Summary
Das hier beschriebene AcroSensE-Mausmodell und die hier beschriebenen Live-Cell-Imaging-Methoden bieten einen neuen Ansatz zur Untersuchung der Kalziumdynamik im subzellulären Kompartiment des Spermienakrosoms und wie sie Zwischenschritte regulieren, die zur Membranfusion und Akrosomen-Exozytose führen.
Abstract
Die Akrosom-Exozytose (AE), bei der das einzelne exozytotische Vesikel der Spermien mit der Plasmamembran verschmilzt, ist ein komplexer, kalziumabhängiger Prozess, der für die Befruchtung unerlässlich ist. Unser Verständnis darüber, wie die Kalziumsignalisierung die AE reguliert, ist jedoch noch unvollständig. Insbesondere das Zusammenspiel zwischen intraakrosomaler Kalziumdynamik und den Zwischenschritten, die zur AE führen, ist nicht gut definiert. Hier beschreiben wir eine Methode, die räumliche und zeitliche Einblicke in die akrosomale Kalziumdynamik und deren Beziehung zur Membranfusion und anschließenden Exozytose des Akrosomvesikels liefert. Die Methode verwendet eine neuartige transgene Maus, die einen Akrosomen-gerichteten Sensor für Exozytose (AcroSensE) exprimiert. Der Sensor kombiniert einen genetisch kodierten Kalziumindikator (GCaMP), der mit mCherry fusioniert ist. Dieses Fusionsprotein wurde speziell entwickelt, um die gleichzeitige Beobachtung von akrosomaler Kalziumdynamik und Membranfusionsereignissen zu ermöglichen. Die Echtzeitüberwachung der akrosomalen Kalziumdynamik und AE in lebenden AcroSensE-Spermien wird durch eine Kombination aus Bildgebung mit hoher Bildrate und einem Stimulanzien-Verabreichungssystem erreicht, das auf einzelne Spermien abzielen kann. Dieses Protokoll enthält auch mehrere Beispiele für grundlegende Methoden zur Quantifizierung und Analyse der Rohdaten. Da das AcroSensE-Modell genetisch kodiert ist, kann seine wissenschaftliche Bedeutung durch die Verwendung leicht verfügbarer genetischer Werkzeuge wie Kreuzungen mit anderen genetischen Modellen der Maus oder auf der Genom-Editierung (CRISPR) basierende Methoden erhöht werden. Mit dieser Strategie können die Rollen zusätzlicher Signalwege bei der Spermienkapazität und -befruchtung aufgeklärt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier beschriebene Methode ein bequemes und effektives Werkzeug darstellt, um die Kalziumdynamik in einem bestimmten subzellulären Kompartiment - dem Spermienakrosom - zu untersuchen und wie diese Dynamik die Zwischenschritte reguliert, die zur Membranfusion und Akrosomen-Exozytose führen.
Introduction
Spermien erwerben die Fähigkeit zur Befruchtung während eines Prozesses, der als Kapazitation1 bezeichnet wird. Ein Endpunkt dieses Prozesses ist, dass die Spermien die Fähigkeit erwerben, AE zu durchlaufen. Daten aus mehr als zwei Jahrzehnten belegen das Vorhandensein eines komplexen, mehrstufigen Modells der AE in Säugetierspermien (zusammengefasst in 2,3). Die Untersuchung von AE in lebenden Spermien ist jedoch eine Herausforderung, und die derzeit verfügbaren Methoden zur Überwachung dieses Prozesses mit ausreichender Auflösung sind umständlich und erfordern mehrere Präparationsschritte4, beschränken sich auf den Nachweis des letzten Schritts der AE (z. B. unter Verwendung von PNA5), beschränken sich auf Messungen von Veränderungen des zytosolischen Kalziums (im Gegensatz zur akrosomalen Kalziumdynamik), oder beschränken sich auf Messungen der zytosolischen Kalziumdynamik oder der AE6.
Um einige der wichtigsten Einschränkungen von Echtzeit-AE-Studien unter physiologischen Bedingungen zu überwinden und die Untersuchung des Zusammenspiels zwischen Kalziumdynamik und AE zu ermöglichen, wurde ein einzigartiges Mausmodell generiert. In diesem Mausmodell wird ein Fusionsprotein, das aus dem genetisch kodierten Ca2+-Sensor (GCaMP3) und mCherry besteht, exprimiert und mit Hilfe eines Acrosin-Promotors und eines Signalpeptids2 auf das Akrosom ausgerichtet. Der gezielte duale GCaMP3-mCherry-Sensor ermöglicht die gleichzeitige Echtzeitmessung der Kalziumkonzentration und des Status des akrosomalen Inhalts in lebenden Spermien unter physiologischen Bedingungen unter Verwendung von Mikroskopie und einem Einzelzell-Stimulanzien-Verabreichungssystem (Abbildung 1). Als Bestandteil der akrosomalen Matrix würden Membranfusion und AE zum Verlust der photostabilen und pH-unempfindlichen mCherry-Fluoreszenz aus den Spermien führen, da dieses Protein aus dem Akrosomvesikel diffundiert. In dieser Hinsicht ist die Fähigkeit des Modells, den Zeitpunkt und das Auftreten von AE zu reflektieren, vergleichbar mit den Vorteilen der Akrosom-gerichteten GFP-Mauslinie 7,8,9.
Die in dieser transgenen Mauslinie verwendete GCaMP3-Variante hat eine ungefähre KD von 400 μM und einen Dynamikbereich für Ca2+ von 10-4-10-3 M10, der für dieses Vesikel geeignet ist. Wir konnten zeigen, dass diese Kombination von Eigenschaften von GCaMP3 die Bildung von Fusionsporen zwischen der Plasmamembran und der äußeren akrosomalen Membran (OAM) aufdecken kann2. Die Fusionsporendetektion ist darauf zurückzuführen, dass die Porengröße zu klein ist, um es dem AcroSensE-Protein zu ermöglichen, sich aus dem Akrosom zu dispergieren (durch Verlust des Akrosomgehalts), während gleichzeitig ein Membran-"Kanal" bereitgestellt wird, der den Einstrom von Ca2+-Ionen in das Akrosomlumen ermöglicht, was zu einer Erhöhung der Fluoreszenzintensität des GCaMP3 führt.
Das helle, monomere, nicht-kalziumempfindliche fluoreszierende Protein mCherry unterstützt die Visualisierung des Akrosoms, während das GCaMP3-Signal schwach ist (z. B. vor der Ca2+ -Bindung, Abbildung 2), und ermöglicht vor allem auch die Identifizierung von Akrosom-intakten Samenzellen, die für die Bildgebung geeignet sind.
Das folgende Protokoll beschreibt die Verwendung des einzigartigen AcroSensE-Mausmodells und der Methoden für die Mikroskopie, die experimentell verwendet werden, um die Kalziumdynamik von AE und Spermien mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu untersuchen.
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Protocol
Alle Tierbehandlungen wurden gemäß den Richtlinien durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee der Cornell University genehmigt (#2002-0095). Für die vorliegende Studie wurden 8-10 Wochen alte AcroSensE-Mäuse2 verwendet. Anfragen zur Verfügbarkeit der AcroSensE-Mäuse können an den korrespondierenden Autor gerichtet werden.
1. Samenentnahme und -wäsche
- Entnahme von Cauda-Nebenhodenspermien (weitere Details zu diesem Verfahren finden Sie inAbschnitt 11) von AcroSensE-Mäusen. 15 Minuten in einer 3,5 cm großen Gewebekulturschale mit 0,5 ml modifiziertem Whitten-Medium (MW) bei 37 °C einschwimmen lassen. Die Schale sollte abgedeckt werden, um die Verdunstung des MW zu reduzieren, und so gekippt werden, dass das Medium genügend Tiefe hat, um die Cauda-Nebenhoden zu bedecken.
ANMERKUNG: Modifiziertes Whitten-Medium (MW) enthält 22 mM HEPES, 1,2 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1 mM Brenztraubensäure, 4,8 mM Milchsäure-Hemi-Ca2+ -Salz, pH 7,35. Glucose (5,5 mM), NaHCO3 (10 mM) und 2-Hydroxypropyl--cyclodextrin (CD; 3 mM) werden nach Bedarf für die Induktion der Kapazität ergänzt (siehe Materialtabelle), und die Konzentrationen können für spezifische Experimente modifiziert werden. Darüber hinaus könnten anstelle von CD alternative Sterolakzeptoren verwendet werden (z. B. Rinderserumalbumin oder Lipoproteine hoher Dichte). - Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette jegliches Nebenhodengewebe aus der Auffangschale. Das Medium, das das Sperma enthält, wird in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführt und die Suspension bei 100 x g für 1 Minute in einem schwingenden Rotor bei Raumtemperatur zentrifugiert. Entfernen Sie mit einer Plastikpipette den MW-Überstand, der das Sperma enthält, aus allen groben Gewebetrümmern, die bei diesem Schritt pelletiert wurden.
- Bringen Sie den MW-Überstand, der die Spermien enthält, durch Zugabe von MW bei 37 °C auf ein Gesamtvolumen von 3 ml. Bei 400 x g für 8 min (bei Raumtemperatur) in einem Röhrchen mit rundem Boden zentrifugieren. Entfernen Sie langsam den MW-Überstand aus dem lose pelletierten Sperma.
- Wenn es lebensfähig ist, sollte das Sperma als "flauschiges" aussehendes Kügelchen erscheinen. Resuspendieren Sie die Spermien vorsichtig durch Reiben mit einer Transferpipette mit großer Bohrung oder durch sanftes manuelles Klopfen auf den Eileiter ("Fingerschnippen"). Sobald sie gleichmäßig wieder aufgehängt sind, geben Sie sie in ein neues Rundbodenröhrchen. Verwenden Sie 10-20 μl der Spermiensuspension, um die Beweglichkeit zu zählen und zu beurteilen. Verdünnen Sie das Sperma für die Verwendung in MW.
HINWEIS: Für die meisten Experimente, bei denen die Spermienkapazität von Mäusen verwendet wird, wird eine Endkonzentration von 5-10 Millionen Spermien/ml MW verwendet. Das hier beschriebene Bildgebungsprotokoll erfordert keine Kapazitation von Spermien, obwohl es notwendig ist, dass die Spermien die Fähigkeit erwerben, eine physiologisch relevante Akrosomen-Exozytose zu durchlaufen. Man könnte pathologische Exozytose oder Exozytose untersuchen, die durch Reagenzien wie einen Kalziumionophor induziert wird, ohne die Spermien zu kapazitivieren. Darüber hinaus könnte man mögliche Veränderungen des akrosomalen Kalziums in nicht-kapazitierten Zellen als Reaktion auf verschiedene Stimuli untersuchen. - Verwenden Sie das Sperma innerhalb von 3-5 Stunden nach der Entnahme und halten Sie die Zeit so kurz wie möglich und konsistent zwischen den experimentellen Versuchen.
- Führen Sie alle Schritte des Sammelns und Waschens bei 37 °C unter Verwendung von MW-Medium durch und verwenden Sie Methoden zur Minimierung von Membranschäden. Dazu gehört die Verwendung von Kunststoff-Transferpipetten mit großem Durchmesser oder Pipettenspitzen mit großer Öffnung, die für den Einsatz in allen Phasen des Verfahrens empfohlen werden.
2. Poly-D-Lysin-Beschichtung von Deckglasschalen für die Bildgebung
HINWEIS: Poly-D-Lysin (PDL)-Gerichte sollten vor jedem Experiment frisch zubereitet werden.
- Geben Sie einen 0,5-μl-Tropfen PDL (0,5 mg/ml, siehe Materialtabelle) in die Mitte einer Deckglasschale.
- Schmieren Sie den PDL-Tropfen mit einer 10-μl-Messspitze über das Deckglas (kreuz und quer, wie in Abbildung 1B gezeigt).
- 10 Min. bei 37 °C trocknen lassen. PDL-beschichtetes Geschirr bis zur Verwendung abgedeckt bei 37 °C aufbewahren.
3. Kapillarziehen, Laden zum Puffen
- Ziehen Sie die Kapillaren aus Borosilikatglas (Außendurchmesser, 2 mm, Innendurchmesser, 1,56 mm, siehe Materialtabelle) mit den folgenden Einstellungen: Wärme: 330, Zug: 250, Geschwindigkeit: 250 und Zeit: 70. Dieser Schritt sollte für den jeweiligen verwendeten Abzieher optimiert werden.
- Beladen Sie vor jedem Experiment eine einzelne Kapillare mit der stimulierenden Lösung, die die 3-5-fache Konzentration des Stimulans enthält (um die schnelle Diffusion der Lösung beim Aufblasen zu berücksichtigen). Vor dem Befüllen mit einer feinen Pinzette die Kapillarspitze ca. 1-2 mm vom Ende entfernt aufbrechen. Dadurch sollte ein Öffnungsdurchmesser von ∼5 μm entstehen. Ein Hitzepolieren ist nicht erforderlich.
- Injizieren Sie die stimulierende Lösung mit einer dünnen Kunststoff-Transferpipette langsam in die Kapillare, bis drei Viertel ihrer Länge voll sind.
- Entfernen Sie alle Luftblasen, die sich beim Befüllen gebildet haben, indem Sie die Kapillare vorsichtig anschnippen.
- Montieren Sie die gefüllte Kapillare auf dem Mikromanipulator (siehe Materialtabelle).
4. Vorbereitung der Verabreichung der Stimulation zum Puffen
HINWEIS: Um das Verletzungsrisiko des Benutzers zu minimieren, sollte während des Vorgangs eine Schutzbrille getragen werden.
- Richten Sie die Einstellungen des Einzelzellen-Verabreichungssystems so ein, dass ein 10-Sekunden-Impuls bei 5 psi bereitgestellt wird.
- Verbinden Sie die Borosilikatkapillare mit dem Pipettenhalter des Einzelzell-Verabreichungssystems. Stellen Sie sicher, dass die Dichtungen fest sind.
- Während Sie die Kapillarspitze beobachten, wenden Sie einen kurzen Zug von 2 s bei 20 psi an, um sicherzustellen, dass die Lösung tatsächlich durch das Ende der Spitze abgegeben wird (ein kleiner Tropfen sollte am Ende der Spitze sichtbar sein).
5. Mikroskopie und Bildaufnahme
HINWEIS: Mikroskope verschiedener Marken sind erhältlich und können verwendet werden. Eine Mindestbildrate von 3 Bildern/s ist jedoch wünschenswert. Bei der Temperatur- und Umgebungskontrolle ist zu beachten, dass die tatsächliche Temperatur des Mediums in der Schale z.B. mit einem berührungslosen Infrarot-Thermometer bestätigt werden sollte.
- Geben Sie 80 μl verdünntes Sperma in die Mitte einer mit Poly-D-Lysin beschichteten 35-mm-Deckglasschale. Für die meisten Experimente, bei denen die Spermienkapazität von Mäusen verwendet wird, wird eine Endkonzentration von 5-10 Millionen Spermien/ml verwendet.
- Dem Sperma langsam 3 ml warmes (37 °C) MW-Basismedium mit 10 mM CaCl2 hinzufügen.
ANMERKUNG: Man könnte Experimente bei Raumtemperatur durchführen, um zelluläre Prozesse zu verlangsamen, aber es ist wichtig zu beachten, dass man bedenken muss, dass physiologisch relevante Kapazitation und Akrosomen-Exozytose temperaturabhängige Prozesse sind, da die Kapazität durch den Lipidaustausch und die Fluidität von Mikro- und Makrodomänen vermittelt wird. - Montieren Sie die Schale mit dem Sperma auf das Mikroskop (vorgeheizt auf 37 °C).
- Der GCaMP3 wird mit einer 488-nm-Laserlinie angeregt und mit einem 505-550-nm-Bandpassfilter (BP) betrachtet. Stimulieren Sie die mCherry mit einer 555-nm-Laserlinie an und betrachten Sie sie mit einem 575-615-nm-BP-Filter.
- Mit einem Mikromanipulator (es wird empfohlen, den Manipulator an dem Lufttisch zu befestigen, auf dem das Mikroskop aufgestellt wurde) positionieren Sie die Spitze der Kapillare etwa 100 μm seitlich und 5-10 μm über der Ebene der interessierenden Zelle.
HINWEIS: Die stimulierenden Lösungen werden mit dem 3-5-fachen der normalen Konzentration hergestellt, um die schnelle Diffusion im Volumen zwischen der Kapillare und der Zelle auszugleichen. - Starten Sie die Bildgebungssequenz auf dem Mikroskop.
- Bilden Sie Samenzellen mit einer hohen Bildrate ab, vorzugsweise >10 Bilder/s. Hier wurde ein Resonanzscanner verwendet, der eine Bildgebung mit 33 ms/Bild ermöglicht.
- Zehn Sekunden nach Beginn der Bildaufnahme am Mikroskop aktivieren Sie das Einzelzell-Abgabesystem, um den 10-Sekunden-Stimulansstoß einzuleiten.
- Bildzellen für eine Dauer von 10-15 Minuten.
- Mit dem Einzelzellen-Verabreichungssystem können Sie mehrere Zellen aus einer einzigen Schale gemäß den in Abbildung 1B angegebenen Positionen abbilden.
HINWEIS: Unbehandelte/nicht stimulierte Spermien sollten unter dem Mikroskop überwiegend rot erscheinen, mit einer geringen Intensität des grünen Signals. Die Spermienköpfe sollten am Deckglas befestigt werden, und lebende Spermien können an ihren sich bewegenden Schwänzen identifiziert werden. Bei Spermien, die AE durchlaufen, nimmt das grüne Signal von GCaMP3 zunächst zu, und sowohl das rote mCherry-Signal als auch das grüne Signal von GCaMP3 verschwinden, wenn die AE abgeschlossen ist, wie in Abbildung 2 dargestellt. Die Reduktion der mCherry-Fluoreszenz liefert einen spezifischeren Indikator für den Zeitpunkt, zu dem die AE beginnt, da Änderungen der Ca2+ -Konzentrationen kontinuierlich zu Änderungen der GCaMP3-Fluoreszenzintensität führen.
6. Bild- und Datenanalyse
HINWEIS: Die Offline-Bildanalyse wird mit ImageJ durchgeführt (siehe Materialtabelle). Zuvor wurden mehrere Zwischenschritte im Prozess beschrieben, die zu AE führen, einschließlich des akrosomalen Kalziumanstiegs (ACR) und der vollständigen Membranfusion. Letzteres führt zum Verlust der mCherry-Fluoreszenz und stellt somit eine vollständige AE dar. In einigen Zellen werden Signale beobachtet, die den Pre-Spike Foot Events (PSF) ähneln, wenn amperometrische Ansätze in Studien zur Exozytose verwendet werden (weitere Details finden Sie unter2). Für die Analyse der AcroSensE-Rohdaten stehen mehrere optionale Methoden zur Verfügung, um ACR, AE und ihre Zwischenschritte zu quantifizieren. Im Folgenden werden einige der grundlegenden Analysemethoden beschrieben.
- Abhängig von der jeweiligen Dateierweiterung des Mikroskopsystems können Sie mit dem Split-Channel-Tool (Image > Colors > Split Channels) individuelle Fenster für die GCaMP3- und mCherry-Kanäle generieren.
- Synchronisieren Sie die einzelnen Fenster mit dem Tool "Fenster synchronisieren" (Analyze > Tools > Synchronize Windows).
- Wählen Sie eine Region of Interest (ROI) um den Spermienkopf im roten Kanal aus, um die Akrosomregion einzubeziehen (Abbildung 3A,B). Mit dem Synchronize-Tool kann die gleiche Bereichsauswahl automatisch auf den grünen Kanal angewendet werden, in dem die Spermien noch zu dunkel sind, um sichtbar zu sein.
- Wählen Sie das Plugin "Z Profiler" (Plugins > Stacks > Z Profiler) oder "Time Series Analyzer" (Plug-ins > Stacks > Time Series Analyzer), um die Änderung der Fluoreszenzintensität als Funktion von Frames/Zeit für jeden der beiden Kanäle darzustellen.
- Kopieren Sie Daten in eine Tabellenkalkulationssoftware (z. B. Microsoft Excel), um sie zu zeichnen und weiter zu analysieren.
HINWEIS: Nachdem die Daten in eine Tabelle kopiert wurden, können mehrere Parameter für die Analyse extrahiert werden, einschließlich der folgenden, wie in Abbildung 4 dargestellt.- Startzeit der Fusionspore (FP): Messen Sie die Zeit vom Zeitpunkt 0 bis zu dem Zeitpunkt, an dem das GCaMP3-Signal zu steigen beginnt. Dieser Parameter gibt die Verzögerung zwischen der Stimulation und der ACR-Antwort der Spermien an.
- AE-Startzeit: Messen Sie die Zeit vom Zeitpunkt 0 bis zu dem Zeitpunkt, an dem das mCherry-Signal abzuklingen beginnt. Dieser Parameter gibt die Verzögerung zwischen der Stimulation und der AE-Reaktion der Spermien an. Dieser Parameter könnte auch verwendet werden, um die Verzögerung zwischen FP-Bildung und AE-Antwort zu berechnen.
- Peak-FP-Amplitude: Messen Sie das Fluoreszenzsignal von der Basis bis zum Peak des GCaMP3-Signalanstiegs. Dieser Parameter gibt den Gesamtanstieg der ACR-Antwort an.
- Verlustrate von mCherry: Bestimmen Sie diesen Parameter durch eine lineare oder exponentielle Anpassung an den Abschnitt des mCherry-Signalverlusts (wie in Abbildung 4B durch "Steigung" angegeben).
HINWEIS: Alternativ können Sie die Abklingrate mit der Restsignalmethode (R) zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmen (z. B. R60: Dauer in Sekunden bis zu einem Restsignal von 60 % von der Basislinie des mCherry-Signals). Dieser Parameter kann verwendet werden, um die Rate zu quantifizieren, mit der der akrosomale Inhalt bei AE dispergiert wird. - Signalabnahme für mCherry-Verlust: Bestimmen Sie die Amplitudendifferenz zwischen der mCherry-Fluoreszenzintensität und dem Signal nach AE. Dieser Parameter gibt die Gesamtmenge des akrosomalen Inhalts an, der bei AE dispergiert ist.
- Zeichnen Sie die Änderungen der Fluoreszenz (F) sowohl für den roten als auch für den grünen Kanal als Rohdaten auf oder normalisieren Sie sie durch die anfängliche Fluoreszenz (F0) und drücken Sie sie als ΔF/F0 aus. Letzteres ermöglicht eine bessere Visualisierung der Änderungen von Rot und Grün in einem einzigen Diagramm (siehe z. B. Abbildung 3D und Abbildung 3H).
HINWEIS: Schließlich können die verschiedenen gemessenen Parameter zwischen verschiedenen Bedingungen verglichen werden, um die Beziehung zwischen Änderungen der akrosomalen Kalziumkonzentration und AE zu bestimmen. Beispiele für verschiedene experimentelle Zustandsvergleiche finden Sie in Referenz2.
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Representative Results
Abbildung 2 zeigt eine vereinfachte Darstellung, die die Abfolge der Fluoreszenzänderungen zeigt, die nach der erfolgreichen Stimulation der Spermien zu erwarten sind. Das obere Feld von Abbildung 2 zeigt die Änderungen der GCaMP3-Fluoreszenzintensität, bei der das Signal zunächst schwach ist (die akrosomalen Kalziumkonzentrationen sind niedriger als die GCaMP3-KD) und beim Eintritt von Kalziumionen über Fusionsporen die Helligkeit der Fluoreszenz zunimmt. Schließlich kommt es bei AE zu einem Signalverlust aufgrund von Diffusion und dem Verlust des Sensors in den extrazellulären Raum. Das untere Feld von Abbildung 2 zeigt die Änderungen der mCherry-Fluoreszenzintensität, bei der das Anfangssignal hell ist und nur bei AE und Diffusion des Sensors zusammen mit anderen Inhalten der akrosomalen Matrix eine Abschwächung des roten Signals erfolgt.
Abbildung 3 zeigt tatsächliche Messdaten für die oben dargestellten Stadien in zwei lebenden Spermien, die mit 125 μM des Gangliosids GM1 stimuliert wurden (für weitere Details darüber, wie GM1 AE in Spermienreguliert 12), aufgenommen in einem einzigen Sichtfeld. Die Abbildungen 3A, B und 3E, F zeigen die roten und grünen Signale, die in zwei Spermien zum Zeitpunkt 0 (vor der Stimulation) gemessen wurden, wobei zunächst das mCherry-Signal hell und das GCaMP3 schwach ist. Abbildung 3C, Abbildung 3G und Abbildung 3D, Abbildung 3H zeigen die Z-Profiler-Analyse für die gesamte Dauer des Experiments (Rohdaten oder F/F0, bzw. ). Einfügefenster bieten eine vergrößerte Ansicht des Zeitfensters, in dem ACR und AE auftreten.
Da Spermien sowohl sehr heterogen als auch sehr empfindlich auf Membranschäden aufgrund verschiedener Handhabungsverfahren reagieren, zeigt Abbildung 5 Beispiele für zwei Arten von negativen Ergebnissen. Die Abbildungen 5A, C zeigen mehrere Spermien, die in einem Sichtfeld erfasst wurden. Der gelbe Umriss hebt zwei Samenzellen hervor, die zum Zeitpunkt 0 (vor der Stimulation) ein hohes GCaMP3-Signal aufweisen. In den vorliegenden Experimenten wurden solche Zellen vermieden, da sie darauf hindeuten, dass das akrosomale Vesikel bereits einen Membranfusionsprozess durchläuft oder dass sie eine Membranschädigung erlitten haben, die das Austreten von Kalzium ermöglicht. Die Spermien in Abbildung 5A, die durch den Pfeil (Kreis-ROI in Abbildung 5A,C) gekennzeichnet sind, zeigen nach einer Stimulation mit 125 μM GM1 ein anfängliches mCherry-Signal, aber keine Reaktion in den roten oder grünen Kanälen (Abbildung 5B, D, zeigt das Z-Profiler-Analysefenster, wie es von Bild J bereitgestellt wird). Obwohl eine Subpopulation von Spermien, wie die in diesem Beispiel gezeigte, keine Reaktion auf die Stimulation zeigt, werden diese in die endgültige Analyse einbezogen und in der Analyse der prozentualen Ansprechdaten2 berechnet (Abbildung 3).
Abbildung 1: Instrumentierung und Versuchsaufbau. (A) Lebende Samenzellen auf einer PDL-beschichteten Deckglasschale, die in eine Inkubationskammer bei 37 °C gestellt wird. Eine Borosilikat-Kapillare, die gezogen und an einem Einzelzell-Verabreichungssystem befestigt wird, wird in der Nähe der Samenzelle in der Mitte des Bildgebungsbereichs positioniert, um eine direkte Stimulanzienabgabe zu ermöglichen. Sowohl der grüne (GCaMP3) als auch der rote (mCherry) Kanal werden während der Stimulation kontinuierlich überwacht und mit einer hohen Bildrate (z. B. 10 Bilder/s) aufgezeichnet. (B) Schematische Darstellung des PDL-Abscheidungsmusters auf der Abdeckschale. (C) Schematische Darstellung der spezifischen Bereiche auf der Schale, in denen Spermien mit Hilfe der Kapillare stimuliert werden können, um die unspezifische Stimulation durch vorherige Züge in derselben Schale zu minimieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Änderungen des Fluoreszenzsignals und der Intensität. Oberes Bild: Ein Anstieg des GCaMP3-Signals bedeutet einen Kalziumeinstrom in das Akrosom, gefolgt von einem Signalverlust aufgrund der Diffusion des AcroSensE-Fusionsproteins. Unteres Bild: Das mCherry-Signal bleibt während der anfänglichen Membranfusion stabil, mit anschließender Dimmung nach AcroSensE-Diffusion und akrosomaler Exozytose (AE). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Daten und Fluoreszenzspuren. Ein Feld mit zwei Samenzellen wurde abgebildet. Die Grün-/Rotkanal-Fluoreszenz wurde offline mit ImageJ quantifiziert und in Excel aufgetragen (wie in Schritt 6 beschrieben). (A-D) Quantifizierung der Fluoreszenzintensität des roten (A) und grünen (B) Kanals für Zelle #1 im Laufe der Zeit, berechnet für ausgewählte ROIs und dann als Rohdaten (C) oder normalisiert auf das Ausgangssignal (D, F/F0). Der Einsatz in (D) bietet eine vergrößerte Ansicht des Zeitrahmens von 25-125 s. (E-H) Quantifizierung der roten (E) und grünen (F) Kanalfluoreszenzintensität für Zelle #2 über die Zeit, berechnet für ausgewählte ROIs, und dann als Rohdaten (G) oder normalisiert auf das Ausgangssignal (H, F/F0). Die Einfügung in (H) bietet eine vergrößerte Ansicht des Zeitrahmens von 25-125 s. Maßstabsbalken = 5 μm. Alle x-Achsen stellen die Zeit in Sekunden (s) dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Datenanalyse- und Quantifizierungsparameter. (A) Darstellung einer typischen GCaMP3-Fluoreszenzintensitätsspur mit quantifizierbaren Parametern, einschließlich Startzeit (Sekunden), Amplitude (Fluoreszenzintensität) und Dauer (Sekunden). (B) Illustration einer typischen mCherry-Fluoreszenzintensitätsspur mit quantifizierbaren Parametern, einschließlich Startzeit (Sekunden), Dauer (Sekunden), Steigung (F/s), R60 (Fluoreszenzintensität) und Amplitude (Fluoreszenzintensität). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Negative Ergebnisse. (A,C) mCherry (rot) und GCaMP3 (grün) Kanäle, die mehrere Spermien in einem einzigen Sichtfeld zeigen. Der Pfeil in (A) zeigt eine Samenzelle an, die zunächst mCherry-Fluoreszenz, aber keine nachfolgenden Änderungen der Fluoreszenzintensität als Reaktion auf eine 125-μM-GM1-Stimulation aufweist, wie in den Z-Profiler-generierten Spuren in (B) (mCherry) und (D) (GCaMP3) beobachtet wurde. Zellen innerhalb des gelben Rechtecks zeigen eine erhöhte GCaMP3-Fluoreszenzintensität zum Zeitpunkt 0 vor der Stimulation. Maßstabsleiste = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Hier wird eine mikroskopiebasierte Methode beschrieben, um das neu generierte AcroSensE-Mausmodell für die Echtzeit-Einzelzellüberwachung und -analyse des Zusammenspiels zwischen akrosomaler Kalziumdynamik und Zwischenschritten, die zu AE führen, zu nutzen. Zusammen mit leicht verfügbaren genetischen Ansätzen, wie z. B. der Kreuzung mit anderen genetischen Modellen der Maus oder der Geneditierung, bieten dieses Modell und diese Methode ein leistungsfähiges System, um die Rolle verschiedener Komponenten und Signalwege zu untersuchen, die an Spermiensignalwegen beteiligt sind, die mit Kapazitation, AE und Befruchtung zusammenhängen.
Kritische Schritte
Bei allen Schritten der Spermienhandhabung ist es wichtig, Kunststoff-Transferpipetten mit großem Durchmesser oder Pipettenspitzen mit großer Öffnung zu verwenden und alle Schritte der Entnahme und des Waschens bei 37 °C durchzuführen, um Membranschäden zu minimieren. In ähnlicher Weise ist ein Rotor mit schwingender Schaufel einem Rotor mit festem Winkel vorzuziehen, um eine Beschädigung der Membran durch Zellen zu vermeiden, die mit der Seitenwand des Mikrozentrifugenröhrchens interagieren. Wenn eine Driftkorrektur der Z-Position verfügbar ist, wird dringend empfohlen, Hardware/Software zur Korrektur der Z-Position anzuwenden, um die Drift der abgebildeten Spermien aus der Fokusebene während des Bildgebungsintervalls zu vermeiden.
Modifikationen und Fehlerbehebung
Das hier beschriebene Protokoll wurde für die Untersuchung der lipidvermittelten Signaltransduktionoptimiert 2,3 und kann sowohl auf kapazitive als auch auf nicht-kapazitive Spermien angewendet werden. Es können verschiedene Methoden zur Spermienkapazitation verwendet werden; Zum Beispiel können entweder Albumin oder Cyclodextrin als Sterolakzeptoren dienen. Darüber hinaus können verschiedene Energiesubstrate oder Bikarbonat hinzugefügt oder weggelassen werden. Es ist jedoch zu beachten, dass sich Bikarbonat in wässrigen Medien durch Einwirkung von Luft bildet, so dass die Prüfung wirklich "bikarbonatfreier" Bedingungen eine sorgfältige Verwendung einer Stickstoffumgebung in allen Schritten der Herstellung/Vorbereitung/Handhabung des Mediums und der Durchführung des Experiments erfordern würde. Das obige Protokoll beinhaltet die Verwendung von 10 mM Kalzium, das der experimentellen Lösung zugesetzt wird; Kalziumionen können jedoch weggelassen, chelatisiert (z. B. EGTA) oder in niedrigeren Konzentrationen für kalziumempfindliche experimentelle Anwendungen hinzugefügt werden. Bitte beachten Sie, dass das Senken oder Weglassen der Kalziumkonzentration das erwartete GCaMP3-Signal bei AE2 verringert. Darüber hinaus kann man für dieses Protokoll andere Medien verwenden (im Gegensatz zu dem hier verwendeten MW), die besser zu ihrem Versuchsdesign und ihren Zielen passen. Das bereitgestellte Protokoll beschreibt die Verwendung von Einzelzell-Bildgebung und Einzelzell-Verabreichung von Stimulanzien; Eine vereinfachte Variation ist jedoch durch Massenstimulation erreichbar, z. B. durch Zugabe des stimulierenden Reagenzes zur gesamten Schale und nicht durch Puffen. Darüber hinaus sind auch Ganzpopulationsexperimente mit dem AcroSensE-Modell durch den Einsatz von Fluorimetern oder fluoreszenzfähigen Plattenlesegeräten möglich.
Begrenzungen
Die hier vorgestellte Methode erfordert die Verfügbarkeit, Wartung und Verwendung einer AcroSensE-Mauskolonie. Die Methode hängt auch von der Verfügbarkeit eines fortschrittlichen Bildgebungssystems ab, das kostspielig ist und geschultes Personal erfordert. Für einige experimentelle Anwendungen besteht eine mögliche Einschränkung darin, dass zytosolisches Kalzium in AcroSensE-Spermien nicht gleichzeitig gemessen werden kann, da viele verfügbare synthetische Kalziumindikatoren eine ähnliche Wellenlänge wie GCaMP3 haben. Obwohl dies den Rahmen dieses Protokolls sprengen würde, könnten mögliche Einschränkungen von Experimenten auf Populationsebene das Lesen des mCherry-Signals nach AE und die Ausbreitung im Medium oder GCaMP3-Signal sein, das von toten/permeabilisierten Zellen stammt. Um solche Methoden zu optimieren, könnte man den Einsatz von z-Fokussierung zur Minimierung des Hintergrundrauschens von sezerniertem mCherry untersuchen und/oder scheinbehandelte Kontrollen verwenden, um die GCaMP-Quantifizierung von toten oder permeabilisierten Spermien zu gewährleisten.
Die Bedeutung der Methode in Bezug auf bestehende/alternative Methoden
In den letzten zwei Jahrzehnten gab es Berichte über mehrere Methoden zur Echtzeituntersuchung der AE-Dynamik in lebenden Spermien, darunter Akrosom-gerichtete GFP-transgene Mäuse7, Kalziumfarbstoffe, die in das Akrosom geladen wurden (z. B. Fluo-412) oder die Verwendung von Exozytose-spezifischen Indikatoren wie dem synthetischen Farbstoff FM-6413. Im Vergleich zu diesen Methoden bietet das AcroSensE-Modell jedoch den Komfort, minimal behandelte Spermien zu verwenden, die keine Farbstoffbeladung oder andere potenziell membranstörende Verfahren erfordern. Wichtig ist, dass es einen großen Vorteil hat, Spermien zu haben, die einen doppelten Indikator exprimieren, der die akrosomale Kalziumdynamik, die Membranfusion und die Porenbildung sowie AE und die daraus resultierende Freisetzung des akrosomalen Inhalts überwachen kann.
Bedeutung und Anwendungsmöglichkeiten der Methode in spezifischen Forschungsbereichen
Beachten Sie, dass die folgenden experimentellen Anwendungsbeispiele als Einzelzell- oder Populationsassays durchgeführt werden können, wobei letztere erhebliche Vorteile haben, wenn eine Hochdurchsatzanalyse gewünscht wird. Untersuchungen der AE-Dynamik in verschiedenen Mausmodellen können durch Kreuzung mit dem AcroSensE-Mausmodell durchgeführt werden, einschließlich (1) Null- oder mutierter Formen verschiedener Kalziumkanäle oder Kalziumkanal-Untereinheiten (z. B. Kreuzung mit α1E- und CatSper-Null-Modellen); (2) Null- oder mutierte Formen von Proteinen, die die Membranfusion vermitteln (z. B. SNAREs). Darüber hinaus können Studien durchgeführt werden, um zu untersuchen, wie verschiedene pharmakologische Wirkstoffe, die mit verschiedenen Signalwegen in Verbindung stehen, die akrosomale Kalzium- und AE-Dynamik modulieren. Darüber hinaus kann erforscht werden, wie sich Umweltveränderungen auf AE auswirken, einschließlich Temperatur, pH-Wert und das Vorhandensein oder die Konzentration verschiedener Ionen oder kleiner Moleküle.
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Disclosures
Keine Autoren haben Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Arbeit zu melden.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health Grants R01-HD093827 und R03-HD090304 (A.J.T.) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
References
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- Cohen, R., et al. A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis. J Biol Chem. 298 (5), 101868 (2022).
- Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J.
- Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm. J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).
- Sosa, C. M., et al. Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis). Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).
- Balestrini, P. A., et al. Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time. Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).
- Nakanishi, T., et al. Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein. FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).
- Kim, K. S., Gerton, G. L. Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm. Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).
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- Henderson, M. J., et al. A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store. PloS one. 10 (10), 0139273 (2015).
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