Summary
Nous établissons un modèle murin d’infection liée au cathéter (IRC) associée à C. albicans, dans lequel un biofilm se forme sur le cathéter, et l’interaction entre C. albicans et l’hôte est bien corrélée avec l’IRC clinique. Ce modèle aide à dépister les thérapies pour l’IRC associé au biofilm de C. albicans , jetant ainsi les bases d’une transformation clinique.
Abstract
L’infection liée au cathéter (IRC) est une infection nosocomiale courante causée par Candida albicans lors de l’implantation du cathéter. En règle générale, des biofilms se forment sur la surface externe du cathéter et entraînent des infections disséminées, qui sont mortelles pour les patients. Il n’y a pas de prévention et de gestion du traitement efficaces dans les cliniques. Par conséquent, il est urgent d’établir un modèle animal d’IRC pour le criblage préclinique de nouvelles stratégies de prévention et de traitement. Dans cette étude, un cathéter en polyéthylène, un cathéter médical largement utilisé, a été inséré dans le dos des souris BALB/c après l’épilation. Candida albicans L’ATCC MYA-2876 (SC5314) exprimant une protéine fluorescente verte améliorée a ensuite été inoculée à la surface de la peau le long du cathéter. Une fluorescence intense a été observée à la surface du cathéter au microscope fluorescent 3 jours plus tard. Des biofilms matures et épais ont été trouvés à la surface du cathéter par microscopie électronique à balayage. Ces résultats ont indiqué l’adhérence, la colonisation et la formation d’un biofilm de candida albicans à la surface du cathéter. L’hyperplasie de l’épiderme et l’infiltration de cellules inflammatoires dans les échantillons de peau ont indiqué les modifications histopathologiques de la peau associée à l’IRC. Pour résumer, un modèle d’IRC de souris a été établi avec succès. On s’attend à ce que ce modèle soit utile dans la recherche et le développement de la prise en charge thérapeutique de l’IRC associé à Candida albicans .
Introduction
Ces dernières années, avec le développement et l’application de matériaux biomédicaux, les infections liées aux implants sont devenues des problèmes cliniques difficiles 1,2. Avec l’utilisation généralisée des cathéters médicaux dans les cliniques, le nombre d’infections et de décès associés est énorme chaque année 3,4. Les voies d’infection courantes d’une infection liée au cathéter (IRC) comprennent : (1) les agents pathogènes à la surface de la peau s’infiltrent dans le corps et adhèrent à la surface externe du cathéter 5,6,7 ; (2) des agents pathogènes dérivés d’une opération aseptique inappropriée envahissent, adhèrent et colonisent le cathéter ; (3) les agents pathogènes présents dans la circulation sanguine adhèrent et colonisent le cathéter ; 4° les médicaments contaminés par des micro-organismes pathogènes.
Le candida est la troisième raison la plus fréquente de l’IRC 8,9. Il est très probable qu’il provoque une infection de la circulation sanguine et d’autres candidoses invasives potentiellement mortelles après la formation de biofilms à la surface de l’implant. Le pronostic est sombre et le taux de mortalité est élevé2. Il est rapporté que des biofilms se forment à la surface du cathéter dans les 2 semaines suivant l’insertion veineuse centrale et dans la lumière du cathéter quelques semaines plus tard 10,11.
Les biofilms de Candida albicans (C. albicans) formés sur les cathéters médicaux présentent un réseau à double couche composé de levure, de stroma et de mycélium12,13. La formation de biofilms de C. albicans est non seulement une clé de la résistance aux médicaments et de l’évasion immunitaire13, mais aussi vitale pour produire des spores disséminées, ce qui conduit à une nouvelle infection hématogène 2,12 et entraîne des conséquences plus graves, voire mortelles. L’IRC associée à C. albicans est une cause majeure d’infections fongiques cliniques de la circulation sanguine 7,14, et plus de 40 % des patients atteints d’une infection à C. albicans dans le cathéter veineux central développeront une bactériémie15.
Selon l’Infectious Disease Society of America, le traitement recommandé de Candida CRI comprend (1) le retrait du cathéter infecté ; (2) soumettre les patients à un traitement antifongique systémique de 14 jours8 ; 3° la réimplantation d’un nouveau cathéter4. Cependant, dans les applications cliniques, les cathéters ne peuvent pas toujours être complètement retirés. Certains patients ne peuvent être traités qu’avec des antibiotiques systémiques et une thérapie antimicrobienne, accompagnée d’effets secondaires importants16,17.
Les modèles animaux existants de C. albicans, tels que le modèle de candidose oropharyngée, le modèle de candidose vaginale et le modèle d’infection systémique invasive causée par la candidose18,19 ne peuvent pas être bien corrélés avec l’IRC clinique. Par conséquent, dans cette étude, un modèle d’IRC associé à C. albicans chez la souris a été établi. Des cathéters en polyéthylène couramment utilisés en clinique ont été utilisés comme implants sous-cutanés20,21, et C. albicans a été inoculé à la surface de la peau pour simuler l’adhérence de C. albicans aux cathéters médicaux et la formation de biofilms.
Ce modèle a été utilisé avec succès dans notre laboratoire pour dépister l’effet anti-biofilm de différentes thérapies22. De plus, en raison du décalage de détection de C. albicans après une infection par cathéter, une souche de C. albicans contenant une protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) a été construite et inoculée chez la souris pour faciliter l’observation intuitive des colonies et des biofilms de C. albicans sur le cathéter implanté.
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Protocol
Des animaux de laboratoire, des souris mâles BALB/c (12-16 g), ont été achetés au Centre des animaux de laboratoire du Centre des sciences de la santé de l’Université Jiaotong de Xi’an. Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel d’éthique animale de l’Université Jiaotong de Xi’an avec le numéro de licence SCXK (Shaanxi) 2021-103.
1. Préparation du tampon et de l’équipement
- Transfect des souches de C. albicans avec un plasmide à haute expression pCaExp.
- Achetez C. albicans (SC5314) auprès de l’ATCC. Obtenir la souche fluorescente à haute expression22 de l’EGFP en transfectant C. albicans avec un plasmide à haute expression pCaExp contenant le cadre de lecture ouvert complet du gène EGFP (la carte plasmidique est illustrée à la figure 1) et l’utiliser pour des expériences ultérieures.
- Cultivez les souches transfectées de C. albicans .
- Sélectionner des colonies monoclonales de la souche fluorescente de C. albicans à partir de la plaque de milieu de peptone dextrose (YPD) d’extrait de levure et les cultiver pendant une nuit (30 °C et 220 tr/min) dans 5 mL de milieu liquide YPD (YPD + 50 μg/mL de carbénicilline).
- Remettre en suspension le C. albicans dans une solution saline normale après centrifugation à 400 x g pendant 5 min à RT.
- Ajustez la concentration de la suspension de C. albicans à 1 x 108 cellules/mL en comparant la turbidité à la norme de McFarland de 0,5.
- Préparez les instruments chirurgicaux.
- Assurez-vous d’autoclaver tous les instruments chirurgicaux (ciseaux, pinces, pinces hémostatiques, porte-aiguilles, aiguilles de suture) à 121°C pendant 30 min. Des cathéters stériles en polyéthylène (diamètre intérieur : 0,28 mm ; diamètre extérieur : 0,63 mm) sont utilisés.
REMARQUE : Les cathéters utilisés dans cette étude ont été stérilisés avec de l’oxyde d’éthylène gazeux et l’emballage a été ouvert dans une table ultra-propre exposée aux UV pendant plus de 30 minutes. Avant l’implantation chez la souris, les cathéters ont été immergés dans de l’éthanol à 75 % pour éviter toute contamination.
- Assurez-vous d’autoclaver tous les instruments chirurgicaux (ciseaux, pinces, pinces hémostatiques, porte-aiguilles, aiguilles de suture) à 121°C pendant 30 min. Des cathéters stériles en polyéthylène (diamètre intérieur : 0,28 mm ; diamètre extérieur : 0,63 mm) sont utilisés.
2. Mise en place d’un modèle d’IRC chez la souris
REMARQUE : L’intervention chirurgicale est illustrée à la figure 2.
- Acclimater 30 souris BALB/c (12-16 g, mâle) dans des conditions exemptes d’agents pathogènes spécifiques (SPF) avec un libre accès à l’eau et à la nourriture et 12 h à 12 h en alternance de cycle de lumière et d’obscurité.
- Divisez au hasard 30 souris BALB/c en trois groupes (n = 10 souris/groupe) : (A) groupe témoin normal ; (B) groupe de cathéters (cathéters implantés sans C. albicans) ; (C) Groupe modèle (cathéters implantés avec C. albicans).
- Anesthésiez les souris avec 1 à 4 % d’isoflurane et placez-les sur une table d’opération en position couchée. La perte du réflexe de redressement et l’absence de réponse à la stimulation des orteils confirment le succès de l’anesthésie. Retirez les poils et stérilisez le site chirurgical avec trois séries alternées de gommages à l’iodophor ou à la chlorhexidine et à l’alcool.
- Laissez les souris dans le groupe témoin normal sans aucun traitement et donnez-leur un accès libre à la nourriture et à l’eau.
- Pour les souris des groupes cathéter et modèle, maintenir l’anesthésie à 3 % d’isoflurane. Confirmer la profondeur adéquate de l’anesthésie par l’absence de réponse au pincement des orteils et ajuster la concentration d’isoflurane au besoin.
- Pour les souris du groupe cathéter, insérez par voie intradermique une aiguille de seringue stérile de 1 ml dans la zone épilée dans le dos pour faire un trou. Insérez un cathéter (d’environ 1 cm de longueur) dans le trou après avoir retiré l’aiguille de la seringue.
- Pour les souris du groupe modèle, pipeter 20 μL de C. albicans en suspension sur la zone d’épilation du dos pour simuler la commensale C. albicans sur la peau.
- Une fois la solution absorbée par la peau, insérez un cathéter dans la zone épilée du dos en suivant les mêmes procédures que celles décrites à l’étape 2.5.
- Pipeter 20 μL supplémentaires de suspension de C. albicans le long du cathéter jusqu’au tissu pour simuler C . albicans dans l’environnement externe.
- Fixez les cathéters avec du ruban adhésif et de la gaze et remettez les souris dans des cages pour les nourrir. À la fin du traitement, injecter par voie sous-cutanée du méloxicam (4 mg/kg) aux souris comme analgésie pendant trois jours consécutifs.
REMARQUE : Après la chirurgie, les souris ont été soigneusement nourries avec de l’eau et de la nourriture. Les souris ont été surveillées deux fois par jour. Les souris ont été euthanasiées par une méthode approuvée par l’IACUC si elles éprouvaient des difficultés à s’alimenter, une perte de poids importante (10 à 20 %) et une hypothermie.
3. Évaluation du modèle IRC
- Après 3 jours, anesthésiez les souris avec 3% d’isoflurane et sacrifiez-les par luxation cervicale. Prélevez les cathéters et les échantillons de tissu cutané à l’arrière des souris.
- Observez C. albicans et les biofilms sur le cathéter par microscopie électronique à balayage.
- Plonger les cathéters dans une solution de glutaraldéhyde à 2,5 % à 4 °C pendant 48 h. Rincez les cathéters avec du PBS stérile trois fois.
- Fixez les cathéters avec de l’acide osmique à 1 % pendant 3 h et rincez-les trois fois avec du PBS stérile.
- Déshydrater les cellules sur les cathéters dans une solution d’éthanol à gradient avec des concentrations croissantes (50 %, 70 %, 80 %, 90 % et 100 %, 15 min/gradient).
- Plongez les cathéters dans de l’alcool tert-butylique trois fois (30 min à chaque fois).
- Congelez rapidement les cathéters dans de l’azote liquide et lyophilisez l’échantillon dans un lyophilisateur selon les instructions du fabricant.
- Enduire les échantillons de cathéter d’un or de 10 nm par dépôt par faisceau d’ions.
- Observer la présence de C. albicans et de son biofilm à la surface du cathéter de chaque groupe au microscope électronique à balayage (sous vide poussé, 1,5 kV) et enregistrer les images dans chaque groupe.
- Observer C. albicans sur le cathéter par microscopie à fluorescence.
- Immerger les cathéters dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % pour fixation à 4 °C pendant 48 h.
- Observer la présence de C. albicans et de son biofilm à la surface du cathéter de chaque groupe à l’aide d’un microscope à fluorescence sous excitation de 484 nm et enregistrer les images de chaque groupe.
REMARQUE : Le grossissement est de 400x. La fluorescence de Candida albicans peut être observée avec une excitation à 490 nm et une émission à 510 nm.
- Observez C. albicans résidant dans la peau de la souris.
- Immerger les tissus cutanés dorsaux des souris dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % pour fixation à 4 °C pendant 48 h.
- Déshydrater les tissus cutanés dorsaux dans une solution d’éthanol à gradient avec des concentrations croissantes (50 %, 70 %, 80 %, 90 % et 100 %, 15 min/gradient).
- Imprégner les tissus cutanés dorsaux déshydratés dans de la paraffine à 55-60 °C. Faites attention à la température pour éviter les tissus cassants. Pour éliminer un maximum d’impuretés, répétez cette étape trois fois (30 min chacune).
- Sectionner les tissus cutanés dorsaux (épaisseur = 5 μm) à l’aide d’un microtome.
- Décaparaffinez les lames de paraffine en immergeant les lames dans le xylène deux fois pendant 20 min.
- Réhydrater les sections par élution avec de l’éthanol de gradient (éthanol absolu, éthanol 90%, éthanol 75%, eau) pendant 5 min à chaque fois.
- Teindre les sections avec de l’acide périodique en immergeant la section dans la solution acide périodique pendant 15 min avant de laver une fois à l’eau courante et deux fois à l’eau distillée.
- Teindre les sections avec une solution de coloration aux chevrons (selon les instructions du fabricant) pendant 30 minutes dans l’obscurité et rincer les sections à l’eau courante pendant 5 minutes.
- Plongez les sections dans une solution d’hématoxyline pendant 3 à 5 minutes avant de les laver à l’eau courante (2 à 3 minutes), à la solution différenciée (5 à 10 minutes) et à l’eau courante, respectivement.
- Plongez les sections dans de l’éthanol trois fois (5 min chacune) et du xylène deux fois (5 min chacune) avant de sceller la section avec de la gomme neutre.
- Observez les images du spécimen avec un microscope et analysez les résidus de C. albicans dans la peau de la souris.
REMARQUE : Le grossissement est de 10x pour l’oculaire et de 4x ou 10x pour la lentille de l’objectif.
- Observer les changements histopathologiques dans les tissus cutanés dorsaux.
- Immerger les tissus cutanés dorsaux dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % pour fixation à 4 °C pendant 48 h. Déshydrater les tissus cutanés dorsaux dans une solution d’éthanol à gradient avec des concentrations croissantes (50 %, 70 %, 80 %, 90 % et 100 %, 15 min/gradient).
- Intégrez les tissus cutanés dorsaux déshydratés dans de la paraffine comme décrit à l’étape 3.4.3.
- Sectionner les tissus cutanés dorsaux (épaisseur = 5 mm) à l’aide d’un microtome.
- Décaparaffinez les lames de paraffine en immergeant les lames dans le xylène deux fois pendant 20 min.
- Réhydrater les sections par élution avec de l’éthanol de gradient (éthanol absolu, éthanol 90%, éthanol 75%, eau) pendant 5 min à chaque fois.
- Tachez les sections avec de l’hématoxyline pendant 4 min avant de rincer à l’eau du robinet pour enlever la couleur du flotteur.
- Différencier l’échantillon avec une solution d’acide chlorhydrique et d’éthanol à 1 % avant de rincer les lames à l’eau courante.
- Plongez l’échantillon dans de l’éthanol à 85 % et à 95 % pendant 5 min, puis colorez-le avec une solution d’éosine pendant 3 min.
- Déshydrater l’échantillon en l’immergeant dans de l’éthanol de gradient (70 %, 90 %, 95 % et 100 %) et du xylène pendant 2 min chacun.
- Scellez l’échantillon avec de la résine neutre.
- Observez les images de l’échantillon avec un microscope et analysez les changements pathologiques.
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Representative Results
Les C. albicans et les biofilms sur les cathéters ont pu être observés par le MEB. Comme le montre la figure 322, la surface des cathéters en polyéthylène du groupe des cathéters était lisse et aucun micro-organisme pathogène adhérent n’a été observé. Cependant, des biofilms matures et denses de C. albicans étaient visibles à la surface des cathéters en polyéthylène dans le groupe modèle, ce qui indique que C. albicans pouvait coloniser et former avec succès des biofilms à la surface du cathéter chez la souris dans les conditions expérimentales. De plus, les résultats de la microscopie à fluorescence ont permis de confirmer les conclusions ci-dessus (Figure 4)22. Il n’y avait pas de fluorescence évidente à la surface des cathéters en polyéthylène du groupe des cathéters. Cependant, une forte fluorescence émise par les cellules adhérentes de C. albicans était visible à la surface du cathéter dans le groupe modèle. Cela a indiqué qu’un grand nombre de cellules de C. albicans adhéraient à la surface des cathéters, ce qui a démontré la construction réussie de modèles d’IRC liés au biofilm de C. albicans chez la souris.
Afin de vérifier l’infection des tissus cutanés de souris de manière plus intuitive, une analyse de coloration du périodat de Sheff a été effectuée. Il détecte les glucides des cellules fongiques, ce qui est couramment utilisé dans la recherche clinique (Figure 5)22. Le tissu cutané du groupe témoin normal et du cathéter a été coloré négativement par l’acide périodique de Schiff (PAS), ce qui indique l’absence de cellules de C. albicans dans les tissus. Un petit nombre de cellules positives de C. albicans colorées par le PAS ont été observées dans le groupe modèle, ce qui a permis de valider la simulation réussie de l’invasion et de l’adhésion liées à C. albicans.
Ensuite, les changements pathologiques dans les tissus cutanés de souris induits par C. albicans ont été évalués par analyse histopathologique. Comme le montre la figure 622, la couche d’épiderme a été significativement épaissie et étendue à la partie interne de la peau dans le groupe modèle. L’infiltration de l’inflammation était également visible, indiquant que l’infection à C. albicans provoquait des changements pathologiques évidents dans les tissus cutanés de la souris. La couche d’épiderme, la couche de derme, les glandes sébacées, les follicules pileux et d’autres structures étaient claires et complètes dans le groupe cathéter. Aucun œdème ni infiltration inflammatoire n’ont été observés, comme dans le groupe témoin normal. Ces résultats ont indiqué que l’insertion du cathéter seul n’a pas provoqué de changements évidents dans le tissu cutané. Les changements pathologiques dans les tissus du groupe modèle résultaient de l’infection causée par C. albicans. En résumé, les résultats valident la mise en place réussie d’un modèle murin IRC associé au biofilm de C. albicans .
Figure 1 : Atlas des plasmides pCaExp. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Schéma montrant la procédure du modèle de souris IRC associées à C. albicans. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : MEB à la surface du cathéter dans chaque groupe. (A) Groupe de cathéters ; (B) Groupe de modèles (1000x, barre d’échelle = 50 μm ; 5000x, barre d’échelle = 10 μm). Ce chiffre a été modifié avec la permission de Mo et al.22. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Microscopie à fluorescence de surface du cathéter dans chaque groupe. (A) Groupe de cathéters ; (B) Groupe de modèles (barre d’échelle = 100 μm). Ce chiffre a été modifié avec la permission de Mo et al.22. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Coloration H&E de la peau du dos des souris de chaque groupe. (A) Groupe de cathéters ; (B) Groupe modèle ; (C) Groupe de contrôle (40x, barre d’échelle = 400 μm ; 100x, barre d’échelle = 200 μm). Ce chiffre a été modifié avec la permission de Mo et al.22. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Coloration par PAS de la peau du dos des souris de chaque groupe. (A) Groupe cathéter ; (B) Groupe modèle ; (C) Groupe de contrôle (40x, barre d’échelle = 400 μm ; 100x, barre d’échelle = 200 μm). Un épaississement significatif et une extension de la couche d’épiderme à la partie interne de la peau peuvent être observés dans le groupe modèle (rectangles rouges). Ce chiffre a été modifié avec la permission de Mo et al.22. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’IRC est l’une des infections nosocomiales les plus fréquentes dans la pratique clinique23. Les agents pathogènes présents dans les appendices cutanés, tels que l’épiderme, les glandes sébacées et les follicules pileux, sont tous des causes possibles de l’IRC23,24. Le Candida est le troisième plus grand agent pathogène qui cause l’IRC, dans lequel le Candida albicans était le type le plus courant d’infection par le biofilm25,26. Par conséquent, nous avons cherché à construire un modèle animal pertinent de l’IRC lié au biofilm de Candida albicans afin de soutenir le traitement et la prévention de l’IRC associé.
Pour construire le modèle CRI, une petite quantité de C. albicans a été ajoutée à la peau dorsale des souris, ce qui simule la situation clinique dans laquelle une partie de C . albicans ne peut pas être complètement éradiquée dans les tissus profonds et les appendices de la peau par stérilisation de routine. Après l’implantation du cathéter, C. albicans a été réinoculé pour imiter la présence de C. albicans dans l’environnement externe pendant la chirurgie.
Dans cette étude, un point de temps de 3 jours a été sélectionné pour la construction du modèle, ce qui est inférieur à celui des modèles animaux traditionnels liés au biofilm de C. albicans 18,27 en raison de la difficulté de formation du biofilm. Après l’infection, l’adhérence de C. albicans et la formation d’un biofilm étaient visibles à la surface du cathéter dans ce modèle, ce qui a été prouvé par les résultats du MEB et de la microscopie à fluorescence (Figure 3 et Figure 4). Cela peut être dû au fait que la concentration de C. albicans dans cette étude était de 1 × 108 UFC/mL, ce qui était beaucoup plus élevé que celui des autres modèles animaux18,27. De plus, la peau autour du cathéter est en contact constant avec l’environnement extérieur. Pour simuler les environnements extrêmes que l’IRC peut rencontrer, C. albicans a été inoculé à nouveau après l’opération.
La récurrence de l’infection est souvent causée par des agents pathogènes qui restent dans les tissus environnants 23,28,29. Par conséquent, la présence ou l’absence d’agents pathogènes dans les tissus est importante pour l’IRC. Dans cet article, la coloration PAS a été entreprise pour étudier les résidus de C. albicans dans les tissus cutanés. Cette méthode pourrait également être utilisée pour évaluer l’effet de clairance de nouveaux médicaments thérapeutiques ou de nouvelles méthodes pour l’IRC.
En conclusion, une souche de Candida albicans avec eGFP a été utilisée pour construire un modèle d’IRC de souris afin de faciliter l’observation intuitive de la colonisation de Candida albicans sur les cathéters. Cette souche peut également être utilisée pour évaluer l’interaction entre Candida albicans et les cellules hôtes, par exemple, l’invasion et l’adhésion de Candida albicans à l’hôte, l’effet anti-Candida albicans des thérapies et la réponse immunitaire. En outre, une méthode d’inoculation en deux étapes a été utilisée pour simuler des agents pathogènes dérivés de l’environnement extérieur et du corps. Il convient de noter qu’aucune culture microbienne ultérieure après l’infection n’a été effectuée. La présence de biofilms est un facteur important dans la faible sensibilité des cultures 30,31,32. Des rapports antérieurs suggèrent que la culture microbienne après l’infection avait une sensibilité, une spécificité et une précision faibles 30,31,32,33,34. Au lieu de cela, la présence de biofilms sur l’implant est un indice plus fiable. Par conséquent, le MEB et la microscopie à fluorescence ont été utilisés dans cette étude pour visualiser et identifier les biofilms formant Candida albicans.
Cependant, ce modèle n’a pas simulé l’interaction entre l’immunité affaiblie du patient et l’infection à Candida albicans observée en clinique. Si le modèle pouvait prendre en compte les traitements immunodéprimés (tels que les injections continues de glucocorticoïdes)35 avant l’inoculation de Candida albicans , il serait possible de mieux simuler les infections survenant dans des situations cliniques.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents connus ou de relations personnelles qui auraient pu sembler influencer les travaux rapportés dans cet article.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants du soutien financier de la Fondation des sciences naturelles de la province du Shaanxi (numéro de subvention 2021SF-118) et de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (numéros de subvention 81973409, 82204631).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 Mactutrius turbidibris | Shanghai Lujing Technology Co., Ltd | 5106063 | |
| 2.5% glutaraldehyde fixative solution | Xingzhi Biotechnology Co., Ltd | DF015 | |
| 4 °C refrigerator | Electrolux (China) Electric Co., Ltd | ESE6539TA | |
| Agar | Beijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd | 01-023 | |
| Analytical balances | Shimadzu | ATX124 | |
| Autoclaves Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Butanol | Tianjin Chemio Reagent Co., Ltd | 200-889-7 | |
| Carbenicillin | Amresco | C0885 | |
| Eclipse Ci Nikon upright optical microscope | Nikon | Eclipse Ts2-FL | |
| Glucose | Macklin | D823520 | |
| Inoculation ring | Thermo Scientific | 251586 | |
| Isoflurane | RWD | 20210103 | |
| Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology | P0099 | |
| PAS dye kit | Servicebio | G1285 | |
| Peptone | Beijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd | 01-001 | |
| Polyethylene catheter | Shining Plastic Mall | PE100 | |
| RWD R550 multi-channel small animal anesthesia machine | RWD | R550 | |
| SEM | Hitachi | TM-1000 | |
| Temperature incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd | ZQTY-50N | |
| Ultrapure water water generator | Heal Force | NW20VF | |
| Ultrasound machine | Do-Chrom | DS10260D | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10023428 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021B |
References
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