Summary
أنشأنا نموذجا للفأر للعدوى المرتبطة بالقسطرة المرتبطة ب C.albicans (CRI) ، حيث يتشكل الغشاء الحيوي على القسطرة ، ويرتبط التفاعل بين C.albicans والمضيف جيدا مع CRI السريري. يساعد هذا النموذج في فحص العلاجات ل CRI المرتبط بالأغشية الحيوية C.albicans ، مما يضع أساسا للتحول السريري.
Abstract
العدوى المرتبطة بالقسطرة (CRI) هي عدوى شائعة في المستشفيات تسببها المبيضات البيض أثناء زرع القسطرة. عادة ، تتشكل الأغشية الحيوية على السطح الخارجي للقسطرة وتؤدي إلى انتشار العدوى ، والتي تكون قاتلة للمرضى. لا توجد إدارة فعالة للوقاية والعلاج في العيادات. لذلك ، من الملح إنشاء نموذج حيواني ل CRI للفحص قبل السريري للاستراتيجيات الجديدة للوقاية منه وعلاجه. في هذه الدراسة ، تم إدخال قسطرة البولي إيثيلين ، وهي قسطرة طبية مستخدمة على نطاق واسع ، في الجزء الخلفي من الفئران BALB / c بعد إزالة الشعر. المبيضات البيض تم بعد ذلك تلقيح ATCC MYA-2876 (SC5314) الذي يعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن على سطح الجلد على طول القسطرة. لوحظ مضان شديد على سطح القسطرة تحت مجهر الفلورسنت بعد 3 أيام. تم العثور على الأغشية الحيوية الناضجة والسميكة على سطح القسطرة عن طريق المجهر الإلكتروني الماسح. أشارت هذه النتائج إلى الالتصاق والاستعمار وتكوين الأغشية الحيوية للمبيضات البيضاء على سطح القسطرة. يشير تضخم البشرة وتسلل الخلايا الالتهابية في عينات الجلد إلى التغيرات النسيجية المرضية للجلد المرتبط ب CRI. باختصار ، تم إنشاء نموذج CRI للماوس بنجاح. من المتوقع أن يكون هذا النموذج مفيدا في البحث والتطوير في الإدارة العلاجية للمبيضات البيض المرتبطة ب CRI.
Introduction
في السنوات الأخيرة ، مع تطوير وتطبيق المواد الطبية الحيوية ، تظهر الالتهابات المرتبطة بالزرع كمشاكل سريرية صعبة 1,2. مع التطبيق الواسع للقسطرة الطبية في العيادات ، فإن عدد الإصابات والوفيات ذات الصلة ضخم كل عام 3,4. تشمل طرق العدوى الشائعة للعدوى المرتبطة بالقسطرة (CRI) ما يلي: (1) تتسلل مسببات الأمراض الموجودة على سطح الجلد إلى الجسم وتلتصق بالسطح الخارجي للقسطرة5،6،7 ؛ (2) مسببات الأمراض المشتقة من عملية التعقيم غير الصحيحة تغزو القسطرة وتلتصق بها وتستعمرها ؛ (3) مسببات الأمراض في الدورة الدموية تلتصق وتستعمر على القسطرة ؛ (4) الأدوية الملوثة بالكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض.
المبيضات هي السبب الثالث الأكثر شيوعا ل CRI 8,9. من المحتمل جدا أن يسبب عدوى مجرى الدم وغيرها من داء المبيضات الغازي الذي يهدد الحياة بعد تكوين الأغشية الحيوية على سطح الغرسة. التشخيص ضعيف ، ومعدل الوفيات مرتفع2. يذكر أن الأغشية الحيوية تتشكل على سطح القسطرة في غضون أسبوعين بعد الإدخال الوريدي المركزي وفي تجويف القسطرة بعدبضعة أسابيع 10,11.
تظهر الأغشية الحيوية المبيضات البيضاء (C. albicans) التي تشكلت على القسطرة الطبية شبكة مزدوجة الطبقة تتكون من الخميرة والسدى والفطريات12،13. إن تكوين الأغشية الحيوية لبكتيريا C. albicans ليس فقط مفتاحا لمقاومة الأدوية والتهرب المناعي13 ولكنه حيوي أيضا لإنتاج جراثيم منتشرة ، مما يؤدي إلى مزيد من العدوى الدموية 2,12 ويؤدي إلى عواقب أكثر خطورة وحتى مهددة للحياة. يعد CRI المرتبط ب C. albicans سببا رئيسيا لالتهابات مجرى الدم الفطرية السريرية 7,14 ، وأكثر من 40٪ من المرضى الذين يعانون من عدوى C. albicans في القسطرة الوريدية المركزية سيتطورون إلى تجرثمالدم 15.
وفقا لجمعية الأمراض المعدية الأمريكية ، فإن العلاج الموصى به من المبيضات CRI يشمل (1) إزالة القسطرة المصابة. (2) إخضاع المرضى للعلاج المضاد للفطريات الجهازية لمدة 14 يوما8 ؛ (3) إعادة زرع قسطرة جديدة4. ومع ذلك ، في التطبيقات السريرية ، لا يمكن إزالة القسطرة بالكامل في بعض الأحيان. لا يمكن علاج بعض المرضى إلا بالمضادات الحيوية الجهازية والعلاج بقفل مضاد للميكروبات ، مصحوبا بآثار جانبية قوية16,17.
لا يمكن أن ترتبط النماذج الحيوانية الحالية ل C. albicans ، مثل نموذج داء المبيضات الفموي البلعومي ، ونموذج داء المبيضات المهبلي ، ونموذج العدوى الجهازية الغازية التي يسببها داء المبيضات18،19 بشكل جيد مع CRI السريري. لذلك ، في هذه الدراسة ، تم إنشاء نموذج CRI المرتبط ب C. albicans في الفئران. تم استخدام قسطرة البولي إيثيلين السريرية شائعة الاستخدام كغرسات تحت الجلد20,21 ، وتم تلقيح C. albicans على سطح الجلد لمحاكاة التصاق C. albicans بالقسطرة الطبية وتشكيل الأغشية الحيوية.
تم استخدام هذا النموذج بنجاح في مختبرنا لفحص التأثير المضاد للغشاء الحيوي للعلاجات المختلفة22. بالإضافة إلى ذلك ، بسبب تأخر اكتشاف C. albicans بعد عدوى القسطرة ، تم بناء سلالة C. albicans التي تحتوي على بروتين الفلورسنت الأخضر المعزز (EGFP) وتلقيحها في الفئران لتسهيل المراقبة البديهية للمستعمرات والأغشية الحيوية ل C. albicans على القسطرة المزروعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم شراء التجارب ، ذكور الفئران BALB / c (12-16 جم) ، من مركز المختبر ، مركز العلوم الصحية بجامعة شيان جياوتونغ. تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل اللجنة المؤسسية لأخلاقيات بجامعة Xi'an Jiaotong برقم الترخيص SCXK (Shaanxi) 2021-103.
1. إعداد المخزن المؤقت والمعدات
- سلالات Transfect C. albicans مع pCaExp البلازميد عالي التعبير.
- شراء C. albicans (SC5314) من ATCC. احصل على سلالة الفلورسنت عالية التعبيرEGFP 22 عن طريق نقل C. albicans مع pCaExp بلازميد عالي التعبير يحتوي على إطار القراءة المفتوح الكامل لجين EGFP (تظهر خريطة البلازميد في الشكل 1) واستخدمها في التجارب اللاحقة.
- ثقافة سلالات C. albicans المنقولة.
- حدد مستعمرات وحيدة النسيلة من سلالة الفلورسنت C. albicans من لوحة مستخلص الخميرة بيبتون دكستروز المتوسطة (YPD) وزراعتها طوال الليل (30 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة) في 5 مل من الوسط السائل YPD (YPD + 50 ميكروغرام / مل كاربينيسيلين).
- إعادة تعليق C. albicans في محلول ملحي عادي بعد الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
- اضبط تركيز تعليق C. albicans إلى 1 × 108 خلايا / مل من خلال مقارنة التعكر بمعيار 0.5 McFarland.
- تحضير الأدوات الجراحية.
- تأكد من تعقيم جميع الأدوات الجراحية (المقص ، الملقط ، ملقط مرقئ ، حاملات الإبر ، إبر خياطة) على حرارة 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. يتم استخدام قسطرة البولي إيثيلين المعقمة (القطر الداخلي: 0.28 مم ؛ القطر الخارجي: 0.63 مم).
ملاحظة: تم تعقيم القسطرة المستخدمة في هذه الدراسة بغاز أكسيد الإيثيلين وتم فتح العبوة في طاولة فائقة النظافة معرضة للأشعة فوق البنفسجية لأكثر من 30 دقيقة. قبل الزرع في الفئران ، تم غمر القسطرة في 75٪ من الإيثانول لمنع التلوث.
- تأكد من تعقيم جميع الأدوات الجراحية (المقص ، الملقط ، ملقط مرقئ ، حاملات الإبر ، إبر خياطة) على حرارة 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. يتم استخدام قسطرة البولي إيثيلين المعقمة (القطر الداخلي: 0.28 مم ؛ القطر الخارجي: 0.63 مم).
2. إنشاء نموذج CRI للماوس
ملاحظة: يظهر الإجراء الجراحي في الشكل 2.
- تأقلم 30 فأرا BALB / c (12-16 جم ، ذكر) في ظروف خالية من مسببات الأمراض (SPF) مع حرية الوصول إلى الماء والغذاء و 12 ساعة -12 ساعة بالتناوب بين دورة الضوء والظلام.
- قسم عشوائيا 30 فأرا BALB / c إلى ثلاث مجموعات (n = 10 فئران / مجموعة): (أ) مجموعة التحكم العادية. (ب) مجموعة القسطرة (القسطرة المزروعة بدون C. albicans) ؛ (ج) مجموعة نموذجية (قسطرة مزروعة ب C. albicans).
- تخدير الفئران مع 1-4 ٪ isoflurane ووضع الفئران على طاولة العمليات في وضع الانبطاح. يؤكد فقدان رد الفعل الصحيح وعدم الاستجابة لتحفيز إصبع القدم التخدير الناجح. قم بإزالة الشعر وتعقيم موقع الجراحة بثلاث جولات متناوبة من اليودوفور أو الكلورهيكسيدين ودعك الكحول.
- اترك الفئران في المجموعة الضابطة العادية دون أي علاج ووفر حرية الوصول إلى الطعام والماء.
- بالنسبة للفئران في مجموعات القسطرة والنموذج ، حافظ على التخدير بنسبة 3٪ إيزوفلوران. تأكد من عمق التخدير الكافي من خلال عدم وجود استجابة لقرص إصبع القدم واضبط تركيز الأيزوفلوران حسب الحاجة.
- بالنسبة للفئران في مجموعة القسطرة ، أدخل إبرة حقنة معقمة سعة 1 مل في المنطقة التي تم إزالة الشعر منها من الخلف لعمل ثقب. أدخل قسطرة (طولها حوالي 1 سم) في الفتحة بعد إزالة إبرة المحقنة.
- بالنسبة للفئران في المجموعة النموذجية ، يتم تعليق ماصة 20 ميكرولتر من C. albicans على منطقة إزالة الشعر الخلفي لمحاكاة C. albicans المتعايشة على الجلد.
- بعد أن يمتص الجلد المحلول، أدخل قسطرة في المنطقة التي تم إزالة الشعر من خلفيها بنفس الإجراءات الموضحة في الخطوة 2.5.
- ماصة أخرى 20 ميكرولتر من تعليق C. albicans على طول القسطرة إلى الأنسجة لمحاكاة C. albicans في البيئة الخارجية.
- إصلاح القسطرة مع الشريط والشاش وإعادة الفئران إلى أقفاص للتغذية. في نهاية العلاج، يتم حقن الفئران تحت الجلد بالميلوكسيكام (4 ملغ/كغ) كمسكن لمدة ثلاثة أيام متتالية.
ملاحظة: بعد الجراحة ، تم تغذية الفئران بعناية بالماء والطعام. تمت مراقبة الفئران مرتين في اليوم. تم القتل الرحيم للفئران بطريقة معتمدة من IACUC إذا واجهت صعوبات في التغذية ، وفقدان الوزن بشكل كبير (10-20٪) ، وانخفاض حرارة الجسم.
3. تقييم نموذج CRI
- بعد 3 أيام ، قم بتخدير الفئران بنسبة 3٪ إيزوفلوران والتضحية بها عن طريق خلع عنق الرحم. جمع القسطرة وعينات أنسجة الجلد من الجزء الخلفي من الفئران.
- مراقبة C. albicans والأغشية الحيوية على القسطرة عن طريق المسح المجهري الإلكتروني.
- اغمر القسطرة في محلول جلوتارالدهيد 2.5٪ عند 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة. شطف القسطرة مع برنامج تلفزيوني معقم ثلاث مرات.
- إصلاح القسطرة مع حمض osmic 1 ٪ لمدة 3 ساعات وشطفها مع PBS معقمة ثلاث مرات.
- تجفيف الخلايا الموجودة على القسطرة في محلول الإيثانول المتدرج بتركيزات تصاعدية (50٪ ، 70٪ ، 80٪ ، 90٪ ، و 100٪ ، 15 دقيقة / تدرج).
- اغمر القسطرة في كحول ثلاثي بوتيل ثلاث مرات (30 دقيقة في كل مرة).
- قم بتجميد القسطرة بسرعة في النيتروجين السائل ، وقم بتجميد العينة وتجفيفها في مجفف تجميد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- قم بتغطية عينات القسطرة بذهب 10 نانومتر عن طريق ترسيب شعاع أيوني.
- لاحظ وجود C. albicans وبيوفيلمها على سطح القسطرة لكل مجموعة تحت المجهر الإلكتروني الماسح (تحت فراغ عالي ، ظروف 1.5 كيلو فولت) وسجل الصور في كل مجموعة.
- مراقبة C. البيض على القسطرة عن طريق المجهر مضان.
- اغمر القسطرة في محلول بارافورمالدهيد 4٪ للتثبيت عند 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة.
- راقب وجود C. albicans وبيوفيلمها على سطح القسطرة لكل مجموعة بواسطة مجهر مضان تحت إثارة 484 نانومتر وسجل الصور في كل مجموعة.
ملاحظة: التكبير هو 400x. يمكن ملاحظة مضان المبيضات البيض مع الإثارة عند 490 نانومتر والانبعاثات عند 510 نانومتر.
- مراقبة C. البيض المقيمين في جلد الفأر.
- اغمر أنسجة الجلد الظهرية للفئران في محلول بارافورمالدهايد 4٪ للتثبيت عند 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة.
- تجفيف أنسجة الجلد الظهرية في محلول الإيثانول المتدرج بتركيزات تصاعدية (50٪ ، 70٪ ، 80٪ ، 90٪ ، 100٪ ، 15 دقيقة / تدرج).
- قم بتضمين أنسجة الجلد الظهرية المجففة في البارافين عند 55-60 درجة مئوية. انتبه إلى درجة الحرارة لتجنب الأنسجة الهشة. لإزالة أكبر عدد ممكن من الشوائب ، كرر هذه الخطوة ثلاث مرات (30 دقيقة لكل منها).
- قسم أنسجة الجلد الظهرية (سمك = 5 ميكرومتر) مع ميكروتوم.
- قم بإزالة الشمع من أقسام البارافين عن طريق غمر الشرائح في الزيلين مرتين لمدة 20 دقيقة.
- أعد ترطيب الأقسام عن طريق استخلاص الإيثانول المتدرج (الإيثانول المطلق ، 90٪ إيثانول ، 75٪ إيثانول ، ماء) لمدة 5 دقائق في كل مرة.
- قم بتلطيخ المقاطع بالحمض الدوري عن طريق غمر القسم في المحلول الحمضي الدوري لمدة 15 دقيقة قبل غسلها بالماء الجاري مرة واحدة والماء المقطر مرتين.
- قم بتلطيخ الأقسام بمحلول تلطيخ شيفرون (وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) لمدة 30 دقيقة في الظلام وشطف الأقسام تحت الماء الجاري لمدة 5 دقائق.
- اغمر الأقسام في محلول الهيماتوكسيلين لمدة 3-5 دقائق قبل الغسيل بالماء الجاري (2-3 دقائق) ، والمحلول المتمايز (5-10 دقائق) ، والمياه الجارية ، على التوالي.
- اغمر المقاطع في الإيثانول ثلاث مرات (5 دقائق لكل منهما) والزيلين مرتين (5 دقائق لكل منهما) قبل إغلاق القسم بصمغ محايد.
- راقب صور العينة باستخدام المجهر وقم بتحليل بقايا C. albicans في جلد الفأر.
ملاحظة: التكبير هو 10x للعدسة و 4x أو 10x للعدسة الموضوعية.
- مراقبة التغيرات النسيجية المرضية في أنسجة الجلد الظهرية.
- اغمر أنسجة الجلد الظهرية في محلول بارافورمالدهايد 4٪ للتثبيت عند 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة. تجفيف أنسجة الجلد الظهرية في محلول الإيثانول المتدرج بتركيزات تصاعدية (50٪ ، 70٪ ، 80٪ ، 90٪ ، 100٪ ، 15 دقيقة / تدرج).
- قم بتضمين أنسجة الجلد الظهرية المجففة في البارافين كما هو موضح في الخطوة 3.4.3.
- قسم أنسجة الجلد الظهرية (سمك = 5 مم) مع ميكروتوم.
- قم بإزالة الشمع من أقسام البارافين عن طريق غمر الشرائح في الزيلين مرتين لمدة 20 دقيقة.
- أعد ترطيب الأقسام عن طريق استخلاص الإيثانول المتدرج (الإيثانول المطلق ، 90٪ إيثانول ، 75٪ إيثانول ، ماء) لمدة 5 دقائق في كل مرة.
- قم بتلطيخ الأقسام بالهيماتوكسيلين لمدة 4 دقائق قبل شطفها بماء الصنبور لإزالة اللون العائم.
- قم بتمييز العينة بمحلول حمض الهيدروكلوريك والإيثانول بنسبة 1٪ قبل شطف الشرائح بالماء الجاري.
- اغمر العينة في 85٪ و 95٪ إيثانول لمدة 5 دقائق ، وقم بتلطيخها بمحلول eosin لمدة 3 دقائق.
- قم بتجفيف العينة عن طريق غمرها في الإيثانول المتدرج (70٪ و 90٪ و 95٪ و 100٪) والزيلين لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
- ختم العينة مع الراتنج محايد.
- مراقبة صور العينة مع المجهر وتحليل التغيرات المرضية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن ملاحظة C. albicans والأغشية الحيوية على القسطرة بواسطة SEM. كما هو موضح في الشكل 322 ، كان سطح قسطرة البولي إيثيلين في مجموعة القسطرة أملسا ، ولم يلاحظ أي كائنات دقيقة مسببة للأمراض. ومع ذلك ، كانت الأغشية الحيوية C . albicans الناضجة والكثيفة مرئية على سطح قسطرة البولي إيثيلين في المجموعة النموذجية ، مما يشير إلى أن C. albicans يمكن أن تستعمر بنجاح وتشكل الأغشية الحيوية على سطح القسطرة في الفئران في ظل الظروف التجريبية. علاوة على ذلك ، تحققت نتائج الفحص المجهري الفلوري من الاستنتاجات المذكورة أعلاه (الشكل 4)22. لم يكن هناك مضان واضح على سطح قسطرة البولي إيثيلين في مجموعة القسطرة. ومع ذلك ، كان التألق القوي المنبعث من خلايا C. albicans الملتصقة مرئيا على سطح القسطرة في مجموعة النموذج. يشير هذا إلى أن عددا كبيرا من خلايا C. albicans التصقت بسطح القسطرة ، مما يدل على البناء الناجح لنماذج CRI المتعلقة بالأغشية الحيوية C. albicans في الفئران.
من أجل التحقق من إصابة أنسجة جلد الفأر بشكل أكثر حدسية ، تم إجراء تحليل تلطيخ Sheff Periodate. يكتشف الكربوهيدرات في الخلايا الفطرية ، والتي يشيع استخدامها في البحوث السريرية (الشكل 5)22. تم تلطيخ أنسجة الجلد في مجموعة التحكم والقسطرة الطبيعية بشكل سلبي بواسطة حمض شيف الدوري (PAS) ، مما يشير إلى عدم وجود خلايا C. albicans في الأنسجة. لوحظ عدد صغير من خلايا C. albicans الملطخة ب PAS في المجموعة النموذجية ، مما يؤكد صحة المحاكاة الناجحة للغزو والالتصاق المرتبطين ب C. albicans.
بعد ذلك ، تم تقييم التغيرات المرضية في أنسجة جلد الفئران التي تسببها C. albicans عن طريق التحليل النسيجي. كما هو موضح في الشكل 622 ، كانت طبقة البشرة سميكة بشكل كبير وتمتد إلى الجزء الداخلي من الجلد في المجموعة النموذجية. كان تسلل الالتهاب مرئيا أيضا ، مما يشير إلى أن عدوى C. albicans تسببت في تغيرات مرضية واضحة في أنسجة جلد الفأر. كانت طبقة البشرة وطبقة الجلد والغدد الدهنية وبصيلات الشعر والهياكل الأخرى واضحة وكاملة في مجموعة القسطرة. لم يلاحظ أي وذمة وتسلل التهاب ، على غرار المجموعة الضابطة العادية. أشارت هذه النتائج إلى أن إدخال القسطرة وحدها لم يسبب تغييرات واضحة في أنسجة الجلد. التغيرات المرضية في أنسجة المجموعة النموذجية نتجت عن العدوى التي تسببها C. albicans. باختصار ، تؤكد النتائج نجاح إنشاء نموذج فأر CRI مرتبط بالغشاء الحيوي C. albicans .
الشكل 1: أطلس البلازميد pCaExp. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: رسم تخطيطي يوضح إجراء نموذج الفئران CRI المرتبط ب C.albicans. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: SEM على سطح القسطرة في كل مجموعة. (أ) مجموعة القسطرة؛ (ب) مجموعة النماذج (1000x، شريط المقياس = 50 ميكرومتر؛ 5000x، شريط المقياس = 10 ميكرومتر). تم تعديل هذا الرقم بإذن من Mo et al.22. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الفحص المجهري لسطح القسطرة في كل مجموعة. (أ) مجموعة القسطرة؛ (ب) مجموعة النماذج (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). تم تعديل هذا الرقم بإذن من Mo et al.22. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تلطيخ H&E للجلد الخلفي للفئران في كل مجموعة. (أ) مجموعة القسطرة؛ (ب) المجموعة النموذجية؛ (ج) مجموعة التحكم ، (40x ، شريط المقياس = 400 ميكرومتر ؛ 100x ، شريط المقياس = 200 ميكرومتر). تم تعديل هذا الرقم بإذن من Mo et al.22. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تلطيخ PAS للجلد الخلفي للفئران في كل مجموعة. (أ) مجموعة القسطرة؛ (ب) المجموعة النموذجية؛ (ج) مجموعة التحكم ، (40x ، شريط المقياس = 400 ميكرومتر ؛ 100x ، شريط المقياس = 200 ميكرومتر). يمكن رؤية سماكة كبيرة وامتداد طبقة البشرة إلى الجزء الداخلي من الجلد في مجموعة النموذج (المستطيلات الحمراء). تم تعديل هذا الرقم بإذن من Mo et al.22. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRI هي واحدة من أكثر أنواع عدوى المستشفيات شيوعا في الممارسة السريرية23. مسببات الأمراض في الزوائد الجلدية ، مثل البشرة والغدد الدهنية وبصيلات الشعر ، كلها أسباب محتملة ل CRI23,24. المبيضات هي ثالث أكبر مسببات الأمراض التي تسبب CRI ، حيث كانت المبيضات البيض أكثر أنواع عدوى الأغشية الحيوية شيوعا25,26. لذلك ، كنا نهدف إلى بناء نموذج حيواني ذي صلة ب CRI المرتبط بالأغشية الحيوية المبيضات البيض لدعم العلاج والوقاية من CRI ذات الصلة.
لبناء نموذج CRI ، تمت إضافة كمية صغيرة من C. albicans إلى الجلد الظهري للفئران ، والذي يحاكي الحالة السريرية التي لا يمكن فيها القضاء على جزء من C. albicans بالكامل في الأنسجة العميقة وملاحق الجلد عن طريق التعقيم الروتيني. بعد زرع القسطرة ، تم إعادة تلقيح C. albicans لتقليد وجود C. albicans في البيئة الخارجية أثناء الجراحة.
في هذه الدراسة ، تم اختيار نقطة زمنية مدتها 3 أيام لبناء النموذج ، وهي أقل من تلك الخاصة بالنماذج الحيوانية التقليدية المتعلقة بالأغشية الحيوية C. albicans 18,27 بسبب صعوبة تكوين الأغشية الحيوية. بعد الإصابة ، كان التصاق C. albicans وتكوين الأغشية الحيوية مرئيا على سطح القسطرة في هذا النموذج ، وهو ما أثبتته نتائج الفحص المجهري SEM والتألق (الشكل 3 والشكل 4). قد يكون هذا بسبب تركيز C. albicans في هذه الدراسة كان 1 × 108 CFU / مل ، والذي كان أعلى بكثير من النماذج الحيوانية الأخرى18,27. إلى جانب ذلك ، فإن الجلد حول القسطرة على اتصال دائم بالبيئة الخارجية. لمحاكاة البيئات القاسية التي قد تواجهها CRI ، تم تلقيح C. albicans مرة أخرى بعد الجراحة.
غالبا ما يحدث تكرار العدوى بسبب مسببات الأمراض التي تبقى في الأنسجة المحيطة23،28،29. لذلك ، فإن وجود أو عدم وجود مسببات الأمراض في الأنسجة مهم ل CRI. في هذه الورقة ، تم إجراء تلطيخ PAS للتحقيق في بقايا C. albicans في أنسجة الجلد. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لتقييم تأثير إزالة الأدوية العلاجية الجديدة أو طرق CRI.
في الختام ، تم استخدام سلالة المبيضات البيض مع eGFP لبناء نموذج CRI للفأر لتسهيل الملاحظة البديهية لاستعمار المبيضات البيض على القسطرة. يمكن أيضا استخدام هذه السلالة لتقييم التفاعل بين المبيضات البيض والخلايا المضيفة ، على سبيل المثال ، غزو المبيضات البيض والالتصاق بها إلى المضيف ، وتأثير العلاجات المضادة للمبيضات البيض ، والاستجابة المناعية. إلى جانب ذلك ، تم استخدام طريقة تلقيح من خطوتين لمحاكاة مسببات الأمراض المشتقة من البيئة الخارجية والجسم. تجدر الإشارة إلى أن الثقافة الميكروبية اللاحقة بعد الإصابة لم تجر. يعد وجود الأغشية الحيوية عاملا مهما في انخفاض حساسية الثقافات30،31،32. تشير التقارير السابقة إلى أن الثقافة الميكروبية بعد الإصابة كانت منخفضة الحساسية والنوعية والدقة30،31،32،33،34. بدلا من ذلك ، فإن وجود الأغشية الحيوية على الغرسة هو مؤشر أكثر موثوقية. لذلك ، تم استخدام المجهر SEM والمجهر الفلوري في هذه الدراسة لتصور وتحديد المبيضات البيض التي تشكل الأغشية الحيوية.
ومع ذلك ، فإن هذا النموذج لم يحاكي التفاعل بين ضعف مناعة المريض وعدوى المبيضات البيض التي لوحظت في العيادات. إذا كان النموذج يمكن أن يأخذ في الاعتبار العلاجات التي تعاني من نقص المناعة (مثل الحقن المستمر للجلوكوكورتيكويدات)35 قبل تلقيح المبيضات البيض ، فسيكون من الممكن محاكاة العدوى التي تحدث في المواقف السريرية بشكل أفضل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة معروفة أو علاقات شخصية يمكن أن يبدو أنها تؤثر على العمل المذكور في هذه الورقة.
Acknowledgments
نحن ممتنون للدعم المالي المقدم من مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة شنشي (رقم المنحة 2021SF-118) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (أرقام المنح 81973409 82204631).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 Mactutrius turbidibris | Shanghai Lujing Technology Co., Ltd | 5106063 | |
| 2.5% glutaraldehyde fixative solution | Xingzhi Biotechnology Co., Ltd | DF015 | |
| 4 °C refrigerator | Electrolux (China) Electric Co., Ltd | ESE6539TA | |
| Agar | Beijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd | 01-023 | |
| Analytical balances | Shimadzu | ATX124 | |
| Autoclaves Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Butanol | Tianjin Chemio Reagent Co., Ltd | 200-889-7 | |
| Carbenicillin | Amresco | C0885 | |
| Eclipse Ci Nikon upright optical microscope | Nikon | Eclipse Ts2-FL | |
| Glucose | Macklin | D823520 | |
| Inoculation ring | Thermo Scientific | 251586 | |
| Isoflurane | RWD | 20210103 | |
| Paraformaldehyde | Beyotime Biotechnology | P0099 | |
| PAS dye kit | Servicebio | G1285 | |
| Peptone | Beijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd | 01-001 | |
| Polyethylene catheter | Shining Plastic Mall | PE100 | |
| RWD R550 multi-channel small animal anesthesia machine | RWD | R550 | |
| SEM | Hitachi | TM-1000 | |
| Temperature incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd | ZQTY-50N | |
| Ultrapure water water generator | Heal Force | NW20VF | |
| Ultrasound machine | Do-Chrom | DS10260D | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10023428 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific Oxoid | LP0021B |
References
- Kojic, E. M., Darouiche, R. O.
- Giri, S., Kindo, A. J. A review of Candida species causing blood stream infection. Indian Journal of Medical Microbiology. 30 (3), 270-278 (2012).
- Weinstein, R. A., Darouiche, R. O. Device-associated infections: A macroproblem that starts with microadherence. Clinical Infectious Diseases. 33 (9), 1567-1572 (2001).
- Mermel, L. A., et al. Guidelines for the management of intravascular catheter-related infections. Clinical Infectious Diseases. 32 (9), 1249-1272 (2001).
- Seidler, M., Salvenmoser, S., Müller, F. -M. C. In vitro effects of micafungin against Candida biofilms on polystyrene and central venous catheter sections. International Journal of Antimicrobial Agents. 28 (6), 568-573 (2006).
- Chaves, F., et al. Diagnosis and treatment of catheter-related bloodstream infection: Clinical guidelines of the Spanish Society of Infectious Diseases and Clinical Microbiology and (SEIMC) and the Spanish Society of Spanish Society of Intensive and Critical Care Medicine and Coronary Units (SEMICYUC). Medicina Intensiva. 42 (1), 5-36 (2018).
- Raad, I. I., Bodey, G. P. Infectious complications of indwelling vascular catheters. Clinical Infectious Diseases. 15 (2), 197-208 (1992).
- Paul DiMondi, V., Townsend, M. L., Johnson, M., Durkin, M. Antifungal catheter lock therapy for the management of a persistent Candida albicans bloodstream infection in an adult receiving hemodialysis. Pharmacotherapy. 34 (7), e120-e127 (2014).
- Bouza, E., Guinea, J., Guembe, M. The role of antifungals against candida biofilm in catheter-related candidemia. Antibiotics (Basel). 4 (1), 1-17 (2014).
- Raad, I., et al. Ultrastructural analysis of indwelling vascular catheters: a quantitative relationship between luminal colonization and duration of placement. The Journal of Infectious Diseases. 168 (2), 400-407 (1993).
- Yousif, A., Jamal, M. A., Raad, I. Biofilm-based central line-associated bloodstream infections. Advances in Experimental Medicine and Biology. 830, 157-179 (2015).
- Douglas, L. J. Candida biofilms and their role in infection. Trends in Microbiology. 11 (1), 30-36 (2003).
- Mack, D., et al. Biofilm formation in medical device-related infection. International Journal of Artificial Organs. 29 (4), 343-359 (2006).
- Schinabeck, M. K., et al. Rabbit model of Candida albicans biofilm infection: liposomal amphotericin B antifungal lock therapy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (5), 1727-1732 (2004).
- Anaissie, E. J., Rex, J. H., Uzun, O., Vartivarian, S. Predictors of adverse outcome in cancer patients with candidemia. The American Journal of Medicine. 104 (3), 238-245 (1998).
- Fujimoto, K., Takemoto, K. Efficacy of liposomal amphotericin B against four species of Candida biofilms in an experimental mouse model of intravascular catheter infection. Journal of Infection and Chemotherapy. 24 (12), 958-964 (2018).
- Shuford, J. A., Rouse, M. S., Piper, K. E., Steckelberg, J. M., Patel, R. Evaluation of caspofungin and amphotericin B deoxycholate against Candida albicans biofilms in an experimental intravascular catheter infection model. The Journal of Infectious Diseases. 194 (5), 710-713 (2006).
- Koh, A. Y., Köhler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal damage and neutropenia are required for Candida albicans dissemination. PLoS Pathogens. 4 (2), e35 (2008).
- Tucey, T. M., et al. Glucose homeostasis is important for immune cell viability during candida challenge and host survival of systemic fungal infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
- Lawrence, E. L., Turner, I. G. Materials for urinary catheters: a review of their history and development in the UK. Medical Engineering & Physics. 27 (6), 443-453 (2005).
- Schumm, K., Lam, T. B. Types of urethral catheters for management of short-term voiding problems in hospitalized adults: a short version Cochrane review. Neurourology and Urodynamics. 27 (8), 738-746 (2008).
- Mo, F., et al. Development and evaluation of a film forming system containing myricetin and miconazole nitrate for preventing candida albicans catheter-related infection. Microbial Drug Resistance. 28 (4), 468-483 (2022).
- Balikci, E., Yilmaz, B., Tahmasebifar, A., Baran, E. T., Kara, E. Surface modification strategies for hemodialysis catheters to prevent catheter-related infections: A review. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 109 (3), 314-327 (2021).
- María, L. T., Alejandro, G. S., María Jesús, P. G. Central venous catheter insertion: Review of recent evidence. Best Practice & Research. Clinical Anaesthesiology. 35 (1), 135-140 (2021).
- Kojic, E. M., Darouiche, R. O.
- He, Y., et al. Retrospective analysis of microbial colonization patterns in central venous catheters, 2013-2017. Journal of Healthcare Engineering. 2019, 8632701 (2019).
- Mo, F., et al. In vitro and in vivo effects of the combination of myricetin and miconazole nitrate incorporated to thermosensitive hydrogels on C. albicans biofilms. Phytomedicine. 71, 153223 (2020).
- Cantón-Bulnes, M. L., Garnacho-Montero, J. Practical approach to the management of catheter-related bloodstream infection. Revista Espanola de Quimioterapia. 32 Suppl 2 (Suppl 2), 38-41 (2019).
- Böhlke, M., Uliano, G., Barcellos, F. C. Hemodialysis catheter-related infection: prophylaxis, diagnosis and treatment. The Journal of Vascular Access. 16 (5), 347-355 (2015).
- Fang, X., et al. Effects of different tissue specimen pretreatment methods on microbial culture results in the diagnosis of periprosthetic joint infection. Bone & Joint Research. 10 (2), 96-104 (2021).
- Naumenko, Z. S., Silanteva, T. A., Ermakov, A. M., Godovykh, N. V., Klushin, N. M. Challenging diagnostics of biofilm associated periprosthetic infection in immunocompromised patient: A clinical case. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 7 (5), 786-790 (2019).
- Cai, Y., et al. Metagenomic next generation sequencing improves diagnosis of prosthetic joint infection by detecting the presence of bacteria in periprosthetic tissues. International Journal of Infectious Diseases. 96, 573-578 (2020).
- Samanipour, A., Dashti-Khavidaki, S., Abbasi, M. R., Abdollahi, A. Antibiotic resistance patterns of microorganisms isolated from nephrology and kidney transplant wards of a referral academic hospital. Journal of Research in Pharmacy Practice. 5 (1), 43-51 (2016).
- Huang, G., Huang, Q., Wei, Y., Wang, Y., Du, H. Multiple roles and diverse regulation of the Ras/cAMP/protein kinase A pathway in Candida albicans. Molecular Microbiology. 111 (1), 6-16 (2019).
- Garlito-Díaz, H., et al. A new antifungal-loaded sol-gel can prevent candida albicans prosthetic joint infection. Antibiotics (Basel). 10 (6), 711 (2021).
