicaciones clínicas, a veces los catéteres no se pueden quitar por completo. Algunos pacientes solo pueden ser tratados con antibióticos sistémicos y terapia de bloqueo antimicrobiano, acompañados de fuertes efectos secundarios16,17.
Los modelos animales existentes de C. albicans, como el modelo de candidiasis orofaríngea, el modelo de candidiasis vaginal y el modelo de infección sistémica invasiva causada por candidiasis18,19 no pueden correlacionarse bien con el IRC clínico. Por lo tanto, en este estudio, se estableció un modelo de CRI asociado a C. albicans en ratones. Se utilizaron catéteres clínicos de polietileno de uso común como implantes subcutáneos20,21, y se inocularon C. albicans en la superficie de la piel para simular la adhesión de C. albicans a los catéteres médicos y la formación de biopelículas.
Este modelo se ha utilizado con éxito en nuestro laboratorio para evaluar el efecto anti-biofilm de diferentes terapias22. Además, debido al retraso en la detección de C. albicans después de la infección por catéter, se construyó una cepa de C. albicans que contenía proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) y se inoculó en ratones para facilitar la observación intuitiva de las colonias y biopelículas de C. albicans en el catéter implantado.
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Protocol
Los animales de experimentación, ratones machos BALB/c (12-16 g), se compraron en el Centro de Animales de Laboratorio del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Jiaotong de Xi'an. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Ética Animal de la Universidad Xi'an Jiaotong con el número de licencia SCXK (Shaanxi) 2021-103.
1. Preparación del tampón y del equipo
- Transfectar cepas de C. albicans con un plásmido pCaExp de alta expresión.
- Compre C. albicans (SC5314) de ATCC. Obtener la cepa fluorescente de alta expresiónEGFP 22 transfecando C. albicans con un plásmido de alta expresión pCaExp que contenga el marco de lectura abierto completo del gen EGFP (el mapa del plásmido se muestra en la Figura 1) y utilizarlo para experimentos posteriores.
- Cultive las cepas transfectadas de C. albicans .
- Seleccionar colonias monoclonales de la cepa fluorescente de C. albicans a partir de la placa de extracto de levadura medio de peptona dextrosa (YPD) y cultivar durante la noche (30 °C y 220 rpm) en 5 mL de medio líquido YPD (YPD + 50 μg/mL de carbenicilina).
- Resuspender C . albicans en solución salina normal después de la centrifugación a 400 x g durante 5 min a RT.
- Ajuste la concentración de suspensión de C. albicans a 1 x 108 células/mL comparando la turbidez con 0.5 estándar de McFarland.
- Preparar los instrumentos quirúrgicos.
- Asegúrese de esterilizar en autoclave todos los instrumentos quirúrgicos (tijeras, fórceps, pinzas hemostáticas, portaagujas, agujas de sutura) a 121 °C durante 30 min. Se utilizan catéteres estériles de polietileno (diámetro interior: 0,28 mm; diámetro exterior: 0,63 mm).
NOTA: Los catéteres utilizados en este estudio fueron esterilizados con gas óxido de etileno y el envase se abrió en una mesa ultralimpia expuesta a los rayos UV durante más de 30 min. Antes de la implantación en ratones, los catéteres se sumergieron en etanol al 75% para evitar la contaminación.
- Asegúrese de esterilizar en autoclave todos los instrumentos quirúrgicos (tijeras, fórceps, pinzas hemostáticas, portaagujas, agujas de sutura) a 121 °C durante 30 min. Se utilizan catéteres estériles de polietileno (diámetro interior: 0,28 mm; diámetro exterior: 0,63 mm).
2. Establecimiento de un modelo CRI de ratón
NOTA: El procedimiento quirúrgico se muestra en la Figura 2.
- Aclimatar a 30 ratones BALB/c (12-16 g, macho) en condiciones libres de patógenos específicos (SPF) con libre acceso al agua y a los alimentos y 12 h-12 h alternando el ciclo de luz y oscuridad.
- Divida aleatoriamente 30 ratones BALB/c en tres grupos (n = 10 ratones/grupo): (A) grupo de control normal; (B) grupo catéter (catéteres implantados sin C. albicans); (C) Grupo modelo (catéteres implantados con C. albicans).
- Anestesiar a los ratones con isoflurano al 1-4% y colocarlos en una mesa de operaciones en posición prona. La pérdida del reflejo de enderezamiento y la falta de respuesta a la estimulación de los dedos del pie confirman el éxito de la anestesia. Retire el vello y esterilice el sitio quirúrgico con tres rondas alternas de yodoforo o clorhexidina y exfoliantes con alcohol.
- Deje a los ratones en el grupo de control normal sin ningún tratamiento y proporcione libre acceso a comida y agua.
- Para los ratones de los grupos de catéter y modelo, mantener la anestesia al 3% de isoflurano. Confirme la profundidad anestésica adecuada por la ausencia de una respuesta al pellizco del dedo del pie y ajuste la concentración de isoflurano según sea necesario.
- Para los ratones del grupo de catéteres, inserte por vía intradérmica una aguja de jeringa estéril de 1 ml en el área depilada por la espalda para hacer un orificio. Inserte un catéter (de aproximadamente 1 cm de largo) en el orificio después de retirar la aguja de la jeringa.
- Para los ratones del grupo modelo, pipetee 20 μL de suspensión de C. albicans en el área de depilación posterior para simular el comensal de C. albicans en la piel.
- Después de que la solución sea absorbida por la piel, inserte un catéter en el área depilada de la espalda con los mismos procedimientos que se describen en el paso 2.5.
- Pipetear otros 20 μL de suspensión de C. albicans a lo largo del catéter hasta el tejido para simular C . albicans en el ambiente externo.
- Fije los catéteres con cinta adhesiva y gasa y devuelva a los ratones a las jaulas para que se alimenten. Al final del tratamiento, inyectar subcutáneamente a los ratones meloxicam (4 mg/kg) como analgesia durante tres días consecutivos.
NOTA: Después de la cirugía, los ratones fueron alimentados cuidadosamente con agua y comida. Los ratones fueron monitoreados dos veces al día. Los ratones fueron sacrificados mediante un método aprobado por la IACUC si experimentaban dificultades para alimentarse, pérdida de peso significativa (10-20%) e hipotermia.
3. Evaluación del modelo CRI
- Después de 3 días, anestesiar a los ratones con isoflurano al 3% y sacrificarlos por luxación cervical. Recoja los catéteres y las muestras de tejido de la piel de la parte posterior de los ratones.
- Observe C. albicans y biopelículas en el catéter mediante microscopía electrónica de barrido.
- Sumergir los catéteres en una solución de glutaraldehído al 2,5% a 4 °C durante 48 h. Enjuague los catéteres con PBS estéril tres veces.
- Fije los catéteres con ácido ósmico al 1% durante 3 h y enjuáguelos con PBS estéril tres veces.
- Deshidratar las células de los catéteres en una solución de etanol de gradiente con concentraciones ascendentes (50%, 70%, 80%, 90% y 100%, 15 min/gradiente).
- Sumerja los catéteres en alcohol terc-butílico tres veces (30 min cada vez).
- Congele rápidamente los catéteres en nitrógeno líquido y liofilice la muestra en un liofilizador según las instrucciones del fabricante.
- Recubra las muestras del catéter con un oro de 10 nm mediante una deposición por haz de iones.
- Observar la presencia de C. albicans y su biofilm en la superficie del catéter de cada grupo bajo un microscopio electrónico de barrido (en condiciones de alto vacío, 1,5 kV) y registrar las imágenes en cada grupo.
- Observar C. albicans en el catéter mediante microscopía de fluorescencia.
- Sumergir los catéteres en una solución de paraformaldehído al 4% para su fijación a 4 °C durante 48 h.
- Observar la presencia de C. albicans y su biofilm en la superficie del catéter de cada grupo mediante un microscopio de fluorescencia bajo excitación de 484 nm y registrar las imágenes en cada grupo.
NOTA: El aumento es de 400x. La fluorescencia de Candida albicans se puede observar con excitación a 490 nm y emisión a 510 nm.
- Observe a C. albicans residiendo en la piel del ratón.
- Sumergir los tejidos de la piel dorsal de los ratones en una solución de paraformaldehído al 4% para su fijación a 4 °C durante 48 h.
- Deshidratar los tejidos dorsales de la piel en una solución de etanol de gradiente con concentraciones ascendentes (50%, 70%, 80%, 90% y 100%, 15 min/gradiente).
- Incrustar los tejidos deshidratados de la piel dorsal en parafina a 55-60 °C. Preste atención a la temperatura para evitar tejidos quebradizos. Para eliminar tantas impurezas como sea posible, repita este paso tres veces (30 minutos cada una).
- Seccionar los tejidos de la piel dorsal (grosor = 5 μm) con un micrótomo.
- Desparafinar las secciones de parafina sumergiendo los portaobjetos en xileno dos veces durante 20 min.
- Rehidratar las secciones mediante elución con etanol de gradiente (etanol absoluto, etanol al 90%, etanol al 75%, agua) durante 5 min cada vez.
- Tiñe las secciones con ácido peryódico sumergiendo la sección en la solución de ácido peryódico durante 15 minutos antes de lavarlas con agua corriente una vez y agua destilada dos veces.
- Tiña las secciones con una solución de tinción de chevron (según las instrucciones del fabricante) durante 30 minutos en la oscuridad y enjuaga las secciones con agua corriente durante 5 minutos.
- Sumerja las secciones en una solución de hematoxilina durante 3-5 minutos antes de lavarlas con agua corriente (2-3 minutos), solución diferenciada (5-10 minutos) y agua corriente, respectivamente.
- Sumerja las secciones en etanol tres veces (5 minutos cada una) y xileno dos veces (5 minutos cada una) antes de sellar la sección con goma neutra.
- Observe las imágenes del espécimen con un microscopio y analice los residuos de C. albicans en la piel del ratón.
NOTA: El aumento es de 10x para el ocular y de 4x o 10x para la lente del objetivo.
- Observar los cambios histopatológicos en los tejidos dorsales de la piel.
- Sumergir los tejidos de la piel dorsal en una solución de paraformaldehído al 4% para su fijación a 4 °C durante 48 h. Deshidratar los tejidos dorsales de la piel en una solución de etanol de gradiente con concentraciones ascendentes (50%, 70%, 80%, 90% y 100%, 15 min/gradiente).
- Incrustar los tejidos deshidratados de la piel dorsal en parafina como se describe en el paso 3.4.3.
- Seccionar los tejidos de la piel dorsal (grosor = 5 mm) con un micrótomo.
- Desparafinar las secciones de parafina sumergiendo los portaobjetos en xileno dos veces durante 20 min.
- Rehidratar las secciones mediante elución con etanol de gradiente (etanol absoluto, etanol al 90%, etanol al 75%, agua) durante 5 min cada vez.
- Tiñe las secciones con hematoxilina durante 4 minutos antes de enjuagar con agua del grifo para eliminar el color flotante.
- Diferencie la muestra con una solución de ácido clorhídrico y etanol al 1% antes de enjuagar los portaobjetos con agua corriente.
- Sumerja la muestra en etanol al 85% y al 95% durante 5 minutos y tiña con solución de eosina durante 3 minutos.
- Deshidratar la muestra sumergiéndola en etanol de gradiente (70%, 90%, 95% y 100%) y xileno durante 2 minutos cada una.
- Selle la muestra con resina neutra.
- Observar las imágenes de la muestra con un microscopio y analizar los cambios patológicos.
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Representative Results
Los C. albicans y las biopelículas en los catéteres pudieron ser observados por el SEM. Como se muestra en la Figura 322, la superficie de los catéteres de polietileno en el grupo de catéteres era lisa y no se observó ningún microorganismo patógeno adherido. Sin embargo, las biopelículas maduras y densas de C. albicans fueron visibles en la superficie de los catéteres de polietileno en el grupo modelo, lo que indica que C. albicans podría colonizar y formar biopelículas con éxito en la superficie del catéter en ratones en las condiciones experimentales. Además, los resultados de la microscopía de fluorescencia confirmaron aún más las conclusiones anteriores (Figura 4)22. No hubo fluorescencia evidente en la superficie de los catéteres de polietileno en el grupo de catéteres. Sin embargo, la fuerte fluorescencia emitida por las células adherentes de C. albicans fue visible en la superficie del catéter en el grupo modelo. Esto indicó que un gran número de células de C. albicans se adhirieron a la superficie de los catéteres, lo que demostró la construcción exitosa de modelos CRI relacionados con la biopelícula de C. albicans en ratones.
Con el fin de verificar la infección del tejido de la piel del ratón de forma más intuitiva, se realizó el análisis de tinción del Periodato de Sheff. Detecta los hidratos de carbono de las células fúngicas, lo que se utiliza habitualmente en la investigación clínica (Figura 5)22. El tejido cutáneo en el grupo de control normal y catéter se tiñó negativamente con ácido peryódico-Schiff (PAS), lo que indicó la ausencia de células de C. albicans en los tejidos. Se observó un pequeño número de células positivas de C. albicans teñidas con PAS en el grupo modelo, lo que valida aún más la simulación exitosa de la invasión y adhesión relacionadas con C. albicans.
A continuación, se evaluaron los cambios patológicos en los tejidos de la piel de ratones inducidos por C. albicans mediante análisis histopatológico. Como se muestra en la Figura 622, la capa de la epidermis se engrosó significativamente y se extendió a la parte interna de la piel en el grupo modelo. La infiltración inflamatoria también fue visible, lo que indica que la infección por C. albicans causó cambios patológicos obvios en el tejido de la piel del ratón. La capa de la epidermis, la capa de la dermis, las glándulas sebáceas, los folículos pilosos y otras estructuras estaban claras y completas en el grupo de catéteres. No se observaron edemas ni infiltración inflamatoria, similar a la del grupo control normal. Estos resultados indicaron que la inserción del catéter por sí sola no causó cambios evidentes en el tejido de la piel. Los cambios patológicos en los tejidos del grupo modelo fueron el resultado de la infección causada por C. albicans. En resumen, los resultados validan el establecimiento exitoso de un modelo de ratón CRI asociado con biofilm de C. albicans .
Figura 1: Atlas de plásmidos de pCaExp. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Esquema que muestra el procedimiento del modelo de ratones CRI asociado a C. albicans. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: SEM en la superficie del catéter en cada grupo. (A) Grupo de catéteres; (B) Grupo de modelos (1000x, barra de escala = 50 μm; 5000x, barra de escala = 10 μm). Esta figura ha sido modificada con permiso de Mo et al.22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Microscopía de fluorescencia de superficie del catéter en cada grupo. (A) Grupo de catéteres; (B) Grupo de modelos (barra de escala = 100 μm). Esta figura ha sido modificada con permiso de Mo et al.22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Tinción de H&E de la piel posterior de ratones en cada grupo. (A) Grupo de catéteres; B) Grupo modelo; (C) Grupo de control, (40x, barra de escala = 400 μm; 100x, barra de escala = 200 μm). Esta figura ha sido modificada con permiso de Mo et al.22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Tinción de PAS de la piel dorsal de ratones de cada grupo. (A) Grupo de catéteres; B) Grupo modelo; (C) Grupo de control, (40x, barra de escala = 400 μm; 100x, barra de escala = 200 μm). En el grupo modelo se puede observar un engrosamiento significativo y una extensión de la capa de la epidermis a la parte interna de la piel (rectángulos rojos). Esta figura ha sido modificada con permiso de Mo et al.22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El CRI es una de las infecciones nosocomiales más frecuentes en la práctica clínica23. Los patógenos en los apéndices de la piel, como la epidermis, las glándulas sebáceas y los folículos pilosos, son todas posibles causas de IRC23,24. Candida es el tercer patógeno más grande que causa IRC, en el cual Candida albicans fue el tipo más común de infección por biopelícula25,26. Por lo tanto, nuestro objetivo fue construir un modelo animal relevante de IRC relacionado con la biopelícula de Candida albicans para apoyar el tratamiento y la prevención de la IRC relacionada.
Para construir el modelo CRI, se agregó una pequeña cantidad de C. albicans a la piel dorsal de ratones, lo que simula la situación clínica en la que parte de C . albicans no puede erradicarse completamente en los tejidos profundos y apéndices de la piel mediante esterilización rutinaria. Después de la implantación del catéter, se volvió a inocular C. albicans para imitar la presencia de C. albicans en el ambiente externo durante la cirugía.
En este estudio, se seleccionó un punto de tiempo de 3 días para la construcción del modelo, el cual es menor que el de los modelos animales tradicionales relacionados con la biopelícula de C. albicans 18,27 debido a la dificultad en la formación de la biopelícula. Después de la infección, la adhesión y la formación de biopelículas de C. albicans fueron visibles en la superficie del catéter en este modelo, lo que se demostró mediante los resultados de SEM y microscopía de fluorescencia (Figura 3 y Figura 4). Esto puede deberse a que la concentración de C. albicans en este estudio fue de 1 × 108 UFC/mL, que fue muy superior a la de otros modelos animales18,27. Además, la piel alrededor del catéter está en contacto constante con el medio externo. Para simular los ambientes extremos que el CRI puede encontrar, C. albicans fue inoculado nuevamente después de la cirugía.
La recurrencia de la infección suele ser causada por patógenos que permanecen en los tejidos circundantes 23,28,29. Por lo tanto, la presencia o ausencia de patógenos en los tejidos es importante para el CRI. En este trabajo, se llevó a cabo la tinción con PAS para investigar los residuos de C. albicans en los tejidos de la piel. Este método también podría utilizarse para evaluar el efecto de eliminación de nuevos fármacos terapéuticos o métodos para la ICR.
En conclusión, se utilizó una cepa de Candida albicans con eGFP para construir un modelo de CRI de ratón para facilitar la observación intuitiva de la colonización de Candida albicans en catéteres. Esta cepa también se puede utilizar para evaluar la interacción entre Candida albicans y las células huésped, por ejemplo, la invasión y adhesión de Candida albicans al huésped, el efecto terapéutico anti-Candida albicans y la respuesta inmunitaria. Además, se utilizó un método de inoculación en dos pasos para simular patógenos derivados del medio externo y del cuerpo. Vale la pena señalar que no se realizó un cultivo microbiano posterior a la infección. La presencia de biopelículas es un factor importante en la baja sensibilidad de los cultivos 30,31,32. Informes previos sugieren que el cultivo microbiano después de la infección tuvo baja sensibilidad, especificidad y precisión 30,31,32,33,34. En cambio, la presencia de biopelículas en el implante es un índice más fiable. Por lo tanto, en este estudio se utilizaron SEM y microscopía de fluorescencia para visualizar e identificar biopelículas de Candida albicans.
Sin embargo, este modelo no simuló la interacción entre la inmunidad debilitada del paciente y la infección por Candida albicans observada en las clínicas. Si el modelo pudiera considerar los tratamientos inmunocomprometidos (como las inyecciones continuas de glucocorticoides)35 antes de la inoculación de Candida albicans , sería posible simular mejor las infecciones que ocurren en situaciones clínicas.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros o relaciones personales que puedan haber influido en el trabajo reportado en este artículo.
Acknowledgments
Agradecemos el apoyo financiero de la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Shaanxi (número de subvención 2021SF-118) y de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (números de subvención 81973409, 82204631).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 Mactutrius turbidibris | Shanghai Lujing Technology Co., Ltd | 5106063 | |
| 2.5% glutaraldehyde fixative solution | Xingzhi Biotechnology Co., Ltd | DF015 | |
| 4 °C refrigerator | Electrolux (China) Electric Co., Ltd | ESE6539TA | |
| Agar | Beijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd | 01-023 | |
| Analytical balances | Shimadzu | ATX124 | |
| Autoclaves Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Butanol | Tianjin Chemio Reagent Co., Ltd | 200-889-7 | |
| Carbenicillin | Amresco | C0885 | |
| Eclipse Ci Nikon upright optical microscope | Nikon | Eclipse Ts2-FL | |
| Glucose | Macklin | D823520 | |
| Inoculation ring | Thermo Scientific | 251586 | |
| Isoflurane | RWD | 20210103 | |
| Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology | P0099 | |
| PAS dye kit | Servicebio | G1285 | |
| Peptone | Beijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd | 01-001 | |
| Polyethylene catheter | Shining Plastic Mall | PE100 | |
| RWD R550 multi-channel small animal anesthesia machine | RWD | R550 | |
| SEM | Hitachi | TM-1000 | |
| Temperature incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd | ZQTY-50N | |
| Ultrapure water water generator | Heal Force | NW20VF | |
| Ultrasound machine | Do-Chrom | DS10260D | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10023428 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021B |
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