Summary
Het AcroSensE-muismodel en de hier beschreven beeldvormingsmethoden voor levende cellen bieden een nieuwe benadering voor het bestuderen van de calciumdynamiek in het subcellulaire compartiment van het sperma-acrosoom en hoe deze tussenstappen reguleren die leiden tot membraanfusie en acrosoomexocytose.
Abstract
Acrosoom-exocytose (AE), waarbij het enkele exocytotische blaasje van het sperma versmelt met het plasmamembraan, is een complex, calciumafhankelijk proces dat essentieel is voor bevruchting. Ons begrip van hoe calciumsignalering AE reguleert, is echter nog steeds onvolledig. Met name de wisselwerking tussen intra-acrosomale calciumdynamiek en de tussenstappen die tot AE leiden, is niet goed gedefinieerd. Hier beschrijven we een methode die ruimtelijk en temporeel inzicht geeft in de acrosomale calciumdynamiek en hun relatie met membraanfusie en daaropvolgende exocytose van het acrosoomblaasje. De methode maakt gebruik van een nieuwe transgene muis die een Acrosoom-gerichte sensor voor exocytose (AcroSensE) tot expressie brengt. De sensor combineert een genetisch gecodeerde calciumindicator (GCaMP) gefuseerd met mCherry. Dit fusie-eiwit is speciaal ontworpen om de gelijktijdige observatie van acrosomale calciumdynamiek en membraanfusiegebeurtenissen mogelijk te maken. Real-time monitoring van de acrosomale calciumdynamiek en AE in levend AcroSensE-sperma wordt bereikt met behulp van een combinatie van beeldvorming met hoge framesnelheid en een stimulerend toedieningssysteem dat zich kan richten op enkelvoudig sperma. Dit protocol geeft ook verschillende voorbeelden van basismethoden om de ruwe gegevens te kwantificeren en te analyseren. Omdat het AcroSensE-model genetisch gecodeerd is, kan de wetenschappelijke betekenis ervan worden vergroot door gebruik te maken van direct beschikbare genetische hulpmiddelen, zoals kruising met andere genetische muismodellen of op genbewerking (CRISPR) gebaseerde methoden. Met deze strategie kunnen de rollen van aanvullende signaalroutes bij de capacitatie en bevruchting van sperma worden opgelost. Samenvattend biedt de hier beschreven methode een handig en effectief hulpmiddel om de calciumdynamiek in een specifiek subcellulair compartiment - het sperma-acrosoom - te bestuderen en hoe die dynamiek de tussenstappen reguleert die leiden tot membraanfusie en acrosoomexocytose.
Introduction
Sperma verwerft het vermogen om te bevruchten tijdens een proces dat capacitatie1 wordt genoemd. Een eindpunt van dit proces is dat het sperma het vermogen verwerft om AE te ondergaan. Meer dan twee decennia aan gegevens ondersteunen de aanwezigheid van een complex, meerstapsmodel van AE in sperma van zoogdieren (samengevat in 2,3). Het bestuderen van AE in levend sperma is echter een uitdaging, en de momenteel beschikbare methoden om dit proces met voldoende resolutie te volgen, zijn omslachtig en vereisen meerdere voorbereidingsstappen4, zijn beperkt tot de detectie van de laatste stap van AE (bijv. met behulp van PNA5), zijn beperkt tot metingen van veranderingen in cytosolisch calcium (in tegenstelling tot de acrosomale calciumdynamiek), of zijn beperkt tot metingen van cytosolische calciumdynamiek of AE6.
Om enkele van de belangrijkste beperkingen van real-time AE-studies onder fysiologische omstandigheden te overwinnen en om onderzoek naar de wisselwerking tussen calciumdynamiek en AE mogelijk te maken, werd een uniek muismodel gegenereerd. In dit muismodel wordt een fusie-eiwit bestaande uit de genetisch gecodeerde Ca2+-sensor (GCaMP3) en mCherry tot expressie gebracht en gericht op het acrosoom met behulp van een acrosinepromotor en signaalpeptide2. De gerichte dubbele GCaMP3-mCherry-sensor maakt gelijktijdige real-time metingen van calciumconcentraties en de status van de acrosomale inhoud in levend sperma onder fysiologische omstandigheden mogelijk met behulp van microscopie en een eencellig afgiftesysteem voor stimulerende middelen (Figuur 1). Als onderdeel van de acrosomale matrix zouden membraanfusie en AE resulteren in het verlies van de fotostabiele en pH-ongevoelige mCherry-fluorescentie uit het sperma, aangezien dit eiwit uit het acrosoomblaasje diffundeert. In dit opzicht is het vermogen van het model om de timing en het optreden van AE weer te geven vergelijkbaar met de voordelen van de acrosoomgerichte GFP-muislijn 7,8,9.
De GCaMP3-variant die in deze transgene muizenlijn wordt gebruikt, heeft een geschatte KD van 400 μM en een dynamisch bereik voor Ca2+ van 10-4-10-3 M10, wat geschikt is voor dit blaasje. We toonden aan dat deze combinatie van kenmerken van GCaMP3 de vorming van fusieporiën tussen het plasmamembraan en het buitenste acrosomale membraan (OAM)2 kon onthullen. De detectie van fusieporiën is het gevolg van het feit dat de poriegrootte te klein is om het AcroSensE-eiwit uit het acrosoom te laten dispergeren (via verlies van acrosoomgehalte) en tegelijkertijd een membraankanaal te bieden dat de instroom van Ca2+-ionen in het acrosoomlumen mogelijk maakt, wat leidt tot een toename van de fluorescentie-intensiteit van het GCaMP3.
Het heldere, monomeer, niet-calciumgevoelige fluorescerende eiwit mCherry ondersteunt de visualisatie van het acrosoom terwijl het GCaMP3-signaal zwak is (bijv. voorafgaand aan Ca2+ -binding, Figuur 2), en belangrijker nog, het maakt ook de identificatie mogelijk van acrosoom-intacte zaadcellen die geschikt zijn voor beeldvorming.
Het volgende protocol beschrijft het gebruik van het unieke AcroSensE-muismodel en de methoden voor microscopie die experimenteel worden gebruikt om de dynamiek van AE en spermacalcium met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Cornell University (#2002-0095). 8-10 weken oude AcroSensE-muizen2 werden gebruikt voor de huidige studie. Verzoeken om informatie over de beschikbaarheid van de AcroSensE-muizen kunnen worden ingediend bij de betreffende auteur.
1. Sperma verzamelen en wassen
- Verzamel cauda epididymaal sperma (meer details over deze procedure vindt u in11) van AcroSensE-muizen. Laat 15 minuten uitzwemmen in een weefselkweekschaaltje van 3,5 cm met 0,5 ml Modified Whitten's medium (MW) bij 37 °C. De schotel moet worden afgedekt om de verdamping van de MW te verminderen en moet worden gekanteld zodat het medium voldoende diepte heeft om de cauda epididymides te bedekken.
OPMERKING: Het medium (MW) van gemodificeerd Whitten omvat 22 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1 mM pyrodruivenzuur, 4.8 mM melkzuur hemi-Ca2+ zout, pH 7.35. Glucose (5,5 mM), NaHCO3 (10 mM) en 2-hydroxypropyl-cyclodextrine (CD; 3 mM) worden aangevuld (zie Materiaaltabel) als dat nodig is voor inductie van capaciteit, en concentraties kunnen worden gewijzigd voor specifieke experimenten. Bovendien kunnen alternatieve sterolacceptoren worden gebruikt in plaats van CD (bijv. runderserumalbumine of lipoproteïnen met hoge dichtheid). - Verwijder met een fijne pincet eventueel bijbalweefsel uit de opvangschaal voor het uitzwemmen. Breng het medium met het sperma over in een conische buis van 15 ml en centrifugeer de suspensie op 100 x g gedurende 1 minuut in een zwenkbare emmerrotor bij kamertemperatuur. Verwijder met een plastic pipet het MW-supernatans met het sperma uit alle grove weefselresten die bij deze stap zijn gepelleteerd.
- Breng het MW-supernatans dat het sperma bevat op een totaal volume van 3 ml door MW bij 37 °C toe te voegen. Centrifugeer op 400 x g gedurende 8 minuten (bij kamertemperatuur) in een buis met ronde bodem. Verwijder langzaam het supernatans MW uit het losjes gepelleteerde sperma.
- Als het levensvatbaar is, moet het sperma verschijnen als een "donzig" uitziende pellet. Resuspendeer het sperma voorzichtig via trituratie met een transferpipet met grote boring of via zachte handmatige tikken op de buis ("vingertikken"). Eenmaal gelijkmatig geresuspendeerd, brengt u ze over in een nieuwe buis met ronde bodem. Gebruik 10-20 μL van de spermasuspensie om de beweeglijkheid te tellen en te beoordelen. Verdun sperma in MW voor gebruik.
OPMERKING: Voor de meeste experimenten met de capaciteit van muizensperma wordt een uiteindelijke concentratie van 5-10 miljoen sperma/ml MW gebruikt. Het hier beschreven beeldvormingsprotocol vereist geen capaciteit van sperma, hoewel het noodzakelijk is dat sperma het vermogen verwerft om fysiologisch relevante acrosoomexocytose te ondergaan. Men zou pathologische exocytose of exocytose kunnen bestuderen die wordt geïnduceerd door reagentia zoals een calciumionofoor zonder het sperma te capaciteren. Daarnaast zou men mogelijke veranderingen in acrosomaal calcium in niet-capaciterende cellen kunnen onderzoeken als reactie op verschillende stimuli. - Gebruik het sperma binnen 3-5 uur na het verzamelen, waarbij u de tijd zo kort mogelijk houdt en consistent houdt tussen experimentele onderzoeken.
- Voer alle stappen van verzamelen en wassen uit bij 37 °C met behulp van MW-medium, waarbij methoden worden gebruikt om schade aan het membraan tot een minimum te beperken. Dit omvat het gebruik van plastic transferpipetten met een grote diameter of pipetpunten met een grote opening, die worden aanbevolen voor gebruik tijdens alle fasen van de procedure.
2. Poly-D-lysine-coating van dekglaasjes voor beeldvorming
OPMERKING: Poly-D-lysine (PDL) gerechten moeten voor elk experiment vers worden bereid.
- Doseer een druppel PDL van 0,5 μl (0,5 mg/ml, zie materiaaltabel) in het midden van een dekglaasje.
- Smeer met een gegradueerde punt van 10 μl de PDL-druppel over het dekglaasje (kriskras patroon zoals weergegeven in figuur 1B).
- Laat 10 minuten drogen bij 37 °C. Bewaar servies met PDL-coating afgedekt en op 37 °C tot gebruik.
3. Capillair trekken, laden voor puffen
- Trek de capillairen van borosilicaatglas (buitendiameter, 2 mm, binnendiameter, 1.56 mm, zie materiaaltabel) met behulp van de volgende instellingen: warmte: 330, trekkracht: 250, snelheid: 250 en tijd: 70. Deze stap moet worden geoptimaliseerd voor de specifieke trekker die wordt gebruikt.
- Vul voor elk experiment een enkel capillair met de stimulerende oplossing die 3-5x de concentratie van het stimulerende middel bevat (om rekening te houden met de snelle diffusie van de oplossing bij het puffen). Gebruik voor het vullen een fijn pincet om de capillaire punt op ongeveer 1-2 mm van het uiteinde open te breken. Dit zou een openingsdiameter van ∼5 μm moeten opleveren. Thermisch polijsten is niet nodig.
- Injecteer de stimulerende oplossing met behulp van een dunne plastic transferpipet langzaam in het capillair totdat driekwart van de lengte vol is.
- Verwijder eventuele luchtbellen die tijdens het vullen zijn ontstaan door zachtjes op het capillair te tikken.
- Monteer gevuld capillair op de micromanipulator (zie Tabel met materialen).
4. Voorbereiding van de toediening van stimulatie voor puffen
NOTITIE: Om het risico op letsel van de gebruiker tot een minimum te beperken, moet tijdens de uitvoering van de puffprocedure een veiligheidsbril worden gedragen.
- Stel de instellingen van het eencellige afgiftesysteem in om een puls van 10 s bij 5 psi te leveren.
- Sluit het capillair van borosilicaat aan op de pipethouder van het eencellige toedieningssysteem. Zorg ervoor dat de afdichtingen goed vastzitten.
- Terwijl u de capillaire punt observeert, brengt u een korte puf van 2 s bij 20 psi aan om ervoor te zorgen dat de oplossing inderdaad door het uiteinde van de punt wordt gedoseerd (een kleine druppel moet duidelijk zijn aan het einde van de punt).
5. Microscopie en beeldacquisitie
OPMERKING: Er zijn meerdere merken microscopen beschikbaar en kunnen worden gebruikt; Een minimale framerate van 3 frames/s is echter wenselijk. Houd er met betrekking tot temperatuur- en omgevingsregeling rekening mee dat de werkelijke temperatuur van het medium in de schaal moet worden bevestigd, bijvoorbeeld met behulp van een contactloze infraroodthermometer.
- Voeg 80 μL verdund sperma toe aan het midden van een poly-D-lysine-gecoate 35 mm dekglaasje. Voor de meeste experimenten met de capaciteit van muizensperma wordt een eindconcentratie van 5-10 miljoen zaadcellen/ml gebruikt.
- Voeg langzaam 3 ml warm (37 °C) MW-basismedium toe aan het sperma, aangevuld met 10 mM CaCl2.
OPMERKING: Men zou experimenten kunnen uitvoeren bij kamertemperatuur om cellulaire processen te vertragen, maar het is belangrijk op te merken dat, omdat capacitatie wordt gemedieerd door lipidenuitwisselingen en de vloeibaarheid van micro- en macrodomeinen, men in gedachten moet houden dat fysiologisch relevante capacitatie en acrosoomexocytose temperatuurafhankelijke processen zijn. - Monteer het schaaltje met het sperma op de microscoop (voorverwarmd tot 37 °C).
- Prikkel de GCaMP3 met behulp van een 488 nm laserlijn en bekijk met een 505-550 nm banddoorlaat (BP) filter. Prikkel de mCherry met behulp van een 555 nm laserlijn en bekijk met een 575-615 nm BP-filter.
- Gebruik een micromanipulator (het wordt aanbevolen om de manipulator te bevestigen aan de luchttafel waarop de microscoop is opgesteld.), plaats de punt van het capillair ongeveer 100 μm opzij en 5-10 μm boven het vlak van de betreffende cel.
OPMERKING: De stimulerende oplossingen worden gemaakt in een concentratie van 3-5x de normale concentratie om de snelle diffusie in het volume tussen het capillair en de cel te compenseren. - Start de beeldvormingssequentie op de microscoop.
- Breng zaadcellen in beeld met een hoge framesnelheid, bij voorkeur >10 frames/s. Hier werd een resonantiescanner gebruikt die beeldvorming met 33 ms/frame mogelijk maakt.
- Tien seconden na het starten van de beeldacquisitie op de microscoop, activeert u het eencellige afgiftesysteem om de 10 seconden trek van het stimulerende middel te starten.
- Beeldcellen voor een duur van 10-15 min.
- Gebruik het afgiftesysteem met één cel om meerdere cellen van een enkele schaal af te beelden volgens de locaties in figuur 1B.
OPMERKING: Onbehandeld/niet-gestimuleerd sperma onder de microscoop zou overwegend rood moeten lijken, met een lage intensiteit van het groene signaal. Spermakoppen moeten aan het dekglaasje worden bevestigd en levend sperma kan worden geïdentificeerd aan de hand van hun bewegende staarten. In sperma dat AE ondergaat, zal het groene signaal van GCaMP3 in eerste instantie toenemen, en zowel het rode signaal van mCherry als het groene signaal van GCaMP3 zullen verdwijnen als AE volledig is, zoals geïllustreerd in figuur 2. De vermindering van mCherry-fluorescentie biedt een meer specifieke indicator van het tijdstip waarop AE begint, omdat veranderingen in Ca2+- concentraties voortdurend veranderingen in de GCaMP3-fluorescentie-intensiteit zullen veroorzaken.
6. Beeld- en data-analyse
OPMERKING: Offline beeldanalyse wordt uitgevoerd met behulp van ImageJ (zie Tabel met materialen). Eerder werden verschillende tussenstappen gerapporteerd in het proces dat leidde tot AE, waaronder acrosomale calciumstijging (ACR) en volledige membraanfusie. Dit laatste leidt tot het verlies van mCherry-fluorescentie en vertegenwoordigt daarom volledige AE. In sommige cellen worden signalen waargenomen die lijken op pre-spike foot events (PSF) bij het gebruik van amperometrische benaderingen in onderzoeken naar exocytose (zie2 voor meer details). Er zijn verschillende optionele methoden beschikbaar voor het analyseren van de ruwe AcroSensE-gegevens om ACR, AE en de tussenstappen ervan te kwantificeren. Hieronder worden enkele van de basisanalysemethoden beschreven.
- Afhankelijk van de specifieke bestandsextensie van het microscoopsysteem, gebruikt u het gereedschap voor gesplitste kanalen (Image > Colors > Split Channels) om afzonderlijke vensters te genereren voor de GCaMP3- en mCherry-kanalen.
- Synchroniseer de afzonderlijke vensters met behulp van de tool "Venster synchroniseren" (Analyseer > Hulpprogramma's > Synchroniseer Windows).
- Selecteer een interessegebied (ROI) rond de spermakop in het rode kanaal om het acrosoomgebied op te nemen (Figuur 3A,B). Met de synchronisatietool kan dezelfde gebiedsselectie automatisch worden toegepast op het groene kanaal, waarin het sperma nog te zwak is om zichtbaar te zijn.
- Kies de plug-in "Z Profiler" (Plugins > Stacks > Z Profiler) of "Time Series Analyzer" (Plugins > Stacks > Time Series Analyzer) om de verandering in fluorescentie-intensiteit uit te zetten als functie van frames/tijd voor elk van de twee kanalen.
- Kopieer gegevens naar spreadsheetsoftware (bijv. Microsoft Excel) voor plotten en verdere analyse.
OPMERKING: Zodra de gegevens naar een spreadsheet zijn gekopieerd, kunnen meerdere parameters worden geëxtraheerd voor analyse, waaronder de volgende, zoals geïllustreerd in afbeelding 4.- Fusion Pore (FP) starttijd: meet de tijd vanaf tijdstip 0 tot het tijdstip waarop het GCaMP3-signaal begint te stijgen. Deze parameter geeft de vertraging aan tussen de stimulatie en de ACR-respons van het sperma.
- AE-starttijd: meet de tijd vanaf tijdstip 0 tot het tijdstip waarop het mCherry-signaal begint te vervallen. Deze parameter geeft de vertraging aan tussen de stimulatie en de AE-respons van het sperma. Deze parameter kan ook worden gebruikt om de vertraging tussen FP-vorming en AE-respons te berekenen.
- Piek FP-amplitude: meet het fluorescentiesignaal van de basis tot de piek van de GCaMP3-signaalstijging. Deze parameter geeft de totale toename van de ACR-respons aan.
- Verliessnelheid van mCherry: bepaal deze parameter door een lineaire of een exponentiële fit op het gedeelte van het mCherry-signaalverlies (zoals aangegeven door "helling" in figuur 4B).
NOTITIE: U kunt ook de vervalsnelheid bepalen met behulp van de restsignaalmethode (R) op verschillende tijdstippen (bijv. R60: duurtijd in seconden tot een restsignaal van 60% vanaf de basislijn van het mCherry-signaal). Deze parameter kan worden gebruikt om de snelheid te kwantificeren waarmee het acrosomale gehalte bij AE wordt verspreid. - Signaalafname voor mCherry-verlies: bepaal het verschil in amplitude tussen de baseline mCherry-fluorescentie-intensiteit en het signaal na AE. Deze parameter geeft de totale hoeveelheid acrosomale inhoud aan die op AE is verspreid.
- Teken de veranderingen in fluorescentie (F) voor zowel het rode als het groene kanaal als onbewerkte gegevens, of normaliseer ze met de initiële fluorescentie (F0) en druk ze uit als ΔF/F0. Dit laatste zorgt voor een betere visualisatie van de veranderingen in zowel rood als groen op een enkel perceel (zie bijvoorbeeld figuur 3D en figuur 3H).
OPMERKING: Ten slotte kunnen de verschillende gemeten parameters worden vergeleken tussen verschillende omstandigheden om de relatie tussen veranderingen in de acrosomale calciumconcentratie en AE te bepalen. Voor voorbeelden van verschillende experimentele conditievergelijkingen, zie referentie2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2 geeft een vereenvoudigde illustratie van de opeenvolging van fluorescentieveranderingen die worden verwacht na de succesvolle stimulatie van sperma. Het bovenste paneel van figuur 2 illustreert de veranderingen in de intensiteit van de GCaMP3-fluorescentie, waarbij het signaal aanvankelijk zwak is (de baseline acrosomale calciumconcentraties zijn lager dan GCaMP3 KD), en bij het binnendringen van calciumionen via fusieporiën neemt de fluorescentie in helderheid toe. Ten slotte is er bij AE een signaalverlies als gevolg van diffusie en het verlies van de sensor naar de extracellulaire ruimte. Het onderste paneel van figuur 2 illustreert de veranderingen in de intensiteit van de mCherry-fluorescentie, waarbij het initiële signaal helder is, en alleen bij AE en diffusie van de sensor samen met andere inhoud van de acrosomale matrix, is er een dimming van het rode signaal.
Figuur 3 geeft werkelijke meetgegevens voor de hierboven geïllustreerde stadia in twee levende spermacellen gestimuleerd met 125 μM van het ganglioside GM1 (voor meer details over hoe GM1 AE reguleert in sperma12), vastgelegd in een enkel gezichtsveld. Figuur 3A,B en Figuur 3E,F tonen de rode en groene signalen gemeten in twee spermacellen op tijdstip 0 (vóór stimulatie), waarbij aanvankelijk het mCherry-signaal helder is en de GCaMP3 zwak. Figuur 3C, Figuur 3G en Figuur 3D, Figuur 3H geven de Z Profiler-analyse voor de volledige duur van het experiment (ruwe gegevens of F/F0, respectievelijk). Invoegpanelen bieden een ingezoomde weergave van het tijdvenster waarin ACR en AE voorkomen.
Omdat sperma zowel zeer heterogeen als zeer gevoelig is voor membraanbeschadiging als gevolg van verschillende behandelingsprocedures, geeft figuur 5 voorbeelden van twee soorten negatieve resultaten. Figuur 5A,C toont verschillende spermacellen die binnen één gezichtsveld zijn gevangen. De gele omtrek markeert twee zaadcellen die een hoog GCaMP3-signaal vertonen op tijdstip 0 (vóór stimulatie). In de huidige experimenten werden dergelijke cellen vermeden, omdat ze aangeven dat het acrosomale blaasje al een membraanfusieproces doormaakt of dat ze enige membraanbeschadiging hebben opgelopen waardoor calcium kan lekken. Het sperma in figuur 5A, aangegeven door de pijl (cirkel-ROI in figuur 5A,C) vertoont een initieel mCherry-signaal, maar geen respons in de rode of groene kanalen (respectievelijk figuur 5B,D, met het Z-Profiler-analysevenster zoals geleverd door ImageJ) na stimulatie met 125 μM GM1. Hoewel een subpopulatie van sperma, zoals die in dit voorbeeld, geen respons op stimulatie vertoont, worden deze meegenomen in de uiteindelijke analyse en berekend in de analyse van de responsgegevensanalyse2 (Figuur 3).
Figuur 1: Instrumentatie en experimentele opstelling. (A) Levende zaadcellen op een met PDL beklede dekglaasjesschotel in een incubatiekamer bij 37 °C. Een capillair van borosilicaat, getrokken en bevestigd aan een eencellig afgiftesysteem, wordt in de buurt van de zaadcel in het midden van het beeldvormingsgebied geplaatst voor directe toediening van stimulerende middelen. Zowel groene (GCaMP3) als rode (mCherry) kanalen worden continu bewaakt en opgenomen met een hoge framesnelheid (bijv. 10 frames/s) tijdens stimulatie. (B) Schematische weergave van het PDL-afzettingspatroon op de afdekschotel. (C) Schematische weergave van de specifieke gebieden op de schaal waar sperma kan worden gestimuleerd met behulp van het capillair om niet-specifieke stimulatie van eerdere trekjes in dezelfde schaal te minimaliseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Veranderingen in fluorescentiesignaal en -intensiteit. Bovenste paneel: Een toename van het GCaMP3-signaal duidt op calciuminstroom in het acrosoom, gevolgd door signaalverlies als gevolg van diffusie van het AcroSensE-fusie-eiwit. Onderste paneel: mCherry-signaal blijft stabiel tijdens de initiële membraanfusie, met daaropvolgende dimming bij AcroSensE-diffusie en acrosomale exocytose (AE). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve gegevens en fluorescentiesporen. Er werd een veld met twee zaadcellen in beeld gebracht. Groen/rood kanaal fluorescentie werd offline gekwantificeerd met behulp van ImageJ en uitgezet in Excel (zoals beschreven in stap 6). (A-D) Kwantificering van de fluorescentie-intensiteit van het rode (A) en groene (B) kanaal voor cel #1 in de loop van de tijd, berekend voor geselecteerde ROI's en vervolgens gepresenteerd als onbewerkte gegevens (C) of genormaliseerd naar het oorspronkelijke signaal (D, F/F0). De invoeging in (D) biedt een ingezoomde weergave van het tijdsbestek van 25-125 s. (E-H) Kwantificering van de fluorescentie-intensiteit van het rode (E) en groene (F) kanaal voor cel #2 in de loop van de tijd, berekend voor geselecteerde ROI's en vervolgens gepresenteerd als onbewerkte gegevens (G) of genormaliseerd naar het oorspronkelijke signaal (H, F/F0). De insert in (H) geeft een ingezoomde weergave van het tijdsbestek van 25-125 s. Schaalbalk = 5 μm. Alle x-assen geven de tijd weer in seconden (s). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Parameters voor gegevensanalyse en kwantificering. (A) Illustratie van een typisch GCaMP3-fluorescentie-intensiteitsspoor, met kwantificeerbare parameters, waaronder starttijd (seconden), amplitude (fluorescentie-intensiteit) en duur (seconden). (B) Illustratie van een typisch mCherry-fluorescentie-intensiteitsspoor, met kwantificeerbare parameters, waaronder starttijd (seconden), duur (seconden), helling (F/s), R60 (fluorescentie-intensiteit) en amplitude (fluorescentie-intensiteit). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Negatieve resultaten. (A,C) mCherry (rood) en GCaMP3 (groen) kanalen tonen meerdere zaadcellen gevangen in een enkel gezichtsveld. De pijl in (A) geeft een zaadcel aan die aanvankelijk mCherry-fluorescentie vertoont, maar geen daaropvolgende fluorescentie-intensiteitsveranderingen vertoont als reactie op 125 μM GM1-stimulatie, zoals waargenomen in de door Z-Profiler gegenereerde sporen in (B) (mCherry) en (D) (GCaMP3). Cellen binnen de gele rechthoek vertonen een verhoogde GCaMP3-fluorescentie-intensiteit op tijdstip 0, vóór stimulatie. Schaalbalk = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier wordt een op microscopie gebaseerde methode beschreven om het nieuw gegenereerde AcroSensE-muismodel te gebruiken voor real-time, single-cell monitoring en analyse van het samenspel tussen acrosomale calciumdynamiek en tussenstappen die leiden tot AE. Samen met direct beschikbare genetische benaderingen, zoals kruising met andere genetische muismodellen of genbewerking, bieden dit model en deze methode een krachtig systeem om de rol te bestuderen van verschillende componenten en routes die deelnemen aan spermasignaleringsroutes die verband houden met capacitatie, AE en bevruchting.
Kritische stappen
Het is belangrijk om bij alle stappen voor het hanteren van sperma plastic transferpipetten met een grote diameter of pipetpunten met grote opening te gebruiken en om alle stappen van verzamelen en wassen bij 37 °C uit te voeren om schade aan het membraan tot een minimum te beperken. Evenzo heeft een rotor met een zwenkbare emmer de voorkeur boven een rotor met een vaste hoek om schade aan het membraan te voorkomen als gevolg van cellen die in wisselwerking staan met de zijwand van de microcentrifugebuis. Als Z-positiedriftcorrectie beschikbaar is, wordt het ten zeerste aanbevolen om hardware/software voor z-positiecorrectie toe te passen om te voorkomen dat het afgebeelde sperma tijdens het beeldvormingsinterval uit het brandpuntsvlak drijft.
Wijzigingen en probleemoplossing
Het hier beschreven protocol is geoptimaliseerd voor studies van lipide-gemedieerde signalering 2,3 en kan worden toegepast op zowel gecapaciteerd als niet-capacitatief sperma. Er kunnen verschillende methoden voor spermacapacitatie worden gebruikt; Albumine of cyclodextrine kunnen bijvoorbeeld dienen als sterolacceptoren. Daarnaast kunnen verschillende energiesubstraten of bicarbonaat worden toegevoegd of weggelaten. Houd er echter rekening mee dat bicarbonaat zich zal vormen in waterige media door blootstelling aan lucht, dus het testen van echt 'bicarbonaatvrije' omstandigheden zou een zorgvuldig gebruik van een stikstofomgeving vereisen in alle stappen van het maken/voorbereiden/hanteren van het medium en het uitvoeren van het experiment. Het bovenstaande protocol omvat het gebruik van 10 mM calcium toegevoegd aan de experimentele oplossing; calciumionen kunnen echter worden weggelaten, gechelateerd (bijv. EGTA) of in lagere concentraties worden toegevoegd voor calciumgevoelige experimentele toepassingen. Houd er rekening mee dat het verlagen of weglaten van calciumconcentraties het verwachte GCaMP3-signaal bij AE2 zal verminderen. Bovendien kan men voor dit protocol andere media gebruiken (in tegenstelling tot de hier gebruikte MW) die beter passen bij hun experimentele opzet en doelstellingen. Het meegeleverde protocol beschrijft het gebruik van single-cell beeldvorming en single-cell toediening van stimulerende middelen; Een vereenvoudigde variatie is echter mogelijk door bulkstimulatie, bijvoorbeeld door het stimulerende reagens aan het hele gerecht toe te voegen en niet door te puffen. Daarnaast zijn ook experimenten met de hele populatie mogelijk met behulp van het AcroSensE-model via het gebruik van fluorimeters of plaatlezers met fluorescentiemogelijkheden.
Beperkingen
De methode die hier wordt gegeven, vereist de beschikbaarheid, het onderhoud en het gebruik van een AcroSensE-muizenkolonie. De methode is ook afhankelijk van de beschikbaarheid van een geavanceerd beeldvormingssysteem, dat kostbaar is en opgeleid personeel vereist. Voor sommige experimentele toepassingen is een mogelijke beperking het onvermogen om gelijktijdig cytosolisch calcium in AcroSensE-sperma te meten, aangezien veel beschikbare synthetische calciumindicatoren een vergelijkbare golflengte hebben als GCaMP3. Hoewel dit buiten het bereik van dit protocol valt, kunnen mogelijke beperkingen van experimenten op populatieniveau het lezen van het mCherry-signaal na AE en verspreiding in het medium of GCaMP3-signaal afkomstig van dode/gepermeabiliseerde cellen omvatten. Om dergelijke methoden te optimaliseren, zou men kunnen onderzoeken of z-focus kan worden gebruikt om achtergrondruis van uitgescheiden mCherry te minimaliseren, en/of schijnbehandelde controles te gebruiken om basiskwantificering van GCaMP van dood of doormeabiliseerd sperma te garanderen.
De betekenis van de methode ten opzichte van bestaande/alternatieve methoden
In de afgelopen twee decennia zijn er meldingen geweest van verschillende methoden voor real-time studies van AE-dynamiek in levend sperma, waaronder acrosoomgerichte GFP-transgene muizen7, calciumkleurstoffen die in het acrosoom zijn geladen (bijv. Fluo-412), of met behulp van exocytose-specifieke indicatoren zoals de synthetische kleurstof FM-6413. In vergelijking met deze methoden biedt het AcroSensE-model echter het gemak van het gebruik van minimaal behandeld sperma waarvoor geen kleurstofbelasting of andere mogelijk membraanverstorende procedures nodig zijn. Belangrijk is dat er een groot voordeel is aan het hebben van sperma dat een dubbele indicator tot expressie brengt die de acrosomale calciumdynamiek, membraanfusie en porievorming kan volgen, evenals AE en de daaruit voortvloeiende afgifte van de acrosomale inhoud.
Belang en mogelijke toepassingen van de methode in specifieke onderzoeksgebieden
Merk op dat de onderstaande experimentele toepassingsvoorbeelden kunnen worden uitgevoerd als eencellige of populatietests, waarbij de laatste aanzienlijke voordelen heeft wanneer analyse met hoge doorvoer gewenst is. Studies van AE-dynamiek in verschillende muismodellen kunnen worden uitgevoerd door middel van kruising met het AcroSensE-muismodel, waaronder (1) null- of gemuteerde vormen van verschillende calciumkanalen of calciumkanaalsubeenheden (bijv. kruising met α1E- en CatSper-null-modellen); (2) nul- of gemuteerde vormen van eiwitten die membraanfusie mediëren (bijv. SNARE's). Daarnaast kunnen studies worden uitgevoerd om te onderzoeken hoe verschillende farmacologische middelen met betrekking tot verschillende signaalroutes de acrosomale calcium- en AE-dynamiek moduleren. Verder kan onderzoek worden gedaan naar hoe veranderingen in het milieu AE beïnvloeden, waaronder temperatuur, pH en de aanwezigheid of concentratie van verschillende ionen of kleine moleculen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er zijn geen auteurs die belangenconflicten te melden hebben met betrekking tot dit werk.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health-subsidies R01-HD093827 en R03-HD090304 (A.J.T).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
References
- Austin, C. R. Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg. Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).
- Cohen, R., et al. A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis. J Biol Chem. 298 (5), 101868 (2022).
- Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J.
- Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm. J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).
- Sosa, C. M., et al. Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis). Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).
- Balestrini, P. A., et al. Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time. Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).
- Nakanishi, T., et al. Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein. FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).
- Kim, K. S., Gerton, G. L. Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm. Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).
- Hasuwa, H., et al. Transgenic mouse sperm that have green acrosome and red mitochondria allow visualization of sperm and their acrosome reaction in vivo. Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science. 59 (1), 105-107 (2010).
- Henderson, M. J., et al. A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store. PloS one. 10 (10), 0139273 (2015).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. J Biol Chem. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Cohen, R., et al. Lipid modulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis and fertilization. Dev Cell. 28 (3), 310-321 (2014).
- Sanchez-Cardenas, C., et al. Acrosome reaction and Ca(2)(+) imaging in single human spermatozoa: new regulatory roles of [Ca(2)(+)]i. Biol Reprod. 91 (2), 67 (2014).
