Summary
AcroSensE-musemodellen og levende cellebilleddannelsesmetoder, der er beskrevet her, giver en ny tilgang til at studere calciumdynamik i sædets subcellulære rum, og hvordan de regulerer mellemliggende trin, der fører til membranfusion og akrosomexocytose.
Abstract
Akrosomexocytose (AE), hvor sædcellernes enkelt exocytotiske vesikel smelter sammen med plasmamembranen, er en kompleks, calciumafhængig proces, der er afgørende for befrugtning. Vores forståelse af, hvordan calciumsignalering regulerer AE, er dog stadig ufuldstændig. Især er samspillet mellem intra-akrosomale calciumdynamikker og de mellemliggende trin, der fører til AE, ikke veldefineret. Her beskriver vi en metode, der giver rumlig og tidsmæssig indsigt i akrosomal calciumdynamik og deres forhold til membranfusion og efterfølgende exocytose af akrosomblæren. Metoden anvender en ny transgen mus, der udtrykker en Acrosome-målrettet sensor til exocytose (AcroSensE). Sensoren kombinerer en genetisk kodet calciumindikator (GCaMP) smeltet sammen med mCherry. Dette fusionsprotein blev specielt designet til at muliggøre samtidig observation af akrosomal calciumdynamik og membranfusionshændelser. Realtidsovervågning af akrosomal calciumdynamik og AE i levende AcroSensE-sæd opnås ved hjælp af en kombination af billeddannelse med høj billedhastighed og et stimulerende leveringssystem, der kan målrette mod enkelt sædceller. Denne protokol giver også flere eksempler på grundlæggende metoder til kvantificering og analyse af rådata. Fordi AcroSensE-modellen er genetisk kodet, kan dens videnskabelige betydning øges ved hjælp af let tilgængelige genetiske værktøjer, såsom krydsning med andre musegenetiske modeller eller genredigeringsbaserede metoder (CRISPR). Med denne strategi kan rollerne for yderligere signalveje i sædkapacitation og befrugtning løses. Sammenfattende giver metoden beskrevet her et praktisk og effektivt værktøj til at studere calciumdynamik i et specifikt subcellulært rum - sædakrosomet - og hvordan disse dynamikker regulerer de mellemliggende trin, der fører til membranfusion og akrosomexocytose.
Introduction
Sperm erhverver evnen til at befrugte under en proces kaldet kapacitation1. Et endepunkt i denne proces er, at sædcellerne erhverver evnen til at gennemgå AE. Over to årtiers data understøtter tilstedeværelsen af en kompleks flertrinsmodel af AE i pattedyrsæd (opsummeret i 2,3). Det er imidlertid udfordrende at studere AE i levende sædceller, og de aktuelt tilgængelige metoder til overvågning af denne proces med tilstrækkelig opløsning er besværlige og kræver flere forberedelsestrin4, er begrænset til påvisning af det sidste trin i AE (f.eks. ved hjælp af PNA5), er begrænset til målinger af ændringer i cytosolisk calcium (i modsætning til akrosomal calciumdynamik), eller er begrænset til målinger af enten cytosolisk calciumdynamik eller AE6.
For at overvinde nogle af de vigtigste begrænsninger ved AE-undersøgelser i realtid under fysiologiske forhold og for at muliggøre undersøgelse af samspillet mellem calciumdynamik og AE blev der genereret en unik musemodel. I denne musemodel udtrykkes et fusionsprotein sammensat af den genetisk kodede Ca2+-sensor (GCaMP3) og mCherry og målrettes mod akrosomet ved hjælp af en acrosinpromotor og signalpeptid2. Den målrettede dobbelte GCaMP3-mCherry-sensor muliggør samtidige realtidsmålinger af calciumkoncentrationer og status for det akrosomale indhold i levende sædceller under fysiologiske forhold ved hjælp af mikroskopi og et enkeltcellestimulerende leveringssystem (figur 1). Som en komponent i den akrosomale matrix ville membranfusion og AE resultere i tab af den fototable og pH-ufølsomme mCherry-fluorescens fra sædcellerne, da dette protein diffunderer ud af den akrosome vesikel. I denne henseende er modellens evne til at afspejle timingen og forekomsten af AE beslægtet med fordelene ved den akrosommålrettede GFP-muselinje 7,8,9.
GCaMP3-varianten, der anvendes i denne transgene muselinje, har en omtrentlig KD på 400 μM og et dynamisk område for Ca2+ på 10-4-10-3 M 10, som er egnet til denne vesikel. Vi viste, at denne kombination af funktioner i GCaMP3 kunne afsløre fusionsporedannelse mellem plasmamembranen og den ydre akrosomale membran (OAM)2. Fusionsporedetektionen er et resultat af, at porestørrelsen er for lille til at tillade AcroSensE-proteinet at sprede sig ud af akrosomet (via tab af akrosomindhold), samtidig med at der tilvejebringes en membrankanal, der muliggør tilstrømning afCa2+-ioner til det akrosomiske lumen, hvilket fører til en stigning i GCaMP3's fluorescensintensitet.
Det lyse, monomere, ikke-calciumfølsomme fluorescerende protein mCherry understøtter visualisering af akrosomet, mens GCaMP3-signalet er svagt (f.eks. Før Ca2+ -binding, figur 2), og vigtigst af alt giver det også mulighed for identifikation af akrosomintakte sædceller, der er egnede til billeddannelse.
Følgende protokol beskriver udnyttelsen af den unikke AcroSensE-musemodel og de metoder til mikroskopi, der anvendes eksperimentelt til at studere AE og sædcalciumdynamik med høj rumlig og tidsmæssig opløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført under retningslinjerne og godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Cornell University (#2002-0095). 8-10 uger gamle AcroSensE-mus2 blev anvendt til nærværende undersøgelse. Anmodninger om oplysninger om tilgængeligheden af AcroSensE-musene kan indsendes til den tilsvarende forfatter.
1. Sædopsamling og vask
- Saml cauda epididymal sæd (flere detaljer om denne procedure findes i11) fra AcroSensE mus. Tillad 15 minutters swim-out procedure i en 3,5 cm vævskulturskål indeholdende 0,5 ml modificeret Whittens medium (MW) ved 37 °C. Skålen skal dækkes for at reducere fordampningen af MW og skal vippes, så mediet har tilstrækkelig dybde til at dække cauda epididymiderne.
BEMÆRK: Modificeret Whittens medium (MW) inkluderer 22 mM HEPES, 1,2 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1 mM pyruvinsyre, 4,8 mM mælkesyre hemi-Ca2+ salt, pH 7,35. Glucose (5,5 mM), NaHCO3 (10 mM) og 2-hydroxypropyl-cyclodextrin (CD; 3 mM) suppleres (se materialetabel) efter behov til induktion af kapacitation, og koncentrationerne kan ændres til specifikke forsøg. Derudover kan alternative sterolacceptorer anvendes i stedet for CD (f.eks. Bovin serumalbumin eller lipoproteiner med høj densitet). - Brug fine pincet til at fjerne eventuelt epididymalt væv fra svømmeopsamlingsskålen. Substratet indeholdende sædcellerne overføres til et 15 ml konisk rør, og suspensionen centrifugeres ved 100 x g i 1 min i en svingende skovlrotor ved stuetemperatur. Brug en plastpipette til at fjerne MW-supernatanten indeholdende sædcellerne fra eventuelle grove vævsrester, der vil være pelleteret på dette trin.
- MW-supernatanten med sædcellerne bringes op på et samlet volumen på 3 ml ved tilsætning af MW ved 37 °C. Der centrifugeres ved 400 x g i 8 min (ved stuetemperatur) i et rundbundet rør. Langsomt fjernes supernatanten af MW fra den løst pelleterede sæd.
- Hvis det er levedygtigt, skal sædcellerne fremstå som en "fluffy" udseende pellet. Resuspender forsigtigt sædcellerne via trituration med en overførselspipette med stor boring eller via blide manuelle tryk på røret ("fingersvirp"). Når de er opslæmmet jævnt, overføres de til et nyt rundbundet rør. Brug 10-20 μL af sædsuspensionen til at tælle og vurdere bevægeligheden. Fortynd sæd i MW til brug.
BEMÆRK: For de fleste forsøg, der involverer musesædkapacitation, anvendes en endelig koncentration på 5-10 millioner sædceller / ml MW. Den billeddannelsesprotokol, der er beskrevet her, kræver ikke kapacitation af sædceller, selvom det er nødvendigt for sædceller at erhverve evnen til at gennemgå fysiologisk relevant akrosomexocytose. Man kunne studere patologisk exocytose eller exocytose induceret gennem reagenser såsom en calciumionofor uden at kapacitere sædcellerne. Derudover kunne man undersøge potentielle ændringer i akrosomalt calcium i ikke-kapaciterede celler som reaktion på forskellige stimuli. - Brug sædcellerne inden for 3-5 timer fra indsamling, og hold tiden så kort som muligt og konsistent blandt eksperimentelle forsøg.
- Udfør alle trin med opsamling og vask ved 37 °C ved hjælp af MW-medium, og brug metoder til at minimere membranskader. Dette omfatter brugen af plastoverførselspipetter med stor boring eller pipettespidser med stor åbning, som anbefales til brug i alle faser af proceduren.
2. Poly-D-lysin-belægning af dækslipskåle til billeddannelse
BEMÆRK: Poly-D-lysin (PDL) retter skal tilberedes friske før hvert forsøg.
- Dispenser en 0,5 μL dråbe PDL (0,5 mg / ml, se tabel over materialer) i midten af en dækslipskål.
- Brug en 10 μL gradueret spids til at smøre PDL-dråben hen over dæksedlen (på kryds og tværs som vist i figur 1B).
- Lad tørre ved 37 °C i 10 min. Opbevar PDL-overtrukne tallerkener tildækket og ved 37 °C indtil brug.
3. Kapillær træk, belastning til puffing
- Træk borosilikatglaskapillærer (O.D, 2 mm, I.D, 1,56 mm, se materialetabel) ved hjælp af indstillinger som følger- Varme: 330, Træk: 250, Hastighed: 250 og Tid: 70. Dette trin skal optimeres til den specifikke aftrækker i brug.
- Før hvert eksperiment fyldes en enkelt kapillær med den stimulerende opløsning, der indeholder 3-5x koncentrationen af stimulanten (for at tage højde for den hurtige diffusion af opløsningen ved puffing). Før påfyldning skal du bruge en fin pincet til at bryde kapillærspidsen op ca. 1-2 mm fra enden. Dette skal producere en ∼5 μm åbningsdiameter. Varmepolering er ikke påkrævet.
- Brug en tynd plastoverførselspipette til langsomt at injicere den stimulerende opløsning i kapillærrøret, indtil tre fjerdedele af dens længde er fuld.
- Fjern eventuelle luftbobler, der dannes under påfyldning, ved forsigtigt at svirpe med kapillærrøret.
- Monter fyldt kapillær på mikromanipulatoren (se materialetabel).
4. Forberedelse af levering af stimulering til puffing
BEMÆRK: For at minimere risikoen for brugerskade skal der bæres sikkerhedsbriller under betjeningen af puffingproceduren.
- Konfigurer indstillingerne for enkeltcelleleveringssystemet til at give en 10 s puls ved 5 psi.
- Tilslut borosilikatkapillærrøret til pipetteholderen til enkeltcelleleveringssystemet. Sørg for, at tætningerne er tætte.
- Mens du observerer kapillærspidsen, påføres et kort pust på 2 s ved 20 psi for at sikre, at opløsningen faktisk dispenseres gennem spidsens ende (en lille dråbe skal være indlysende i slutningen af spidsen).
5. Mikroskopi og billedoptagelse
BEMÆRK: Flere mærker af mikroskoper er tilgængelige og kan bruges; En minimumsbilledhastighed på 3 billeder / s er dog ønskelig. Med hensyn til temperatur og miljøkontrol skal du være opmærksom på, at den faktiske temperatur på mediet i skålen skal bekræftes, for eksempel ved hjælp af et berøringsfrit infrarødt termometer.
- Der tilsættes 80 μL fortyndet sæd til midten af en poly-D-lysinbelagt 35 mm dækslipskål. Til de fleste forsøg, der involverer musesædkapacitation, anvendes en endelig koncentration på 5-10 millioner sædceller / ml.
- Sædcellerne tilsættes langsomt 3 ml varme (37 °C) MW basemedier suppleret med 10 mM CaCl2.
BEMÆRK: Man kunne udføre eksperimenter ved stuetemperatur for at bremse cellulære processer, men det er vigtigt at bemærke, at fordi kapacitering medieres af lipidudvekslinger og fluiditeten af mikro- og makrodomæner, skal man huske på, at fysiologisk relevant kapacitation og akrosomexocytose er temperaturafhængige processer. - Monter fadet med sædcellerne på mikroskopet (forvarmet til 37 °C).
- Excite GCaMP3 ved hjælp af en 488 nm laserlinje og visning med et 505-550 nm båndpas (BP) filter. Excite mCherry ved hjælp af en 555 nm laserlinje og visning med et 575-615 nm BP-filter.
- Brug en mikromanipulator (det anbefales at fastgøre manipulatoren til luftbordet, hvor mikroskopet blev oprettet.), Placer spidsen af kapillæren ca. 100 μm til siden og 5-10 μm over planet for cellen af interesse.
BEMÆRK: De stimulerende opløsninger fremstilles ved 3-5x den normale koncentration for at kompensere for den hurtige diffusion, der forekommer i volumenet mellem kapillæren og cellen. - Start billeddannelsessekvensen på mikroskopet.
- Billede sædceller med en høj billedhastighed, helst >10 billeder / s. Her blev der brugt en resonansscanner, der muliggør billeddannelse ved 33 ms / ramme.
- Ti sekunder efter start af billedoptagelsen på mikroskopet skal du aktivere enkeltcelleleveringssystemet for at starte 10 s pust af stimulans.
- Billedceller i en varighed på 10-15 min.
- Brug enkeltcelleleveringssystemet til at afbilde flere celler fra en enkelt skål i henhold til placeringerne i figur 1B.
BEMÆRK: Ubehandlet / ikke-stimuleret sæd under mikroskopet skal for det meste fremstå rødt, med en lav intensitet af det grønne signal. Sædhoveder skal fastgøres til dæksedlen, og levende sæd kan identificeres ved deres bevægelige haler. I sædceller, der gennemgår AE, øges det GCaMP3 grønne signal oprindeligt, og både det mCherry røde signal og GCaMP3 grønne signal forsvinder, hvis AE er komplet, som illustreret i figur 2. Reduktionen af mCherry-fluorescens giver en mere specifik indikator for det tidspunkt, hvor AE begynder, fordi ændringer iCa2+ -koncentrationer løbende vil medføre ændringer i GCaMP3-fluorescensintensiteten.
6. Billed- og dataanalyse
BEMÆRK: Offline billedanalyse udføres ved hjælp af ImageJ (se materialetabel). Tidligere blev flere mellemliggende trin rapporteret i processen, der førte til AE, herunder acrosomal calciumstigning (ACR) og fuld membranfusion. Sidstnævnte fører til tab af mCherry-fluorescens og repræsenterer derfor fuld AE. I nogle celler observeres signaler, der ligner pre-spike fodhændelser (PSF), når der anvendes amperometriske tilgange i undersøgelser af exocytose (for flere detaljer, se2). Flere valgfrie metoder er tilgængelige til analyse af AcroSensE-rådata for at kvantificere ACR, AE og dets mellemliggende trin. I det følgende beskrives nogle af de grundlæggende analysemetoder.
- Afhængigt af den specifikke mikroskopsystemudvidelse skal du bruge værktøjet til delt kanal (Image > Colors > Split Channels) til at generere individuelle vinduer til GCaMP3- og mCherry-kanalerne.
- Synkroniser de enkelte vinduer ved hjælp af værktøjet "Synkroniser vindue" (Analyser > værktøjer > synkroniser vinduer).
- Vælg et interesseområde (ROI) omkring sædhovedet i den røde kanal for at inkludere akrosomområdet (figur 3A, B). Synkroniseringsværktøjet gør det muligt automatisk at anvende det samme områdevalg på den grønne kanal, hvor sædcellerne stadig er for svage til at være synlige.
- Vælg "Z Profiler" plugin (Plugins > Stacks > Z Profiler) eller "Time Series Analyzer" (Plugins > Stacks > Time Series Analyzer) for at plotte ændringen i fluorescensintensitet som en funktion af rammer / tid for hver af de to kanaler.
- Kopier data til et regnearkssoftware (f.eks. Microsoft Excel) til plotning og yderligere analyse.
BEMÆRK: Når dataene er kopieret til et regneark, kan flere parametre udtrækkes til analyse, herunder følgende, som illustreret i figur 4.- Starttidspunkt for fusionspore (FP): mål tiden fra tidspunkt 0 til det tidspunkt, hvor GCaMP3-signalet begynder at stige. Denne parameter angiver forsinkelsen mellem stimuleringen og sædcellernes ACR-respons.
- AE starttid: mål tiden fra tidspunkt 0 til det tidspunkt, hvor mCherry-signalet begynder at henfalde. Denne parameter angiver forsinkelsen mellem stimuleringen og sædets AE-respons. Denne parameter kan også bruges til at beregne forsinkelsen mellem FP-dannelse og AE-respons.
- Peak FP-amplitude: mål fluorescenssignalet fra basen til toppen af GCaMP3-signalstigningen. Denne parameter angiver den samlede stigning i ACR-respons.
- Hastighed for tab af mCherry: Bestem denne parameter ved en lineær eller eksponentiel tilpasning på sektionen af mCherry-signaltabet (som angivet med "hældning" i figur 4B).
BEMÆRK: Alternativt kan du bestemme henfaldshastigheden ved hjælp af restsignalmetoden (R) på forskellige tidspunkter (f.eks. R60: varighedstid i sekunder til et restsignal på 60% fra basislinjen for mCherry-signalet). Denne parameter kan bruges til at kvantificere den hastighed, hvormed det akrosomale indhold spredes ved AE. - Signalfald for mCherry-tab: Bestem forskellen i amplitude mellem baseline mCherry-fluorescensintensiteten og signalet efter AE. Denne parameter angiver den samlede mængde akrosomale indhold, der er spredt på AE.
- Plot ændringerne i fluorescens (F) for både den røde og grønne kanal som rådata, eller normaliser dem ved den indledende fluorescens (F0) og udtryk dem som ΔF / F0. Sidstnævnte giver bedre visualisering af ændringerne i både rødt og grønt på et enkelt plot (se f.eks. figur 3D og figur 3H).
BEMÆRK: Endelig kan de forskellige målte parametre sammenlignes mellem forskellige betingelser for at bestemme forholdet mellem ændringer i akrosomal calciumkoncentration og AE. For eksempler på forskellige eksperimentelle tilstandssammenligninger, se reference2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 giver en forenklet illustration, der viser rækkefølgen af fluorescensændringer, der forventes efter vellykket stimulering af sædceller. Toppanelet i figur 2 illustrerer ændringerne i GCaMP3 fluorescensintensitet, hvor signalet oprindeligt er svagt (baseline acrosomale calciumkoncentrationer er lavere end GCaMP3 KD), og ved indtrængen af calciumioner via fusionsporer øges fluorescensen i lysstyrke. Endelig er der ved AE et tab af signal på grund af diffusion og tab af sensoren til det ekstracellulære rum. Det nederste panel i figur 2 illustrerer ændringerne i mCherry-fluorescensintensiteten, hvor det oprindelige signal er lyst, og kun ved AE og diffusion af sensoren sammen med andet indhold af den akrosomale matrix er der en dæmpning af det røde signal.
Figur 3 viser faktiske målte data for stadierne illustreret ovenfor i to levende sædceller stimuleret med 125 μM af gangliosidet GM1 (for flere detaljer om, hvordan GM1 regulerer AE i sæd12), fanget i et enkelt synsfelt. Figur 3A, B og figur 3E, F viser de røde og grønne signaler målt i to sædceller på tidspunktet 0 (før stimulering), hvor mCherry-signalet oprindeligt er lyst, og GCaMP3 er svagt. Figur 3C, figur 3G og figur 3D, figur 3H giver Z Profiler-analysen for hele eksperimentets varighed (rådata eller F/F0, henholdsvis). Indsæt paneler giver en zoomet visning af tidsvinduet, hvor ACR og AE forekommer.
Fordi sædceller både er meget heterogene og meget følsomme over for membranskader på grund af forskellige håndteringsprocedurer, giver figur 5 eksempler på to typer negative resultater. Figur 5A,C viser flere sædceller fanget inden for et synsfelt. Den gule kontur fremhæver to sædceller, der viser et højt GCaMP3-signal på tidspunktet 0 (før stimulering). I de nuværende eksperimenter blev sådanne celler undgået, da de indikerer, at den akrosomale vesikel allerede gennemgår en membranfusionsproces, eller at de har oplevet nogle membranskader, der tillader calcium at lække. Sædcellerne i figur 5A angivet med pilen (cirkel ROI i figur 5A,C) viser et indledende mCherry-signal, men intet respons i de røde eller grønne kanaler (henholdsvis figur 5B,D, der viser Z-Profiler-analysevinduet som leveret af ImageJ) efter stimulering med 125 μM GM1. Selvom en underpopulation af sædceller, som den, der er angivet i dette eksempel, ikke viser nogen respons på stimulering, er disse inkluderet i den endelige analyse og beregnes i procentvis responsdataanalyse2 (figur 3).
Figur 1: Instrumentering og eksperimentel opsætning. A) Levende sædceller på en PDL-belagt dækslipskål anbragt i et inkubationskammer ved 37 °C. En borosilikatkapillær, trukket og fastgjort til et enkeltcelleleveringssystem, er placeret nær sædcellen i midten af billeddannelsesområdet til direkte stimulerende levering. Både grønne (GCaMP3) og røde (mCherry) kanaler overvåges kontinuerligt og optages med en høj billedhastighed (f.eks. 10 billeder / s) under stimulering. (B) Skematisk gengivelse af PDL-aflejringsmønsteret på dækslet og glideskålen. (C) Skematisk gengivelse af de specifikke områder på skålen, hvor sæd kan stimuleres ved hjælp af kapillærrøret for at minimere uspecifik stimulering fra tidligere pust i samme skål. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Ændringer i fluorescenssignal og intensitet. Toppanel: En stigning i GCaMP3-signalet betyder calciumtilstrømning til akrosomet efterfulgt af signaltab på grund af diffusion af AcroSensE-fusionsproteinet. Bundpanel: mCherry-signalet forbliver stabilt under indledende membranfusion med efterfølgende dæmpning ved AcroSensE-diffusion og akrosomale exocytose (AE). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative data og fluorescensspor. Et felt indeholdende to sædceller blev afbildet. Grøn/rød kanalfluorescens blev kvantificeret offline ved hjælp af ImageJ og afbildet i Excel (som beskrevet i trin 6). (A-D) Kvantificering af rød (A) og grøn (B) kanalfluorescensintensitet for celle #1 over tid, beregnet for udvalgte ROI'er og derefter præsenteret som rådata (C) eller normaliseret til startsignalet (D, F/F0). Indsættelsen i (D) giver et zoomet billede af tidsrammen fra 25-125 s. (E-H) Kvantificering af rød (E) og grøn (F) kanalfluorescensintensitet for celle #2 over tid, beregnet for udvalgte ROI'er og derefter præsenteret som rådata (G) eller normaliseret til startsignalet (H, F / F0). Indsættelsen i (H) giver et zoomet billede af tidsrammen fra 25-125 s. Skalabjælke = 5 μm. Alle x-akser repræsenterer tid i sekunder (s). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Dataanalyse og kvantificeringsparametre. (A) Illustration af et typisk GCaMP3-fluorescensintensitetsspor, der viser kvantificerbare parametre, herunder starttid (sekunder), amplitude (fluorescensintensitet) og varighed (sekunder). (B) Illustration af et typisk mCherry-fluorescensintensitetsspor, der viser kvantificerbare parametre, herunder starttidspunkt (sekunder), varighed (sekunder), hældning (F / s), R60 (fluorescensintensitet) og amplitude (fluorescensintensitet). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Negative resultater. (A,C) mCherry (rød) og GCaMP3 (grøn) kanaler, der viser flere sædceller fanget i et enkelt synsfelt. Pilen i (A) angiver en sædcelle, der oprindeligt udviser mCherry-fluorescens, men ingen efterfølgende ændringer i fluorescensintensiteten som reaktion på 125 μM GM1-stimulering, som observeret i de Z-Profiler-genererede spor, der er angivet i (B) (mCherry) og (D) (GCaMP3). Celler i det gule rektangel udviser forhøjet GCaMP3-fluorescensintensitet ved tidspunktet 0 før stimulering. Skalabjælke = 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrives en mikroskopibaseret metode til at udnytte den nygenererede AcroSensE-musemodel til realtids, enkeltcelleovervågning og analyse af samspillet mellem akrosomal calciumdynamik og mellemliggende trin, der fører til AE. Sammen med let tilgængelige genetiske tilgange, såsom krydsning med andre musegenetiske modeller eller genredigering, giver denne model og metode et kraftfuldt system til at studere rollen som forskellige komponenter og veje, der deltager i sædsignalveje relateret til kapacitation, AE og befrugtning.
Kritiske trin
Det er vigtigt i alle sædhåndteringstrin at bruge plastoverførselspipetter med stor boring eller pipettespidser med stor åbning og at udføre alle trin i opsamling og vask ved 37 °C for at minimere membranskader. På samme måde foretrækkes en svingende skovlrotor frem for en fastvinklet rotor for at undgå membranskader på grund af celler, der interagerer med mikrocentrifugerørets sidevæg. Hvis Z-position drift korrektion er tilgængelig, anbefales det stærkt at anvende z-position korrektion hardware / software for at undgå drift af den afbildede sæd ud af brændplanet under billeddannelsesintervallet.
Ændringer og fejlfinding
Protokollen beskrevet her blev optimeret til undersøgelser af lipidmedieret signalering 2,3 og kan anvendes på både kapaciterede og ikke-kapaciteret sædceller. Forskellige metoder til sædkapacitation kan anvendes; For eksempel kan enten albumin eller cyclodextrin tjene som sterolacceptorer. Derudover kan forskellige energisubstrater eller bicarbonat tilsættes eller udelades. Bemærk dog, at bicarbonat dannes i vandige medier fra udsættelse for luft, så test af virkelig 'bicarbonatfrie' betingelser ville kræve omhyggelig brug af et nitrogenmiljø i alle trin i fremstilling / forberedelse / håndtering af mediet og udførelse af eksperimentet. Protokollen ovenfor inkluderer anvendelse af 10 mM calcium tilsat til den eksperimentelle opløsning; calciumioner kan dog udelades, chelateres (f.eks. EGTA) eller tilsættes i lavere koncentrationer til calciumfølsomme eksperimentelle anvendelser. Bemærk, at sænkning eller udeladelse af calciumkoncentrationer vil mindske det forventede GCaMP3-signal ved AE2. Derudover kan man bruge andre medier til denne protokol (i modsætning til MW, der bruges her), der bedre passer til deres eksperimentelle design og mål. Den medfølgende protokol beskriver brugen af enkeltcellebilleddannelse og enkeltcelleafgivelse af stimulanser; En forenklet variation kan dog opnås ved bulkstimulering, såsom ved at tilføje det stimulerende reagens til hele skålen og ikke via puffing. Derudover er det også muligt at eksperimentere med hele populationer ved hjælp af AcroSensE-modellen ved hjælp af fluorimetere eller pladelæsere med fluorescensevne.
Begrænsninger
Den metode, der leveres her, kræver tilgængelighed, vedligeholdelse og brug af en AcroSensE-musekoloni. Metoden afhænger også af tilgængeligheden af et avanceret billeddannelsessystem, hvilket er dyrt og kræver uddannet personale. For nogle eksperimentelle anvendelser vedrører en mulig begrænsning manglende evne til samtidig at måle cytosolisk calcium i AcroSensE-sædceller, da mange tilgængelige syntetiske calciumindikatorer har samme bølgelængde som GCaMP3. Selvom det ligger uden for denne protokols anvendelsesområde, kan potentielle begrænsninger af eksperimenter på populationsniveau omfatte aflæsning af mCherry-signalet efter AE og spredning i mediet eller GCaMP3-signalet, der kommer fra døde / permeabiliserede celler. For at optimere sådanne metoder kan man udforske at anvende z-fokusering for at minimere baggrundsstøj fra udskilt mCherry og / eller bruge skambehandlede kontroller for at sikre baseline GCaMP-kvantificering fra døde eller permeabiliserede sædceller.
Metodens betydning i forhold til eksisterende/alternative metoder
I løbet af de sidste to årtier har der været rapporter om flere metoder til realtidsundersøgelser af AE-dynamik i levende sædceller, herunder akrosommålrettede GFP-transgene mus7, calciumfarvestoffer indlæst i akrosomet (f.eks. Fluo-412) eller ved hjælp af exocytosespecifikke indikatorer såsom det syntetiske farvestof FM-6413. I sammenligning med disse metoder giver AcroSensE-modellen imidlertid bekvemmeligheden ved at bruge minimalt behandlet sæd, der ikke kræver farvestofbelastning eller andre potentielt membranforstyrrende procedurer. Det er vigtigt, at der er en stor fordel ved at have sædceller, der udtrykker en dobbelt indikator, der kan overvåge akrosomal calciumdynamik, membranfusion og poredannelse samt AE og den deraf følgende frigivelse af det akrosomale indhold.
Metodens betydning og potentielle anvendelser inden for specifikke forskningsområder
Bemærk, at de eksperimentelle applikationseksempler nedenfor kan udføres som enkeltcelle- eller populationsanalyser, hvor sidstnævnte har betydelige fordele, når der ønskes analyse med høj kapacitet. Undersøgelser af AE-dynamikken i forskellige musemodeller kan udføres ved krydsning med AcroSensE-musemodellen, herunder (1) nul- eller muterede former af forskellige calciumkanaler eller calciumkanalunderenheder (f.eks. krydsning med α1E- og CatSper-null-modeller); (2) null eller muterede former for proteiner, der medierer membranfusion (f.eks. SNARE'er). Derudover kan undersøgelser udføres for at undersøge, hvordan forskellige farmakologiske midler relateret til forskellige signalveje modulerer acrosomal calcium og AE-dynamik. Desuden kan der forskes i, hvordan miljøændringer påvirker AE, herunder temperatur, pH og tilstedeværelsen eller koncentrationen af forskellige ioner eller små molekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen forfattere har interessekonflikter at rapportere relateret til dette arbejde.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health-tilskud R01-HD093827 og R03-HD090304 (A.J.T).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
References
- Austin, C. R. Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg. Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).
- Cohen, R., et al. A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis. J Biol Chem. 298 (5), 101868 (2022).
- Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J.
- Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm. J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).
- Sosa, C. M., et al. Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis). Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).
- Balestrini, P. A., et al. Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time. Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).
- Nakanishi, T., et al. Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein. FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).
- Kim, K. S., Gerton, G. L. Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm. Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).
- Hasuwa, H., et al. Transgenic mouse sperm that have green acrosome and red mitochondria allow visualization of sperm and their acrosome reaction in vivo. Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science. 59 (1), 105-107 (2010).
- Henderson, M. J., et al. A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store. PloS one. 10 (10), 0139273 (2015).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. J Biol Chem. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Cohen, R., et al. Lipid modulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis and fertilization. Dev Cell. 28 (3), 310-321 (2014).
- Sanchez-Cardenas, C., et al. Acrosome reaction and Ca(2)(+) imaging in single human spermatozoa: new regulatory roles of [Ca(2)(+)]i. Biol Reprod. 91 (2), 67 (2014).
