Summary
Мышиная модель AcroSensE и описанные здесь методы визуализации живых клеток обеспечивают новый подход к изучению динамики кальция в субклеточном компартменте акросомы сперматозоида и того, как они регулируют промежуточные этапы, ведущие к слиянию мембран и экзоцитозу акросом.
Abstract
Экзоцитоз акросом (АЭ), при котором единственный экзоцитотический везикул сперматозоида сливается с плазматической мембраной, является сложным, кальций-зависимым процессом, необходимым для оплодотворения. Тем не менее, наше понимание того, как кальциевая сигнализация регулирует АЭ, все еще не завершено. В частности, взаимосвязь между внутриакросомальной динамикой кальция и промежуточными стадиями, ведущими к НЯ, четко не определена. Здесь мы описываем метод, который дает пространственное и временное представление о акросомальной динамике кальция и ее связи со слиянием мембран и последующим экзоцитозом акросомного везикулы. В методе используется новая трансгенная мышь, экспрессирующая сенсор экзоцитоза, нацеленный на акросомы (AcroSensE). Датчик сочетает в себе генетически кодируемый кальциевый индикатор (GCaMP), смешанный с mCherry. Этот гибридный белок был специально разработан для одновременного наблюдения за акросомальной динамикой кальция и событиями слияния мембран. Мониторинг акросомальной динамики кальция и АЭ в живых сперматозоидах AcroSensE в режиме реального времени достигается с помощью комбинации визуализации с высокой частотой кадров и системы доставки стимулятора, которая может быть нацелена на один сперматозоид. Этот протокол также содержит несколько примеров основных методов количественной оценки и анализа необработанных данных. Поскольку модель AcroSensE является генетически закодированной, ее научная значимость может быть увеличена за счет использования легкодоступных генетических инструментов, таких как скрещивание с другими генетическими моделями мышей или методы, основанные на редактировании генов (CRISPR). С помощью этой стратегии можно решить роль дополнительных сигнальных путей в капажировании и оплодотворении сперматозоидов. Таким образом, описанный здесь метод представляет собой удобный и эффективный инструмент для изучения динамики кальция в специфическом субклеточном компартменте – акросоме сперматозоида – и того, как эта динамика регулирует промежуточные этапы, ведущие к слиянию мембран и экзоцитозу акросом.
Introduction
Сперматозоиды приобретают способность к оплодотворению во время процесса, называемого капациацией1. Одной из конечных точек этого процесса является то, что сперматозоиды приобретают способность подвергаться НЯ. Данные, собранные за два десятилетия, подтверждают наличие сложной, многоступенчатой модели НЯ в сперматозоидах млекопитающих (обобщенная в 2,3). Однако изучение НЯ в живых сперматозоидах является сложной задачей, а имеющиеся в настоящее время методы мониторинга этого процесса с адекватным разрешением громоздки и требуют нескольких подготовительных этапов4, ограничиваются выявлением конечной стадии АЭ (например, с помощью ПНА5), ограничиваются измерениями изменений цитозольного кальция (в отличие от акросомальной динамики кальция), или ограничиваются измерениями цитозольной динамики кальция или АЭ6.
Чтобы преодолеть некоторые из ключевых ограничений исследований АЭ в реальном времени в физиологических условиях и исследовать взаимодействие между динамикой кальция и АЭ, была создана уникальная модель мышей. В этой мышиной модели гибридный белок, состоящий из генетически кодируемого сенсора Ca2+ (GCaMP3) и mCherry, экспрессируется и нацелен на акросому с помощью промотора акрозина и сигнального пептида2. Прицельный двойной датчик GCaMP3-mCherry позволяет в режиме реального времени одновременно измерять концентрацию кальция и состояние акросомального содержимого в живых сперматозоидах в физиологических условиях с помощью микроскопии и одноклеточной системы доставки стимулятора (рис. 1). Как компонент акросомального матрикса, слияние мембран и АЭ приводят к потере фотостабильной и pH-нечувствительной флуоресценции mCherry из сперматозоидов, поскольку этот белок диффундирует из везикулы акросомы. В этом отношении способность модели отражать время и возникновение АЭ сродни преимуществам акросомно-ориентированной линии GFP 7,8,9.
Вариант GCaMP3, используемый в этой линейке трансгенных мышей, имеет приблизительный KD 400 мкМ и динамический диапазон для Ca2+ 10-4-10-3 M10, что подходит для этого везикулы. Мы показали, что эта комбинация признаков GCaMP3 может выявить образование пор слияния между плазматической мембраной и наружной акросомальной мембраной (ОАМ)2. Обнаружение слияния пор является результатом того, что размер пор слишком мал, чтобы позволить белку AcroSensE диспергироваться из акросомы (за счет потери содержимого акросомы), обеспечивая при этом мембранный «канал», который обеспечивает приток ионов Ca2+ в просвет акросомы, что приводит к увеличению интенсивности флуоресценции GCaMP3.
Яркий, мономерный, не чувствительный к кальцию флуоресцентный белок mCherry поддерживает визуализацию акросомы при слабом сигнале GCaMP3 (например, до связыванияCa2+ , рис. 2), и, что важно, он также позволяет идентифицировать акросомные интактные сперматозоиды, пригодные для визуализации.
В следующем протоколе описывается использование уникальной модели мыши AcroSensE и методов микроскопии, используемых экспериментально для изучения динамики НЯ и кальция сперматозоидов с высоким пространственным и временным разрешением.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры на животных были выполнены в соответствии с рекомендациями и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Корнелльском университете (#2002-0095). Для настоящего исследования были использованы мыши AcroSensE2 в возрасте 8-10 недель. Запросы на получение информации о наличии мышей AcroSensE могут быть отправлены соответствующему автору.
1. Сбор и промывка спермы
- Соберите сперматозоиды придатка яичка хвоста (подробнее об этой процедуре приведены в11) у мышей AcroSensE. Выплавайте в течение 15 минут в чашке для культуры тканей диаметром 3,5 см, содержащей 0,5 мл модифицированной среды Уиттена (MW) при температуре 37 °C. Чашка должна быть накрыта, чтобы уменьшить испарение МВ, и должна быть наклонена так, чтобы среда имела достаточную глубину для покрытия придатков хвоста.
ПРИМЕЧАНИЕ: Модифицированная среда Уиттена (MW) включает 22 мМ HEPES, 1,2 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 1 мМ пировиноградной кислоты, 4,8 мМ молочной кислоты геми-Ca2+ соли, pH 7,35. Глюкоза (5,5 мМ), NaHCO3 (10 мМ) и 2-гидроксипропил-циклодекстрин (CD; 3 мМ) добавляются (см. таблицу материалов) по мере необходимости для индукции капацитации, а концентрации могут быть изменены для конкретных экспериментов. Кроме того, вместо CD можно использовать альтернативные акцепторы стеринов (например, бычий сывороточный альбумин или липопротеины высокой плотности). - С помощью тонких щипцов удалите ткань придатка яичка из выплывающей чашки. Переложите среду, содержащую сперму, в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте суспензию при 100 x g в течение 1 мин в роторе с качающимся ведром при комнатной температуре. С помощью пластиковой пипетки удалите надосадочную жидкость MW, содержащую сперматозоиды, от любого крупного тканевого мусора, который будет гранулирован на этом этапе.
- Довести СВ-надосадочную жидкость, содержащую сперматозоиды, до общего объема 3 мл, добавив МВт при 37 °C. Центрифуга при 400 x g в течение 8 мин (при комнатной температуре) в пробирке с круглым дном. Медленно удалите надосадочную жидкость MW из рыхло гранулированного сперматозоида.
- Если сперматозоиды жизнеспособны, они должны выглядеть как «пушистые» гранулы. Осторожно ресуспендируйте сперматозоиды с помощью пипетки для переноса с большим отверстием или с помощью осторожных ручных постукиваний по трубке («щелканье пальцем»). После равномерного ресуспендирования переложите их в новую трубку с круглым дном. Используйте 10-20 мкл суспензии сперматозоидов для подсчета и оценки подвижности. Разведите сперматозоиды в MW для использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для большинства экспериментов, связанных с капацитацией сперматозоидов мышей, используется конечная концентрация 5-10 миллионов сперматозоидов/мл МВт. Описанный здесь протокол визуализации не требует капацитации сперматозоидов, хотя это необходимо для того, чтобы сперматозоиды приобрели способность подвергаться физиологически значимому экзоцитозу акросом. Можно изучать патологический экзоцитоз или экзоцитоз, индуцированный с помощью реагентов, таких как ионофор кальция, без капацитации сперматозоидов. Кроме того, можно исследовать потенциальные изменения акросомального кальция в некапабельных клетках в ответ на различные стимулы. - Используйте сперму в течение 3-5 часов после забора, чтобы время было как можно короче и соответствовало экспериментальным испытаниям.
- Выполняйте все этапы сбора и промывки при 37 °C с использованием СВЧ-среды, используя методы, позволяющие свести к минимуму повреждение мембраны. Это включает в себя использование пластиковых трансферных пипеток большого диаметра или наконечников для пипеток с большим отверстием, которые рекомендуется использовать на всех этапах процедуры.
2. Поли-D-лизиновое покрытие покровных стаканов для визуализации
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед каждым экспериментом блюда с поли-D-лизином (PDL) следует готовить свежими.
- Дозируйте 0,5 мкл капли PDL (0,5 мг/мл, см. Таблицу материалов) в центр покровной чашки.
- С помощью градуированного наконечника объемом 10 мкл нанесите каплю PDL на покровное стекло (крест-накрест, как показано на рисунке 1B).
- Дайте высохнуть при температуре 37 °C в течение 10 минут. Храните посуду с покрытием PDL накрытой и при температуре 37 °C до использования.
3. Капиллярное вытягивание, загрузка для затяжки
- Потяните капилляры боросиликатного стекла (наружный диаметр, 2 мм, внутренний диаметр, 1,56 мм, см. Таблицу материалов), используя следующие настройки: Нагрев: 330, Тяга: 250, Скорость: 250 и Время: 70. Этот шаг должен быть оптимизирован для конкретного используемого съемника.
- Перед каждым экспериментом нагружайте один капилляр стимулирующим раствором, содержащим в 3-5 раз большую концентрацию стимулятора (чтобы учесть быструю диффузию раствора при затяжке). Перед наполнением тонким пинцетом разломите кончик капилляра примерно в 1-2 мм от конца. В результате должен получиться диаметр отверстия ∼5 мкм. Термическая полировка не требуется.
- С помощью тонкой пластиковой трансферной пипетки медленно вводите стимулирующий раствор в капилляр до тех пор, пока не будет заполнено три четверти его длины.
- Удалите все пузырьки воздуха, образовавшиеся во время наполнения, легким щелчком капилляра.
- Установите заполненный капилляр на микроманипулятор (см. таблицу материалов).
4. Подготовка подачи стимуляции к затяжке
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму риск получения травмы пользователем, во время процедуры надувания следует надевать защитные очки.
- Настройте параметры системы доставки одной ячейки так, чтобы она обеспечивала импульс длительностью 10 с при давлении 5 фунтов на квадратный дюйм.
- Подсоедините боросиликатный капилляр к держателю дозатора одноклеточной системы доставки. Убедитесь, что уплотнения плотно прилегают.
- Наблюдая за кончиком капилляра, сделайте короткую затяжку продолжительностью 2 с под давлением 20 фунтов на квадратный дюйм, чтобы убедиться, что раствор действительно дозируется через конец наконечника (небольшая капля должна быть заметна на конце наконечника).
5. Микроскопия и получение изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Микроскопы различных марок доступны и могут использоваться; Тем не менее, желательна минимальная частота кадров 3 кадра в секунду. Что касается контроля температуры и окружающей среды, обратите внимание, что фактическая температура среды в тарелке должна быть подтверждена, например, с помощью бесконтактного инфракрасного термометра.
- Добавьте 80 мкл разбавленной спермы в центр 35-миллиметровой покровной чашки, покрытой поли-D-лизином. Для большинства экспериментов, связанных с капацитацией сперматозоидов мышей, используется конечная концентрация 5-10 миллионов сперматозоидов/мл.
- Медленно добавьте к сперматозоиду 3 мл теплой (37 °C) МВ-среды с добавлением 10 мМ CaCl2.
Примечание: Можно проводить эксперименты при комнатной температуре, чтобы замедлить клеточные процессы, но важно отметить, что, поскольку капацитация опосредована липидным обменом и текучестью микро- и макродоменов, следует иметь в виду, что физиологически значимая капативность и экзоцитоз акросом являются температурно-зависимыми процессами. - Установите чашку со спермой на микроскоп (предварительно нагретый до 37 °C).
- Возбуждайте GCaMP3 с помощью лазерной линии с длиной волны 488 нм и просматривайте с помощью полосового фильтра 505-550 нм. Возбудите mCherry с помощью лазерной линии 555 нм и просматривайте с помощью фильтра BP 575-615 нм.
- С помощью микроманипулятора (рекомендуется прикрепить манипулятор к воздушному столу, на котором установлен микроскоп) расположите кончик капилляра примерно на 100 мкм сбоку и на 5-10 мкм выше плоскости интересующей ячейки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стимулирующие растворы производятся в 3-5 раз выше нормальной концентрации, чтобы компенсировать быструю диффузию, происходящую в объеме между капилляром и клеткой. - Запустите последовательность визуализации на микроскопе.
- Изображение сперматозоидов с высокой частотой кадров, предпочтительно >10 кадров/с. Здесь был использован резонансный сканер, который позволяет получать изображения с частотой 33 мс/кадр.
- Через десять секунд после начала получения изображения на микроскопе активируйте систему доставки одной клетки, чтобы инициировать 10-секундную затяжку стимулятора.
- Изображение ячеек в течение 10-15 мин.
- Используя одноклеточную систему доставки, визуализируйте несколько ячеек из одной чашки в соответствии с местоположениями, указанными на рисунке 1B.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необработанные/нестимулированные сперматозоиды под микроскопом должны выглядеть в основном красными, с низкой интенсивностью зеленого сигнала. Головки сперматозоидов должны быть прикреплены к покровному стекле, а живые сперматозоиды могут быть идентифицированы по их движущимся хвостам. В сперматозоидах, которые подвергаются АЭ, зеленый сигнал GCaMP3 сначала будет увеличиваться, и как вишнево-красный сигнал, так и зеленый сигнал GCaMP3 исчезнут, если АЭ завершена, как показано на рисунке 2. Снижение флуоресценции mCherry обеспечивает более точный индикатор времени начала АЭ, поскольку изменения в концентрациях Ca2+ будут постоянно вызывать изменения интенсивности флуоресценции GCaMP3.
6. Анализ изображений и данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Автономный анализ изображений проводится с помощью ImageJ (см. Таблицу материалов). Ранее сообщалось о нескольких промежуточных стадиях процесса, ведущего к НЯ, включая акросомальное повышение кальция (ACR) и полное слияние мембран. Последнее приводит к потере флуоресценции mCherry и, следовательно, представляет собой полную АЭ. В некоторых клетках при использовании амперометрических подходов в исследованиях экзоцитоза наблюдаются сигналы, сходные с предспайковыми событиями (PSF) (подробнее см.2). Существует несколько дополнительных методов анализа необработанных данных AcroSensE для количественной оценки ACR, AE и их промежуточных этапов. Ниже описаны некоторые из основных аналитических методов.
- В зависимости от конкретного расширения системного файла микроскопа, используйте инструмент разделения каналов (Image > Colors > Split Channels) для создания отдельных окон для каналов GCaMP3 и mCherry.
- Синхронизируйте отдельные окна с помощью инструмента «Синхронизировать окно» («Анализ > инструментов» > «Синхронизация окон»).
- Выберите область интереса (ROI) вокруг головки сперматозоида в красном канале, чтобы включить область акросомы (рис. 3A, B). Инструмент синхронизации позволяет автоматически применить тот же выбор области к зеленому каналу, в котором сперматозоиды еще слишком тусклые, чтобы их можно было увидеть.
- Выберите плагин "Z Profiler" (Плагины > стеки > Z Profiler) или "Анализатор временных рядов" (Плагины > стеки > Анализатор временных рядов), чтобы построить график изменения интенсивности флуоресценции в зависимости от кадров/времени для каждого из двух каналов.
- Копирование данных в программное обеспечение для работы с электронными таблицами (например, Microsoft Excel) для построения графиков и дальнейшего анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как данные скопированы в электронную таблицу, можно извлечь несколько параметров для анализа, включая следующие, как показано на рисунке 4.- Время начала сварки пор (FP): измеряет время от точки 0 до точки времени, когда сигнал GCaMP3 начинает нарастать. Этот параметр указывает на задержку между стимуляцией и ответом ACR сперматозоида.
- Время начала AE: измеряет время от точки времени 0 до точки времени, когда сигнал mCherry начинает затухать. Этот параметр указывает на задержку между стимуляцией и ответом АЭ сперматозоидов. Этот параметр также может быть использован для расчета задержки между формированием ФП и откликом АЭ.
- Пиковая амплитуда FP: измерение сигнала флуоресценции от основания до пика нарастания сигнала GCaMP3. Этот параметр указывает на общее увеличение отклика ACR.
- Скорость потерь mCherry: определите этот параметр линейной или экспоненциальной аппроксимацией на участке потерь сигнала mCherry (как указано словом «наклон» на рисунке 4B).
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно определить скорость затухания методом остаточного (R) сигнала в различные моменты времени (например, R60: время длительности в секундах до остаточного сигнала 60% от базовой линии сигнала mCherry). Этот параметр может быть использован для количественной оценки скорости, с которой акросомальное содержимое рассеивается при АЭ. - Снижение сигнала при потере mCherry: определите разницу в амплитуде между базовой интенсивностью флуоресценции mCherry и сигналом, следующим за AE. Этот параметр указывает на общее количество акросомального содержимого, диспергированного при АЭ.
- Постройте график изменений флуоресценции (F) для красного и зеленого каналов в виде исходных данных или нормализуйте их по начальной флуоресценции (F0) и выразите их как ΔF/F0. Последний обеспечивает лучшую визуализацию изменений как красного, так и зеленого цвета на одном графике (см., например, рис. 3D и рис. 3H).
ПРИМЕЧАНИЕ: Наконец, различные измеренные параметры могут быть сравнены в различных условиях, чтобы определить взаимосвязь между изменениями концентрации кальция в акросомальной области и АЭ. Примеры различных сравнений экспериментальных условий см. в ссылке2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 2 представлена упрощенная иллюстрация, показывающая последовательность изменений флуоресценции, ожидаемых после успешной стимуляции сперматозоидов. Верхняя панель рисунка 2 иллюстрирует изменения интенсивности флуоресценции GCaMP3, где сигнал изначально тусклый (исходная акросомальная концентрация кальция ниже, чем GCaMP3 KD), а при поступлении ионов кальция через плавление пор флуоресценция увеличивается в яркости. Наконец, при АЭ происходит потеря сигнала из-за диффузии и потери датчика во внеклеточное пространство. На нижней панели рисунка 2 показаны изменения интенсивности флуоресценции mCherry, где начальный сигнал яркий, и только при АЭ и диффузии датчика вместе с другим содержимым акросомального матрикса происходит затемнение красного сигнала.
На рисунке 3 представлены фактические данные измерений для проиллюстрированных выше стадий в двух живых сперматозоидах, стимулированных 125 мкМ ганглиозида GM1 (для получения более подробной информации о том, как GM1 регулирует АЭ в сперматозоиде12), захваченных в одном поле зрения. На рисунках 3A, B и 3E, F показаны красные и зеленые сигналы, измеренные в двух сперматозоидах в момент времени 0 (до стимуляции), где изначально сигнал mCherry яркий, а GCaMP3 тусклый. На рисунке 3C, рисунке 3G и рисунке 3D, рисунке 3H представлен анализ Z Profiler в течение всего эксперимента (необработанные данные или F/F0, соответственно). Панели вставки обеспечивают увеличенное представление временного окна, в котором происходят ACR и AE.
Поскольку сперматозоиды очень неоднородны и очень чувствительны к повреждению мембран из-за различных процедур обработки, на рисунке 5 приведены примеры двух типов отрицательных результатов. На рисунках 5A,C показано несколько сперматозоидов, захваченных в пределах одного поля зрения. Желтым контуром выделены два сперматозоида, которые демонстрируют высокий сигнал GCaMP3 в момент времени 0 (до стимуляции). В настоящих экспериментах таких клеток избегали, так как они указывают на то, что акросомальный везикула уже проходит через какой-то процесс слияния мембран или что они испытали некоторое повреждение мембраны, которое позволяет кальцию просачиваться. Сперматозоиды на рисунке 5A, показанные стрелкой (круг ROI на рисунке 5A, C), демонстрируют начальный сигнал mCherry, но не реагируют в красном или зеленом каналах (рис. 5B, D, соответственно, показывает окно анализа Z-Profiler, предоставленное ImageJ) после стимуляции 125 мкМ GM1. Несмотря на то, что субпопуляция сперматозоидов, подобная той, что приведена в этом примере, не показывает никакой реакции на стимуляцию, они включаются в окончательный анализ и рассчитываются в анализе данных процента ответов2 (рис. 3).
Рисунок 1: Контрольно-измерительные приборы и экспериментальная установка. (A) Живые сперматозоиды на покровной чашке, покрытой PDL, помещенные в инкубационную камеру при температуре 37 °C. Боросиликатный капилляр, вытянутый и прикрепленный к одноклеточной системе доставки, располагается рядом со сперматозоидом в центре области визуализации для прямой доставки стимулятора. Как зеленый (GCaMP3), так и красный (mCherry) каналы непрерывно контролируются и записываются с высокой частотой кадров (например, 10 кадров/с) во время стимуляции. (Б) Схематическое изображение рисунка осаждения PDL на тарелке-затворе. (C) Схематическое изображение конкретных областей на чашке, где сперматозоиды могут быть стимулированы с помощью капилляра, чтобы свести к минимуму неспецифическую стимуляцию от предыдущих затяжек в той же чашке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Изменения сигнала и интенсивности флуоресценции. Верхняя панель: Увеличение сигнала GCaMP3 означает приток кальция в акросому, за которым следует потеря сигнала из-за диффузии белка слияния AcroSensE. Нижняя панель: сигнал mCherry остается стабильным во время первоначального слияния мембран с последующим затемнением при диффузии AcroSensE и акросомальном экзоцитозе (АЭ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные данные и флуоресцентные следы. Было получено изображение, содержащее два сперматозоида. Флуоресценция зеленого/красного каналов была количественно определена в автономном режиме с помощью ImageJ и построена в Excel (как описано в шаге 6). (А-Д) Количественная оценка интенсивности флуоресценции красного (A) и зеленого (B) каналов для ячейки #1 с течением времени, рассчитанная для выбранных ROI, а затем представленная в виде необработанных данных (C) или нормированная к исходному сигналу (D, F/F0). Вставка (D) обеспечивает увеличенный вид временного интервала от 25 до 125 с. (E-H) Количественная оценка интенсивности флуоресценции красного (E) и зеленого (F) каналов для ячейки #2 с течением времени, рассчитанная для выбранных ROI, а затем представленная в виде необработанных данных (G) или нормированная к исходному сигналу (H, F/F0). Вставка в (H) обеспечивает увеличенный вид временного интервала от 25 до 125 с. Масштабная линейка = 5 мкм. Все оси X представляют время в секундах (с). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Параметры анализа и количественной оценки. (A) Иллюстрация типичной кривой интенсивности флуоресценции GCaMP3 с отображением количественных параметров, включая время начала (секунды), амплитуду (интенсивность флуоресценции) и продолжительность (секунды). (B) Иллюстрация типичной кривой интенсивности флуоресценции mCherry, отображающая количественные параметры, включая время начала (секунды), продолжительность (секунды), наклон (F/s), R60 (интенсивность флуоресценции) и амплитуду (интенсивность флуоресценции). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Отрицательные результаты. (A,C) mCherry (красный) и GCaMP3 (зеленый) каналы, показывающие несколько сперматозоидов, захваченных в одном поле зрения. Стрелка на рисунке (А) указывает на сперматозоид, первоначально демонстрирующий флуоресценцию mCherry, но не изменяющий последующих изменений интенсивности флуоресценции в ответ на стимуляцию GM1 125 мкМ, как это наблюдается в следах, сгенерированных Z-Profiler, представленных в (B) (mCherry) и (D) (GCaMP3). Клетки внутри желтого прямоугольника демонстрируют повышенную интенсивность флуоресценции GCaMP3 в момент времени 0, до стимуляции. Масштабная линейка = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В данной работе описан метод, основанный на микроскопии, использующий недавно сгенерированную модель мыши AcroSensE для мониторинга отдельных клеток в режиме реального времени и анализа взаимодействия между акросомальной динамикой кальция и промежуточными этапами, ведущими к АЭ. Вместе с легкодоступными генетическими подходами, такими как скрещивание с другими генетическими моделями мышей или редактирование генов, эта модель и метод обеспечивают мощную систему для изучения роли различных компонентов и путей, которые принимают участие в сигнальных путях сперматозоидов, связанных с капациацией, НЯ и оплодотворением.
Критические шаги
На всех этапах работы со спермой важно использовать пластиковые трансферные пипетки большого диаметра или наконечники для пипеток с большим отверстием, а также выполнять все этапы сбора и промывки при температуре 37 °C, чтобы свести к минимуму повреждение мембраны. Аналогичным образом, ротор с качающимся ковшом предпочтительнее ротора с фиксированным углом, чтобы избежать повреждения мембраны из-за взаимодействия клеток с боковой стенкой пробирки микроцентрифуги. Если доступна коррекция дрейфа Z-положения, настоятельно рекомендуется применять аппаратное/программное обеспечение для коррекции z-положения, чтобы избежать дрейфа изображенного сперматозоида из фокальной плоскости во время интервала визуализации.
Модификации и устранение неполадок
Протокол, описанный здесь, был оптимизирован для исследований липидно-опосредованной сигнализации 2,3 и может быть применен как к капабельным, так и к некапацитированным сперматозоидам. Могут использоваться различные методы капацитации сперматозоидов; Например, в качестве акцепторов стерола могут выступать либо альбумин, либо циклодекстрин. Кроме того, могут быть добавлены или исключены различные энергетические субстраты или бикарбонат. Тем не менее, обратите внимание, что бикарбонат образуется в водной среде при воздействии воздуха, поэтому тестирование действительно «свободных от бикарбонатов» условий потребует тщательного использования азотной среды на всех этапах изготовления/подготовки/обращения со средой и проведения эксперимента. Приведенный выше протокол включает в себя использование 10 мМ кальция, добавленного в экспериментальный раствор; однако ионы кальция могут быть опущены, хелатированы (например, EGTA) или добавлены в более низких концентрациях для чувствительных к кальцию экспериментальных применений. Обратите внимание, что понижение или исключение концентрации кальция приведет к уменьшению ожидаемого сигнала GCaMP3 на AE2. Кроме того, для этого протокола можно использовать другие среды (в отличие от MW, используемых здесь), которые лучше соответствуют их экспериментальному дизайну и целям. Представленный протокол описывает использование одноклеточной визуализации и одноклеточной доставки стимуляторов; Тем не менее, упрощенная вариация достижима путем объемной стимуляции, например, путем добавления стимулирующего реагента ко всей чашке, а не путем затяжки. Кроме того, с использованием модели AcroSensE также возможны эксперименты для всей популяции с использованием флуориметров или планшетных ридеров с возможностью флуоресценции.
Ограничения
Представленный здесь метод требует наличия, обслуживания и использования колонии мышей AcroSensE. Метод также зависит от наличия передовой системы визуализации, которая является дорогостоящей и требует обученного персонала. Для некоторых экспериментальных применений возможное ограничение связано с невозможностью одновременного измерения цитозольного кальция в сперматозоидах AcroSensE, поскольку многие доступные индикаторы синтетического кальция имеют длину волны, аналогичную GCaMP3. Несмотря на то, что это выходит за рамки данного протокола, потенциальные ограничения экспериментов на популяционном уровне могут включать в себя считывание сигнала mCherry после АЭ и дисперсию в среде или сигнал GCaMP3, поступающий от мертвых/пермеабилизированных клеток. Чтобы оптимизировать такие методы, можно изучить использование z-фокусировки для минимизации фонового шума от секретируемой mCherry и/или использовать фиктивные контрольные элементы для обеспечения базового количественного определения GCaMP из мертвых или пермеабилизированных сперматозоидов.
Значимость метода по отношению к существующим/альтернативным методам
За последние два десятилетия появились сообщения о нескольких методах изучения динамики НЯ в живых сперматозоидах в режиме реального времени, в том числе на трансгенных мышах GFP, нацеленных на акросомы, кальциевых красителей, загруженных в акросому (например, Fluo-412), или с использованием индикаторов, специфичных для экзоцитоза, таких как синтетический краситель FM-6413. Однако, по сравнению с этими методами, модель AcroSensE обеспечивает удобство использования минимально обработанных сперматозоидов, которые не требуют загрузки красителя или других процедур, потенциально нарушающих мембрану. Важно отметить, что наличие сперматозоидов имеет большое преимущество в том, чтобы иметь двойной индикатор, который может контролировать акросомальную динамику кальция, слияние мембран и образование пор, а также НЯ и последующее высвобождение акросомального содержимого.
Важность и возможности применения метода в конкретных областях исследований
Обратите внимание, что приведенные ниже примеры экспериментального применения могут быть выполнены в виде одноклеточного или популяционного анализа, причем последний имеет значительные преимущества, когда требуется высокопроизводительный анализ. Исследования динамики АЭ в различных моделях мышей могут проводиться путем скрещивания с мышиной моделью AcroSensE, включая (1) нулевые или мутировавшие формы различных кальциевых каналов или субъединиц кальциевых каналов (например, скрещивание с α1E- и CatSper-нулевыми моделями); (2) нулевые или мутировавшие формы белков, которые опосредуют слияние мембран (например, SNAREs). Кроме того, могут быть проведены исследования для изучения того, как различные фармакологические агенты, связанные с различными сигнальными путями, модулируют акросомальный кальций и динамику НЯ. Кроме того, могут быть проведены исследования того, как изменения окружающей среды влияют на АЭ, включая температуру, рН, а также наличие или концентрацию различных ионов или малых молекул.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни у одного из авторов нет конфликта интересов, связанного с этой работой.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения R01-HD093827 и R03-HD090304 (A.J.T.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
References
- Austin, C. R. Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg. Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).
- Cohen, R., et al. A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis. J Biol Chem. 298 (5), 101868 (2022).
- Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J.
- Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm. J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).
- Sosa, C. M., et al. Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis). Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).
- Balestrini, P. A., et al. Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time. Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).
- Nakanishi, T., et al. Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein. FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).
- Kim, K. S., Gerton, G. L. Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm. Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).
- Hasuwa, H., et al. Transgenic mouse sperm that have green acrosome and red mitochondria allow visualization of sperm and their acrosome reaction in vivo. Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science. 59 (1), 105-107 (2010).
- Henderson, M. J., et al. A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store. PloS one. 10 (10), 0139273 (2015).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. J Biol Chem. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Cohen, R., et al. Lipid modulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis and fertilization. Dev Cell. 28 (3), 310-321 (2014).
- Sanchez-Cardenas, C., et al. Acrosome reaction and Ca(2)(+) imaging in single human spermatozoa: new regulatory roles of [Ca(2)(+)]i. Biol Reprod. 91 (2), 67 (2014).
