Summary
يوفر نموذج الفأر AcroSensE وطرق تصوير الخلايا الحية الموصوفة هنا نهجا جديدا لدراسة ديناميكيات الكالسيوم في المقصورة تحت الخلوية للحيوانات المنوية القمية وكيفية تنظيمها للخطوات الوسيطة التي تؤدي إلى اندماج الغشاء وكثرة الخلايا القمي.
Abstract
الإخراج الخلوي القمي (AE) ، حيث تندمج الحويصلة الخارجية المفردة للحيوانات المنوية مع غشاء البلازما ، هي عملية معقدة تعتمد على الكالسيوم ضرورية للتخصيب. ومع ذلك ، فإن فهمنا لكيفية تنظيم إشارات الكالسيوم AE لا يزال غير مكتمل. على وجه الخصوص ، التفاعل بين ديناميكيات الكالسيوم داخل الأكروسوم والخطوات الوسيطة المؤدية إلى AE غير محدد جيدا. هنا ، نصف طريقة توفر رؤى مكانية وزمانية لديناميكيات الكالسيوم الأكروسومية وعلاقتها باندماج الغشاء والإخراج الخلوي اللاحق للحويصلة القمي. تستخدم الطريقة فأرا جديدا معدلا وراثيا يعبر عن مستشعر يستهدف Acrosome للإخراج الخلوي (AcroSensE). يجمع المستشعر بين مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا (GCaMP) المنصهر مع mCherry. تم تصميم بروتين الاندماج هذا خصيصا لتمكين المراقبة المتزامنة لديناميكيات الكالسيوم الأكروسومية وأحداث اندماج الغشاء. يتم تحقيق المراقبة في الوقت الفعلي لديناميكيات الكالسيوم الأكروسومية و AE في المنوية الحية AcroSensE باستخدام مزيج من التصوير بمعدل إطارات مرتفع ونظام توصيل المنشطات الذي يمكن أن يستهدف المنوية المفردة. يوفر هذا البروتوكول أيضا العديد من الأمثلة على الطرق الأساسية لتحديد وتحليل البيانات الأولية. نظرا لأن نموذج AcroSensE مشفر وراثيا ، يمكن زيادة أهميته العلمية باستخدام الأدوات الجينية المتاحة بسهولة ، مثل التهجين مع النماذج الجينية الأخرى للفئران أو الأساليب القائمة على تحرير الجينات (CRISPR). باستخدام هذه الاستراتيجية ، يمكن حل أدوار مسارات الإشارات الإضافية في سعة المنوية والإخصاب. باختصار ، توفر الطريقة الموضحة هنا أداة ملائمة وفعالة لدراسة ديناميكيات الكالسيوم في حجرة تحت خلوية محددة - الجسيم القمي للحيوانات المنوية - وكيف تنظم هذه الديناميات الخطوات الوسيطة التي تؤدي إلى اندماج الغشاء وكثرة الخلايا القمي.
Introduction
تكتسب المنوية القدرة على الإخصاب أثناء عملية تسمى السعة1. إحدى نقاط النهاية لهذه العملية هي أن المنوية تكتسب القدرة على الخضوع ل AE. أكثر من عقدين من البيانات تدعم وجود نموذج معقد متعدد الخطوات من AE في المنوية للثدييات (ملخصة في2،3). ومع ذلك ، فإن دراسة AE في المنوية الحية أمر صعب ، والطرق المتاحة حاليا لمراقبة هذه العملية بدقة كافية مرهقة وتتطلب خطوات تحضير متعددة4 ، وتقتصر على اكتشاف الخطوة الأخيرة من AE (على سبيل المثال ، باستخدام PNA5) ، تقتصر على قياسات التغيرات في الكالسيوم الخلوي (على عكس ديناميكيات الكالسيوم الأكروسومي) ، أو تقتصر على قياسات ديناميات الكالسيوم الخلوية أو AE6.
للتغلب على بعض القيود الرئيسية لدراسات AE في الوقت الفعلي في ظل الظروف الفسيولوجية ولتمكين التحقيق في التفاعل بين ديناميكيات الكالسيوم و AE ، تم إنشاء نموذج فأر فريد. في نموذج الفأر هذا ، يتم التعبير عن بروتين اندماج يتكون من مستشعر Ca2+ المشفر وراثيا (GCaMP3) و mCherry واستهدافه إلى الجسيم القمي باستخدام محفز أكروسين وببتيد إشارة2. يتيح مستشعر GCaMP3-mCherry المزدوج المستهدف إجراء قياسات متزامنة في الوقت الفعلي لتركيزات الكالسيوم وحالة المحتويات القحمية في المنوية الحية في ظل الظروف الفسيولوجية باستخدام الفحص المجهري ونظام توصيل المنشطات أحادي الخلية (الشكل 1). كمكون من مكونات المصفوفة القمي، فإن الاندماج الغشائي و AE سيؤدي إلى فقدان مضان mCherry القابل للضوء وغير الحساس للأس الهيدروجيني من المنوية؛ حيث ينتشر هذا البروتين خارج حويصلة الجسيم القمي. في هذا الصدد ، فإن قدرة النموذج على عكس توقيت وحدوث AE تشبه فوائد خط الماوس GFP المستهدفللجسيم القمي 7،8،9.
يحتوي متغير GCaMP3 المستخدم في خط الماوس المعدل وراثيا هذا على دينار كويتي تقريبي يبلغ 400 ميكرومتر ونطاق ديناميكي ل Ca2+ من 10-4-10-3 M10 ، وهو مناسب لهذه الحويصلة. لقد أظهرنا أن هذا المزيج من ميزات GCaMP3 يمكن أن يكشف عن تكوين مسام الاندماج بين غشاء البلازما والغشاء الأكروسومي الخارجي (OAM) 2. إن اكتشاف مسام الاندماج هو نتيجة لكون حجم المسام صغيرا جدا بحيث لا يسمح لبروتين AcroSensE بالانتشار خارج الجسم القمي (عن طريق فقدان محتوى الجسيم القمي) مع توفير "قناة" غشائية تمكن من تدفق أيونات الكالسيوم2+ إلى تجويف الجسم القمي ، مما يؤدي إلى زيادة كثافة مضان GCaMP3.
يدعم البروتين الفلوري mCherry اللامع والأحادي وغير الحساس للكالسيوم تصور الجسيم القمي بينما تكون إشارة GCaMP3 باهتة (على سبيل المثال ، قبل ربط Ca2+ ، الشكل 2) ، والأهم من ذلك ، أنه يسمح أيضا بتحديد خلايا المنوية السليمة القمي المناسبة للتصوير.
يصف البروتوكول التالي استخدام نموذج الماوس AcroSensE الفريد وطرق الفحص المجهري المستخدمة تجريبيا لدراسة ديناميكيات الكالسيوم AE المنوية بدقة مكانية وزمانية عالية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية بموجب المبادئ التوجيهية ووافقت عليها لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في جامعة كورنيل (# 2002-0095). تم استخدام الفئران AcroSensE2 البالغة من العمر 8-10 أسابيع في الدراسة الحالية. يمكن تقديم طلبات الحصول على معلومات حول توافر الفئران AcroSensE إلى المؤلف المقابل.
1. جمع المنوية وغسلها
- جمع المنوية الذيلية البربخية (يتم توفير مزيد من التفاصيل حول هذا الإجراء في11) من الفئران AcroSensE. اترك 15 دقيقة في طبق زراعة الأنسجة 3.5 سم يحتوي على 0.5 مل من وسط ويتن المعدل (MW) عند 37 درجة مئوية. يجب تغطية الطبق لتقليل تبخر MW ، ويجب إمالته بحيث يكون للوسط عمق كاف لتغطية البربخ الذيلي.
ملاحظة: يحتوي وسط ويتن المعدل (MW) على 22 مللي متر HEPES ، 1.2 mM MgCl2 ، 100 mM NaCl ، 4.7 mM KCl ، 1 mM حمض البيروفيك ، 4.8 mM حمض اللاكتيك hemi-Ca2+ ملح ، درجة الحموضة 7.35. يتم استكمال الجلوكوز (5.5 mM) ، NaHCO3 (10 mM) ، و 2-hydroxypropyl--cyclodextrin (CD ؛ 3 mM) (انظر جدول المواد) حسب الحاجة لتحريض السعة ، ويمكن تعديل التركيزات لتجارب محددة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام مستقبلات ستيرول بديلة بدلا من CD (على سبيل المثال ، ألبومين مصل الأبقار أو البروتينات الدهنية عالية الكثافة). - باستخدام ملقط رفيع ، قم بإزالة أي نسيج بربخ من طبق جمع السباحة. انقل الوسط الذي يحتوي على المنوية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، وقم بطرد مركزي للتعليق عند 100 × جم لمدة 1 دقيقة في دوار دلو متأرجح في درجة حرارة الغرفة. باستخدام ماصة بلاستيكية ، قم بإزالة طافي MW الذي يحتوي على المنوية من أي حطام جسيم للأنسجة سيكون قد تم تكويره في هذه الخطوة.
- اجعل المادة الطافية MW التي تحتوي على المنوية إلى حجم إجمالي قدره 3 مل عن طريق إضافة MW عند 37 درجة مئوية. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 8 دقائق (في درجة حرارة الغرفة) في أنبوب مستدير القاع. قم بإزالة طافي MW ببطء من المنوية الحبيبية بشكل فضفاض.
- إذا كانت قابلة للحياة ، يجب أن تظهر المنوية على شكل حبيبات "رقيقة". أعد تعليق المنوية برفق عن طريق التثليج باستخدام ماصة نقل ذات تجويف كبير أو عن طريق صنابير يدوية لطيفة على الأنبوب ("تحريك الإصبع"). بمجرد إعادة تعليقها بالتساوي ، انقلها إلى أنبوب جديد مستدير القاع. استخدم 10-20 ميكرولتر من معلق المنوية لحساب وتقييم الحركة. تمييع المنوية في ميغاواط للاستخدام.
ملاحظة: بالنسبة لمعظم التجارب التي تنطوي على سعة المنوية للفئران ، يتم استخدام تركيز نهائي من 5-10 مليون منوي / مل ميغاواط. لا يتطلب بروتوكول التصوير الموصوف هنا سعة المنوية ، على الرغم من أنه من الضروري أن تكتسب المنوية القدرة على الخضوع للإخراج القمي ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية. يمكن للمرء أن يدرس الإخراج الخلوي المرضي أو الإخراج الخلوي الناجم عن الكواشف مثل أيونوفور الكالسيوم دون زيادة المنوية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للمرء استكشاف التغيرات المحتملة في الكالسيوم الأكروسومي في الخلايا غير السعوية استجابة للمحفزات المختلفة. - استخدم المنوية في غضون 3-5 ساعات من جمعها ، مع الحفاظ على الوقت قصيرا قدر الإمكان ومتسقا بين التجارب التجريبية.
- قم بتنفيذ جميع خطوات التجميع والغسيل عند 37 درجة مئوية باستخدام وسط MW ، باستخدام طرق لتقليل تلف الغشاء. يتضمن ذلك استخدام ماصات نقل بلاستيكية كبيرة التجويف أو أطراف ماصة ذات فتحة كبيرة ، والتي يوصى باستخدامها خلال جميع مراحل الإجراء.
2. بولي-D-ليسين طلاء من أطباق coverslip للتصوير
ملاحظة: يجب تحضير أطباق Poly-D-lysine (PDL) طازجة قبل كل تجربة.
- قم بتوزيع قطرة 0.5 ميكرولتر من PDL (0.5 مجم / مل ، انظر جدول المواد) في وسط طبق الغطاء.
- باستخدام طرف مدرج 10 ميكرولتر ، قم بتلطيخ قطرة PDL عبر غطاء الغطاء (نمط متقاطع كما هو موضح في الشكل 1B).
- اتركيه حتى يجف على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. احتفظ بالأطباق المطلية ب PDL مغطاة وعلى حرارة 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
3. سحب الشعيرات الدموية ، تحميل للنفخ
- اسحب الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات (OD ، 2 مم ، معرف ، 1.56 مم ، انظر جدول المواد) باستخدام الإعدادات على النحو التالي - الحرارة: 330 ، السحب: 250 ، السرعة: 250 ، والوقت: 70. يجب تحسين هذه الخطوة للمجتذب المحدد المستخدم.
- قبل كل تجربة ، قم بتحميل شعيرات دموية واحدة بمحلول محفز يحتوي على 3-5x تركيز المنشط (لحساب الانتشار السريع للمحلول عند النفخ). قبل التعبئة ، استخدم ملاقط دقيقة لفتح الطرف الشعري عند حوالي 1-2 مم من النهاية. يجب أن ينتج عن ذلك قطر فتح ∼5 ميكرومتر. تلميع الحرارة غير مطلوب.
- باستخدام ماصة نقل بلاستيكية رقيقة ، قم بحقن المحلول المحفز ببطء في الشعيرات الدموية حتى يمتلئ ثلاثة أرباع طوله.
- قم بإزالة أي فقاعات هواء تشكلت أثناء التعبئة عن طريق النقر اللطيف للشعيرات الدموية.
- جبل الشعرية المملوءة على المناور الدقيق (انظر جدول المواد).
4. إعداد تسليم التحفيز للنفخ
ملاحظة: لتقليل مخاطر إصابة المستخدم ، يجب ارتداء نظارات السلامة أثناء تشغيل إجراء النفخ.
- قم بإعداد إعدادات نظام التسليم أحادي الخلية لتوفير نبضة 10 ثوان عند 5 رطل / بوصة مربعة.
- قم بتوصيل الشعيرات الدموية البورسليكات بحامل ماصة نظام التوصيل أحادي الخلية. تأكد من إحكام السداد.
- أثناء مراقبة الطرف الشعري ، ضع نفخة قصيرة من 2 ثانية عند 20 رطل لكل بوصة مربعة للتأكد من أن المحلول يتم الاستغناء عنه بالفعل من خلال نهاية الطرف (يجب أن يكون قطرة صغيرة واضحة في نهاية الطرف).
5. الفحص المجهري والحصول على الصور
ملاحظة: تتوفر ماركات متعددة من المجاهر ويمكن استخدامها ؛ ومع ذلك ، فإن الحد الأدنى لمعدل الإطارات 3 إطارات / ثانية أمر مرغوب فيه. فيما يتعلق بدرجة الحرارة والتحكم البيئي ، يرجى ملاحظة أنه يجب تأكيد درجة الحرارة الفعلية للوسط في الطبق ، على سبيل المثال ، باستخدام مقياس حرارة بالأشعة تحت الحمراء غير متصل.
- أضف 80 ميكرولتر من المنوية المخففة إلى مركز طبق غطاء 35 مم مطلي بمادة بولي دي لايسين. بالنسبة لمعظم التجارب التي تنطوي على سعة المنوية للفأر ، يتم استخدام تركيز نهائي من 5-10 مليون منوي / مل.
- أضف ببطء إلى المنوية 3 مل من الوسائط الأساسية الدافئة (37 درجة مئوية) MW المكملة ب 10 mM CaCl2.
ملاحظة: يمكن للمرء إجراء تجارب في درجة حرارة الغرفة لإبطاء العمليات الخلوية ، ولكن من المهم ملاحظة أنه نظرا لأن السعة تتوسط في تبادل الدهون وسيولة المجالات الدقيقة والكلية ، يجب على المرء أن يضع في اعتباره أن السعة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية و exocytosis acrosome هي عمليات تعتمد على درجة الحرارة. - قم بتركيب الطبق مع المنوية على المجهر (مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية).
- قم بإثارة GCaMP3 باستخدام خط ليزر 488 نانومتر وعرض باستخدام مرشح تمرير النطاق 505-550 نانومتر (BP). قم بإثارة mCherry باستخدام خط ليزر 555 نانومتر وعرض باستخدام مرشح ضغط الدم 575-615 نانومتر.
- باستخدام micromanipulator (يوصى بإرفاق المناور بطاولة الهواء التي تم إعداد المجهر عليها.) ، ضع طرف الشعيرات الدموية حوالي 100 ميكرومتر على الجانب و 5-10 ميكرومتر فوق مستوى الخلية المعنية.
ملاحظة: تصنع المحاليل المحفزة عند 3-5 أضعاف التركيز الطبيعي للتعويض عن الانتشار السريع الذي يحدث في الحجم بين الشعيرات الدموية والخلية. - ابدأ تسلسل التصوير على المجهر.
- صور خلايا المنوية بمعدل إطارات مرتفع ، ويفضل أن يكون >10 إطارات / ثانية. هنا ، تم استخدام ماسح ضوئي رنين يتيح التصوير بسرعة 33 مللي ثانية / إطار.
- بعد عشر ثوان من بدء التقاط الصورة على المجهر ، قم بتنشيط نظام توصيل الخلية الواحدة لبدء نفخة المنشطات لمدة 10 ثوان.
- خلايا الصورة لمدة 10-15 دقيقة.
- باستخدام نظام التوصيل أحادي الخلية ، قم بتصوير خلايا متعددة من طبق واحد وفقا للمواقع الموضحة في الشكل 1B.
ملاحظة: يجب أن تظهر الحيوانات المنوية غير المعالجة / غير المحفزة تحت المجهر حمراء في الغالب ، مع كثافة منخفضة للإشارة الخضراء. يجب ربط رؤوس المنوية بغطاء الغطاء ، ويمكن التعرف على المنوية الحية من خلال ذيولها المتحركة. في المنوية التي تخضع ل AE ، ستزداد الإشارة الخضراء GCaMP3 في البداية ، وستختفي كل من إشارة mCherry الحمراء والإشارة الخضراء GCaMP3 إذا اكتملت AE ، كما هو موضح في الشكل 2. يوفر تقليل مضان mCherry مؤشرا أكثر تحديدا للوقت الذي يبدأ فيه AE لأن التغييرات في تركيزات Ca2+ ستؤدي باستمرار إلى تغييرات في شدة مضان GCaMP3.
6. تحليل الصور والبيانات
ملاحظة: يتم إجراء تحليل الصور دون اتصال باستخدام ImageJ (انظر جدول المواد). في السابق ، تم الإبلاغ عن العديد من الخطوات الوسيطة في العملية المؤدية إلى AE ، بما في ذلك ارتفاع الكالسيوم الأكروسومي (ACR) ، والاندماج الكامل للغشاء. هذا الأخير يؤدي إلى فقدان مضان mCherry وبالتالي يمثل AE الكامل. في بعض الخلايا ، لوحظت إشارات مشابهة لأحداث القدم قبل الارتفاع (PSF) عند استخدام الأساليب الأمبيرومترية في دراسات الإخراج الخلوي (لمزيد من التفاصيل ، يرجى الاطلاععلى 2). تتوفر العديد من الطرق الاختيارية لتحليل بيانات AcroSensE الأولية لتحديد ACR و AE وخطواتها الوسيطة. فيما يلي وصف لبعض الطرق التحليلية الأساسية.
- اعتمادا على امتداد ملف نظام المجهر المحدد ، استخدم أداة تقسيم القناة (Image > Colors > Split Channels) لإنشاء نوافذ فردية لقنوات GCaMP3 و mChere.
- قم بمزامنة النوافذ الفردية باستخدام أداة "مزامنة النافذة" (تحليل أدوات > > مزامنة Windows).
- حدد منطقة الاهتمام (ROI) حول رأس المنوي في القناة الحمراء لتشمل منطقة الجسم القمي (الشكل 3 أ ، ب). تسمح أداة المزامنة بتطبيق نفس تحديد المنطقة تلقائيا على القناة الخضراء ، حيث لا تزال المنوية خافتة جدا بحيث لا تكون مرئية.
- اختر المكون الإضافي "Z Profiler" (المكونات الإضافية > Stacks > Z Profiler) أو "محلل السلاسل الزمنية" (المكونات الإضافية > Stacks > Time Series Analyzer) لرسم التغيير في شدة التألق كدالة للإطارات / الوقت لكل من القناتين.
- انسخ البيانات إلى برنامج جدول بيانات (على سبيل المثال ، Microsoft Excel) للتخطيط والمزيد من التحليل.
ملاحظة: بمجرد نسخ البيانات إلى جدول بيانات ، يمكن استخراج معلمات متعددة للتحليل ، بما في ذلك ما يلي ، كما هو موضح في الشكل 4.- وقت بدء Fusion Pore (FP): قم بقياس الوقت من النقطة الزمنية 0 إلى النقطة الزمنية التي تبدأ فيها إشارة GCaMP3 في الارتفاع. تشير هذه المعلمة إلى التأخير بين التحفيز واستجابة المنوية ACR.
- وقت بدء AE: قم بقياس الوقت من النقطة الزمنية 0 إلى النقطة الزمنية التي تبدأ فيها إشارة mCherry في الاضمحلال. تشير هذه المعلمة إلى التأخير بين التحفيز واستجابة المنوية AE. يمكن أيضا استخدام هذه المعلمة لحساب التأخير بين تكوين FP واستجابة AE.
- سعة ذروة FP: قم بقياس إشارة التألق من القاعدة إلى ذروة ارتفاع إشارة GCaMP3. تشير هذه المعلمة إلى الزيادة الإجمالية في استجابة ACR.
- معدل فقدان mCherry: حدد هذه المعلمة من خلال ملاءمة خطية أو أسية على قسم فقدان إشارة mCherry (كما هو موضح ب "المنحدر" في الشكل 4B).
ملاحظة: بدلا من ذلك، حدد معدل الاضمحلال بطريقة الإشارة المتبقية (R) في نقاط زمنية مختلفة (على سبيل المثال، R60: المدة الزمنية بالثواني إلى إشارة متبقية بنسبة 60٪ من خط الأساس لإشارة mCher). يمكن استخدام هذه المعلمة لتحديد المعدل الذي يتم به تشتيت المحتوى القمي على AE. - انخفاض الإشارة لفقدان mChere: حدد الفرق في السعة بين شدة مضان mCherry الأساسية والإشارة التي تتبع AE. تشير هذه المعلمة إلى إجمالي كمية المحتوى الأكروسومي المشتت على AE.
- ارسم التغييرات في التألق (F) لكل من القنوات الحمراء والخضراء كبيانات أولية ، أو قم بتطبيعها بواسطة التألق الأولي (F0) والتعبير عنها ك ΔF / F0. يوفر الأخير تصورا أفضل للتغيرات في كل من الأحمر والأخضر على قطعة أرض واحدة (على سبيل المثال ، انظر الشكل 3D والشكل 3H).
ملاحظة: أخيرا ، يمكن مقارنة المعلمات المقاسة المختلفة بين الظروف المختلفة لتحديد العلاقة بين التغيرات في تركيز الكالسيوم الأكروسومي و AE. للحصول على أمثلة لمقارنات الحالة التجريبية المختلفة ، انظر المرجع2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يقدم الشكل 2 توضيحا مبسطا يوضح تتابع التغيرات الفلورية المتوقعة بعد التحفيز الناجح للحيوانات المنوية. توضح اللوحة العلوية من الشكل 2 التغيرات في شدة مضان GCaMP3 ، حيث تكون الإشارة خافتة في البداية (تركيزات الكالسيوم الأكروسومية الأساسية أقل من GCaMP3 KD) ، وعند دخول أيونات الكالسيوم عبر مسام الاندماج ، يزداد التألق في السطوع. أخيرا ، عند AE ، هناك فقدان للإشارة بسبب الانتشار وفقدان المستشعر إلى الفضاء خارج الخلية. توضح اللوحة السفلية من الشكل 2 التغيرات في شدة مضان mCherry ، حيث تكون الإشارة الأولية ساطعة ، وفقط عند AE وانتشار المستشعر جنبا إلى جنب مع المحتويات الأخرى للمصفوفة القمصية ، هناك تعتيم للإشارة الحمراء.
يقدم الشكل 3 بيانات فعلية مقاسة للمراحل الموضحة أعلاه في اثنين من المنوية الحية المحفزة ب 125 ميكرومتر من الجانجليوسيد GM1 (لمزيد من التفاصيل حول كيفية تنظيم GM1 AE في المنوية12) ، تم التقاطها في مجال رؤية واحد. يوضح الشكل 3A و B والشكل 3E و F الإشارات الحمراء والخضراء المقاسة في حيوانين منويين عند النقطة الزمنية 0 (قبل التحفيز) ، حيث تكون إشارة mCherry ساطعة في البداية ، ويكون GCaMP3 خافتا. يوفر الشكل 3C والشكل 3G والشكل 3D والشكل 3H تحليل Z Profiler طوال مدة التجربة (البيانات الأولية أو F / F0، على التوالي). توفر لوحات الإدراج عرضا مكبرا للنافذة الزمنية حيث يحدث ACR و AE.
نظرا لأن المنوية غير متجانسة للغاية وحساسة للغاية لتلف الغشاء بسبب إجراءات المناولة المختلفة ، يقدم الشكل 5 أمثلة على نوعين من النتائج السلبية. يوضح الشكل 5A ، C العديد من المنوية التي تم التقاطها في مجال رؤية واحد. يسلط المخطط الأصفر الضوء على خليتين منويتين تظهران إشارة GCaMP3 عالية عند النقطة الزمنية 0 (قبل التحفيز). في التجارب الحالية ، تم تجنب مثل هذه الخلايا ، لأنها تشير إلى أن الحويصلة القميوية تمر بالفعل ببعض عمليات الاندماج الغشائي أو أنها تعرضت لبعض الأضرار الغشائية التي تسمح للكالسيوم بالتسرب. يوضح المنوي في الشكل 5A المشار إليه بالسهم (دائرة ROI في الشكل 5A ، C) إشارة mCherry الأولية ولكن لا توجد استجابة في القنوات الحمراء أو الخضراء (الشكل 5B ، D ، على التوالي ، يوضح نافذة تحليل Z-Profiler كما هو موضح في ImageJ) بعد التحفيز باستخدام 125 ميكرومتر GM1. على الرغم من أن مجموعة فرعية من المنوية ، مثل تلك المذكورة في هذا المثال ، لا تظهر أي استجابة للتحفيز ، إلا أنها مدرجة في التحليل النهائي ويتم حسابها في تحليل بيانات الاستجابة المئوية2 (الشكل 3).
الشكل 1: الأجهزة والإعداد التجريبي. أ: المنوية الحية على طبق غطاء مغطى بمادة البولي فينيل هيدروكسي الصوديوم يوضع في حجرة حضانة عند 37 درجة مئوية. يتم وضع الشعيرات الدموية البورسليكات ، المسحوبة والمتصلة بنظام توصيل خلية واحدة ، بالقرب من خلية المنوية في وسط منطقة التصوير للتوصيل المباشر للمنشطات. تتم مراقبة كل من القنوات الخضراء (GCaMP3) والحمراء (mCherry) وتسجيلها باستمرار بمعدل إطارات مرتفع (على سبيل المثال ، 10 إطارات / ثانية) أثناء التحفيز. (ب) تمثيل تخطيطي لنمط ترسيب PDL على طبق شريحة الغلاف. ج: تمثيل تخطيطي للمناطق المحددة في الطبق التي يمكن تحفيز المنوية فيها باستخدام الشعيرات الدموية لتقليل التحفيز غير المتخصص من النفخات السابقة في الطبق نفسه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التغيرات في إشارة التألق وشدته. اللوحة العلوية: تشير الزيادة في إشارة GCaMP3 إلى تدفق الكالسيوم إلى الجسم القمي ، يليه فقدان الإشارة بسبب انتشار بروتين اندماج AcroSensE. اللوحة السفلية: تظل إشارة mCherry مستقرة أثناء اندماج الغشاء الأولي ، مع التعتيم اللاحق عند انتشار AcroSensE والإخراج الخلوي القمي (AE). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: البيانات التمثيلية وآثار التألق. تم تصوير حقل يحتوي على حيوانين منويين. تم قياس مضان القناة الخضراء / الحمراء في وضع عدم الاتصال باستخدام ImageJ ورسمه في Excel (كما هو موضح في الخطوة 6). (أ-د) القياس الكمي لشدة مضان القناة الحمراء (A) والخضراء (B) للخلية #1 بمرور الوقت ، محسوبة لعائد الاستثمار المحدد ، ثم يتم تقديمها كبيانات أولية (C) أو تطبيعها للإشارة الأولية (D ، F / F0). يوفر الإدراج في (D) عرضا مكبرا للإطار الزمني من 25-125 ثانية. (E-H) القياس الكمي لشدة مضان القناة الحمراء (E) والخضراء (F) للخلية #2 بمرور الوقت ، محسوبة لعائد الاستثمار المحدد ، ثم يتم تقديمها كبيانات أولية (G) أو تطبيعها للإشارة الأولية (H ، F / F0). يوفر الإدراج في (H) عرضا مكبرا للإطار الزمني من 25 إلى 125 ثانية. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. تمثل جميع المحاور x الوقت بالثواني (الثواني). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل البيانات ومعلمات القياس الكمي. (أ) رسم توضيحي لتتبع شدة مضان GCaMP3 نموذجي ، يعرض معلمات قابلة للقياس الكمي ، بما في ذلك وقت البدء (بالثواني) ، والسعة (شدة التألق) ، والمدة (بالثواني). (ب) رسم توضيحي لتتبع شدة مضان mCherry نموذجي ، يعرض معلمات قابلة للقياس الكمي ، بما في ذلك وقت البدء (بالثواني) ، والمدة (بالثواني) ، والمنحدر (F / s) ، و R60 (شدة التألق) ، والسعة (شدة التألق). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: النتائج السلبية. (A,C) قنوات mCherry (حمراء) وGCaMP3 (خضراء) تظهر خلايا منوية متعددة تم التقاطها في مجال رؤية واحد. يشير السهم الموجود في (A) إلى خلية منوية تظهر في البداية مضان mCherry ولكن لا توجد تغيرات لاحقة في شدة التألق استجابة لتحفيز 125 μM GM1 ، كما لوحظ في آثار Z-Profiler المتولدة الواردة في (B) (mCherry) و (D) (GCaMP3). تظهر الخلايا داخل المستطيل الأصفر شدة مضان GCaMP3 مرتفعة عند النقطة الزمنية 0 ، قبل التحفيز. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا ، يتم وصف طريقة قائمة على الفحص المجهري لاستخدام نموذج الماوس AcroSensE الذي تم إنشاؤه حديثا للمراقبة في الوقت الفعلي أحادي الخلية وتحليل التفاعل بين ديناميكيات الكالسيوم الأكروسومية والخطوات الوسيطة المؤدية إلى AE. جنبا إلى جنب مع الأساليب الجينية المتاحة بسهولة ، مثل التهجين مع النماذج الجينية الأخرى للفأر أو تحرير الجينات ، يوفر هذا النموذج والطريقة نظاما قويا لدراسة دور المكونات والمسارات المختلفة التي تشارك في مسارات إشارات المنوية المتعلقة بالسعة ، AE ، والإخصاب.
خطوات حاسمة
من المهم في جميع خطوات التعامل مع المنوية استخدام ماصات نقل بلاستيكية كبيرة التجويف أو أطراف ماصة ذات فتحة كبيرة وتنفيذ جميع خطوات التجميع والغسيل عند 37 درجة مئوية لتقليل تلف الغشاء. وبالمثل ، يفضل دوار الجرافة المتأرجحة على الدوار ذي الزاوية الثابتة لتجنب تلف الغشاء بسبب تفاعل الخلايا مع الجدار الجانبي لأنبوب الطرد المركزي الدقيق. في حالة توفر تصحيح انحراف موضع Z ، يوصى بشدة بتطبيق أجهزة / برامج تصحيح موضع z لتجنب انجراف المنوية المصورة خارج المستوى البؤري أثناء فترة التصوير.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
تم تحسين البروتوكول الموصوف هنا لدراسات الإشارات بوساطة الدهون 2,3 ويمكن تطبيقه على كل من المنوية السعوية وغير السعة. يمكن استخدام طرق مختلفة لسعة المنوية. على سبيل المثال ، يمكن أن يكون الألبومين أو السيكلوديكسترين بمثابة مستقبلات ستيرول. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إضافة أو حذف ركائز الطاقة المختلفة أو البيكربونات. ومع ذلك ، لاحظ أن البيكربونات ستتشكل في وسط مائي من التعرض للهواء ، لذا فإن اختبار الظروف "الخالية من البيكربونات" حقا يتطلب استخداما دقيقا لبيئة النيتروجين في جميع خطوات صنع / تحضير / التعامل مع الوسط وإجراء التجربة. يتضمن البروتوكول أعلاه استخدام 10 مللي مول من الكالسيوم المضاف إلى المحلول التجريبي ؛ ومع ذلك ، يمكن حذف أيونات الكالسيوم أو مخلبها (على سبيل المثال ، EGTA) ، أو إضافتها بتركيزات أقل للتطبيقات التجريبية الحساسة للكالسيوم. يرجى ملاحظة أن خفض أو حذف تركيزات الكالسيوم سيقلل من إشارة GCaMP3 المتوقعة عند AE2. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للمرء استخدام وسائط أخرى لهذا البروتوكول (مقابل MW المستخدمة هنا) التي تناسب بشكل أفضل تصميمها وأهدافها التجريبية. يصف البروتوكول المقدم استخدام التصوير أحادي الخلية وتوصيل المنشطات بخلية واحدة. ومع ذلك ، يمكن تحقيق تباين مبسط عن طريق التحفيز السائب ، مثل إضافة الكاشف المحفز إلى الطبق بأكمله وليس عن طريق النفخ. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا إجراء تجارب على السكان بالكامل باستخدام نموذج AcroSensE عبر استخدام مقاييس الفلور أو قارئات الألواح ذات القدرة الفلورية.
القيود
تتطلب الطريقة المتوفرة هنا توفر مستعمرة ماوس AcroSensE وصيانتها واستخدامها. تعتمد الطريقة أيضا على توفر نظام تصوير متقدم ، وهو أمر مكلف ويتطلب موظفين مدربين. بالنسبة لبعض التطبيقات التجريبية ، يتعلق أحد القيود المحتملة بعدم القدرة على قياس الكالسيوم الخلوي في المنوية AcroSensE بشكل متزامن ، حيث أن العديد من مؤشرات الكالسيوم الاصطناعية المتاحة ذات طول موجي مماثل ل GCaMP3. على الرغم من أنه خارج نطاق هذا البروتوكول ، إلا أن القيود المحتملة للتجارب على مستوى السكان قد تشمل قراءة إشارة mCherry بعد AE والتشتت في إشارة الوسط أو GCaMP3 القادمة من الخلايا الميتة / النفاذية. لتحسين هذه الأساليب ، يمكن للمرء استكشاف استخدام التركيز z لتقليل ضوضاء الخلفية من mCherry المفرز ، و / أو استخدام عناصر التحكم المعالجة بالوهمية لضمان القياس الكمي الأساسي GCaMP من المنوية الميتة أو المتخللة.
أهمية الطريقة فيما يتعلق بالطرق الحالية / البديلة
على مدى العقدين الماضيين ، كانت هناك تقارير عن عدة طرق للدراسات في الوقت الفعلي لديناميكيات AE في المنوية الحية ، بما في ذلك الفئران المعدلة وراثيا GFP المستهدفةبالجسم القمي 7 ، وأصباغ الكالسيوم المحملة في الجسم القمي (على سبيل المثال ، Fluo-412) ، أو باستخدام مؤشرات خاصة بالإخراج الخلوي مثل الصبغة الاصطناعية FM-6413. ومع ذلك ، بالمقارنة مع هذه الطرق ، يوفر نموذج AcroSensE الراحة في استخدام المنوية المعالجة بالحد الأدنى والتي لا تتطلب أي تحميل للصبغة أو غيرها من الإجراءات التي يحتمل أن تكون مضطربة للغشاء. الأهم من ذلك ، هناك ميزة كبيرة لوجود المنوية التي تعبر عن مؤشر مزدوج يمكنه مراقبة ديناميكيات الكالسيوم الأكروسومية ، واندماج الغشاء ، وتكوين المسام ، بالإضافة إلى AE وما يترتب على ذلك من إطلاق المحتوى القمي.
الأهمية والتطبيقات المحتملة للطريقة في مجالات بحثية محددة
لاحظ أن أمثلة التطبيق التجريبي أدناه يمكن إجراؤها كمقايسات أحادية الخلية أو سكانية ، مع تمتع الأخير بمزايا كبيرة عند الرغبة في التحليل عالي الإنتاجية. يمكن إجراء دراسات لديناميات AE في نماذج الفئران المختلفة عن طريق التهجين باستخدام نموذج الماوس AcroSensE ، بما في ذلك (1) الأشكال الفارغة أو الطافرة لقنوات الكالسيوم المختلفة أو الوحدات الفرعية لقنوات الكالسيوم (على سبيل المثال ، العبور باستخدام نماذج α1E- و CatSper-null) ؛ (2) أشكال فارغة أو متحورة من البروتينات التي تتوسط اندماج الغشاء (على سبيل المثال ، SNAREs). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء دراسات للتحقيق في كيفية قيام العوامل الدوائية المختلفة المرتبطة بمسارات الإشارات المختلفة بتعديل ديناميكيات الكالسيوم الأكروسومي وديناميكيات AE. علاوة على ذلك ، يمكن إجراء بحث حول كيفية تأثير التغيرات البيئية على AE ، بما في ذلك درجة الحرارة ودرجة الحموضة ووجود أو تركيز أيونات مختلفة أو جزيئات صغيرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا يوجد لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإبلاغ عن هذا العمل.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R01-HD093827 و R03-HD090304 (A.J.T).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
References
- Austin, C. R. Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg. Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).
- Cohen, R., et al. A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis. J Biol Chem. 298 (5), 101868 (2022).
- Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J.
- Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm. J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).
- Sosa, C. M., et al. Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis). Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).
- Balestrini, P. A., et al. Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time. Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).
- Nakanishi, T., et al. Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein. FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).
- Kim, K. S., Gerton, G. L. Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm. Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).
- Hasuwa, H., et al. Transgenic mouse sperm that have green acrosome and red mitochondria allow visualization of sperm and their acrosome reaction in vivo. Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science. 59 (1), 105-107 (2010).
- Henderson, M. J., et al. A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store. PloS one. 10 (10), 0139273 (2015).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. J Biol Chem. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Cohen, R., et al. Lipid modulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis and fertilization. Dev Cell. 28 (3), 310-321 (2014).
- Sanchez-Cardenas, C., et al. Acrosome reaction and Ca(2)(+) imaging in single human spermatozoa: new regulatory roles of [Ca(2)(+)]i. Biol Reprod. 91 (2), 67 (2014).
