Summary
AcroSensE-musemodellen og levende celleavbildningsmetoder beskrevet her, gir en ny tilnærming til å studere kalsiumdynamikk i det subcellulære rommet til sædakrosomet og hvordan de regulerer mellomliggende trinn som fører til membranfusjon og akrosomeksocytose.
Abstract
Akrosom eksocytose (AE), hvor spermens enkelt eksocytotiske vesikkel smelter sammen med plasmamembranen, er en kompleks, kalsiumavhengig prosess som er avgjørende for befruktning. Imidlertid er vår forståelse av hvordan kalsiumsignalering regulerer AE fortsatt ufullstendig. Spesielt er samspillet mellom intraakrosomal kalsiumdynamikk og de mellomliggende trinnene som fører til bivirkninger ikke veldefinert. Her beskriver vi en metode som gir romlig og tidsmessig innsikt i akrosomal kalsiumdynamikk og deres forhold til membranfusjon og påfølgende eksocytose av akrosomvesikkelen. Metoden benytter en ny transgen mus som uttrykker en akrosom-målrettet sensor for eksocytose (AcroSensE). Sensoren kombinerer en genetisk kodet kalsiumindikator (GCaMP) smeltet sammen med mCherry. Dette fusjonsproteinet ble spesielt utviklet for å muliggjøre samtidig observasjon av akrosomal kalsiumdynamikk og membranfusjonshendelser. Sanntidsovervåking av akrosomal kalsiumdynamikk og AE i levende AcroSensE-sædceller oppnås ved hjelp av en kombinasjon av bildebehandling med høy bildefrekvens og et stimulerende leveringssystem som kan målrette mot enkeltspermier. Denne protokollen gir også flere eksempler på grunnleggende metoder for å kvantifisere og analysere rådataene. Fordi AcroSensE-modellen er genetisk kodet, kan dens vitenskapelige betydning forsterkes ved å bruke lett tilgjengelige genetiske verktøy, for eksempel kryssavl med andre genetiske modeller fra mus eller genredigering (CRISPR) baserte metoder. Med denne strategien kan rollene til ytterligere signalveier i spermkapasitasjon og befruktning løses. Oppsummert gir metoden beskrevet her et praktisk og effektivt verktøy for å studere kalsiumdynamikk i et spesifikt subcellulært rom - sædakrosomet - og hvordan disse dynamikkene regulerer mellomtrinnene som fører til membranfusjon og akrosomeksocytose.
Introduction
Sperm tilegne seg evnen til å befrukte under en prosess som kalles kapasitasjon1. Et endepunkt i denne prosessen er at sædcellene får evnen til å gjennomgå AE. Over to tiår med data støtter tilstedeværelsen av en kompleks, flertrinnsmodell av AE i pattedyrsperm (oppsummert i 2,3). Imidlertid er det utfordrende å studere AE i levende sæd, og tilgjengelige metoder for å overvåke denne prosessen med tilstrekkelig oppløsning er tungvint og krever flere forberedelsestrinn4, er begrenset til påvisning av det siste trinnet av bivirkninger (f.eks. ved bruk av PNA5), er begrenset til målinger av endringer i cytosolisk kalsium (i motsetning til akrosomal kalsiumdynamikk), eller er begrenset til målinger av enten cytosolisk kalsiumdynamikk eller AE6.
For å overvinne noen av de viktigste begrensningene i sanntids bivirkningsstudier under fysiologiske forhold og for å muliggjøre undersøkelse av samspillet mellom kalsiumdynamikk og AE, ble det generert en unik musemodell. I denne musemodellen uttrykkes et fusjonsprotein sammensatt av den genetisk kodede Ca2+-sensoren (GCaMP3) og mCherry og målrettes mot akrosomet ved hjelp av en akrosinpromotor og signalpeptid2. Den målrettede doble GCaMP3-mCherry-sensoren muliggjør samtidige sanntidsmålinger av kalsiumkonsentrasjoner og status for det akrosomale innholdet i levende sæd under fysiologiske forhold ved hjelp av mikroskopi og et enkeltcellestimulerende leveringssystem (figur 1). Som en komponent i den akrosomale matrisen vil membranfusjon og AE resultere i tap av den fotostabile og pH-ufølsomme mCherry-fluorescensen fra sæden, da dette proteinet diffunderer ut av akrosomvesikkelen. I denne forbindelse er modellens evne til å reflektere timingen og forekomsten av AE beslektet med fordelene med den akrosommålrettede GFP-muselinjen 7,8,9.
GCaMP3-varianten som brukes i denne transgene muselinjen har en omtrentlig KD på 400 μM og et dynamisk område for Ca2+ på 10-4-10-3 M10, som passer for denne vesikkelen. Vi viste at denne kombinasjonen av funksjoner i GCaMP3 kunne avsløre fusjonsporedannelse mellom plasmamembranen og den ytre akrosomale membranen (OAM)2. Fusjonsporedeteksjonen er et resultat av at porestørrelsen er for liten til at AcroSensE-proteinet kan spre seg ut av akrosomet (via tap av akrosominnhold) samtidig som det gir en membrankanal som muliggjør tilstrømning av Ca2+-ioner til akrosomlumen, noe som fører til en økning i fluorescensintensiteten til GCaMP3.
Det lyse, monomere, ikke-kalsiumfølsomme fluorescerende proteinet mCherry støtter visualisering av akrosomet mens GCaMP3-signalet er svakt (f.eks. Før Ca2+ -binding, figur 2), og viktigere, det muliggjør også identifisering av akrosomintakte sædceller som er egnet for avbildning.
Følgende protokoll beskriver bruken av den unike AcroSensE-musemodellen og metodene for mikroskopi som brukes eksperimentelt for å studere AE og sædkalsiumdynamikk med høy romlig og tidsmessig oppløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer ble utført i henhold til retningslinjene og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Cornell University (#2002-0095). 8-10 uker gamle AcroSensE mus2 ble brukt til denne studien. Forespørsler om informasjon om tilgjengeligheten av AcroSensE-musene kan sendes til korresponderende forfatter.
1. Sædinnsamling og vask
- Samle cauda epididymal sperm (flere detaljer om denne prosedyren er gitt i11) fra AcroSensE-mus. Tillat 15 min svømmeprosedyre i en 3,5 cm vevskulturskål som inneholder 0,5 ml modifisert Whittens medium (MW) ved 37 °C. Tallerken skal dekkes for å redusere fordampning av MW, og bør vippes slik at mediet har nok dybde til å dekke cauda epididymidene.
MERK: Modifisert Whittens medium (MW) inkluderer 22 mM HEPES, 1,2 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1 mM pyruvsyre, 4,8 mM melkesyre hemi-Ca2+ salt, pH 7,35. Glukose (5,5 mM), NaHCO3 (10 mM) og 2-hydroksypropyl-cyklodekstrin (CD; 3 mM) suppleres (se materialtabell) etter behov for induksjon av kapasitasjon, og konsentrasjoner kan modifiseres for spesifikke eksperimenter. I tillegg kan alternative sterolakseptorer brukes i stedet for CD (f.eks. Bovint serumalbumin eller lipoproteiner med høy tetthet). - Bruk fin tang, fjern eventuelt epididymalt vev fra oppsamlingsfatet for svømming. Overfør mediet som inneholder sæden til et 15 ml konisk rør, og sentrifuge suspensjonen ved 100 x g i 1 min i en svingende bøtte rotor ved romtemperatur. Bruk en plastpipette til å fjerne MW-supernatanten som inneholder sæden fra grovt vevsavfall som vil ha pelletert på dette trinnet.
- Bring MW-supernatanten som inneholder sæden til et totalt volum på 3 ml ved å tilsette MW ved 37 °C. Sentrifuge ved 400 x g i 8 min (ved romtemperatur) i et rundbunnet rør. Fjern langsomt supernatanten av MW fra den løst pelleterte sæden.
- Hvis det er levedyktig, bør sæden vises som en "fluffy" utseende pellet. Resuspender sæden forsiktig via triturering med en overføringspitte med stor boring eller via forsiktige manuelle kraner på røret ("fingerflikking"). Når de er jevnt resuspendert, overfør dem til et nytt rundbunnsrør. Bruk 10-20 μL av sædsuspensjonen for å telle og vurdere motilitet. Fortynn sæd i MW for bruk.
MERK: For de fleste eksperimenter som involverer musspermkapasitasjon, brukes en endelig konsentrasjon på 5-10 millioner sædceller / ml MW. Bildebehandlingsprotokollen beskrevet her krever ikke kapasitering av sæd, selv om det er nødvendig for sæd å skaffe seg evnen til å gjennomgå fysiologisk relevant akrosomeksocytose. Man kunne studere patologisk eksocytose eller eksocytose indusert gjennom reagenser som en kalsiumionofor uten å kapasitere sæden. I tillegg kan man utforske potensielle endringer i akrosomalt kalsium i ikke-kapasiterte celler som respons på ulike stimuli. - Bruk sæden innen 3-5 timer fra innsamling, og hold tiden så kort som mulig og konsistent blant eksperimentelle forsøk.
- Utfør alle trinn for oppsamling og vask ved 37 °C ved bruk av MW-medium, ved hjelp av metoder for å minimere membranskader. Dette inkluderer bruk av store bore plastoverføringspipetter eller pipettespisser med stor åpning, som anbefales til bruk i alle stadier av prosedyren.
2. Poly-D-lysinbelegg av coverslip retter for avbildning
MERK: Poly-D-lysin (PDL) retter bør tilberedes ferske før hvert eksperiment.
- Dispenser en 0,5 μL dråpe PDL (0,5 mg / ml, se materialfortegnelse) i midten av en dekkfat.
- Bruk en 10 μL gradert spiss til å smøre PDL-dråpen over dekkslippet (kryssmønster som vist i figur 1B).
- La tørke ved 37 °C i 10 minutter. Hold PDL-belagte retter tildekket og ved 37 °C til bruk.
3. Kapillær trekking, lasting for puffing
- Trekk borosilikatglasskapillærene (O.D, 2 mm, I.D, 1.56 mm, se materialfortegnelsen) ved hjelp av innstillingene som følger: Varme: 330, Trekk: 250, Hastighet: 250 og Tid: 70. Dette trinnet bør optimaliseres for den spesifikke avtrekkeren som er i bruk.
- Før hvert eksperiment, last en enkelt kapillær med den stimulerende løsningen som inneholder 3-5x konsentrasjonen av stimulanten (for å ta hensyn til rask diffusjon av løsningen ved puffing). Før du fyller, bruk fin pinsett for å bryte opp kapillærspissen på ca. 1-2 mm fra enden. Dette skal gi en åpningsdiameter på ∼5 μm. Varmepolering er ikke nødvendig.
- Bruk en tynn plastoverføringspipette, injiser den stimulerende løsningen sakte inn i kapillæren til tre fjerdedeler av lengden er full.
- Fjern eventuelle luftbobler som dannes under fylling ved forsiktig flikking av kapillæren.
- Monter fylt kapillær på mikromanipulatoren (se materialfortegnelse).
4. Forberedelse av levering av stimulering for puffing
MERK: For å minimere risikoen for brukerskade, bør vernebriller brukes under driften av puffingprosedyren.
- Konfigurer innstillingene for enkeltcelleleveringssystemet for å gi en 10 s puls ved 5 psi.
- Koble borosilikatkapillæren til pipetteholderen for enkeltcelleleveringssystemet. Sørg for at tetningene er tette.
- Mens du observerer kapillærspissen, bruk en kort pust på 2 s ved 20 psi for å sikre at løsningen faktisk blir dispensert gjennom spissens ende (en liten dråpe skal være åpenbar på slutten av spissen).
5. Mikroskopi og bildeinnsamling
MERK: Flere merker av mikroskoper er tilgjengelige og kan brukes; Imidlertid er en minimum bildefrekvens på 3 bilder / s ønskelig. Når det gjelder temperatur og miljøkontroll, vær oppmerksom på at den faktiske temperaturen til mediet i parabolen skal bekreftes, for eksempel ved hjelp av et berøringsfritt infrarødt termometer.
- Tilsett 80 μL fortynnet sæd til midten av en poly-D-lysinbelagt 35 mm dekkskål. For de fleste eksperimenter som involverer musspermkapasitasjon, brukes en endelig konsentrasjon på 5-10 millioner sædceller / ml.
- Tilsett langsomt 3 ml varmt (37 °C) MW basemedium tilsatt 10 mM CaCl2.
MERK: Man kan utføre eksperimenter ved romtemperatur for å bremse cellulære prosesser, men det er viktig å merke seg at fordi kapasitasjon er mediert av lipidutvekslinger og fluiditeten til mikro- og makrodomener, må man huske på at fysiologisk relevant kapasitasjon og akrosomeksocytose er temperaturavhengige prosesser. - Monter fatet med sæden på mikroskopet (forvarmet til 37 °C).
- Opphiss GCaMP3 ved hjelp av en 488 nm laserlinje og vis med et 505-550 nm båndpass (BP) filter. Opphiss mCherry ved hjelp av en 555 nm laserlinje og se med et 575-615 nm BP-filter.
- Bruk en mikromanipulator (det anbefales å feste manipulatoren til luftbordet som mikroskopet ble satt opp på.), Plasser spissen av kapillæren ca. 100 μm til siden og 5-10 μm over planet til cellen av interesse.
MERK: De stimulerende løsningene er laget ved 3-5x normal konsentrasjon for å kompensere for den raske diffusjonen som forekommer i volumet mellom kapillæren og cellen. - Start bildesekvensen på mikroskopet.
- Bilde sædceller med høy bildefrekvens, helst >10 bilder / s. Her ble det brukt en resonansskanner som muliggjør avbildning ved 33 ms / ramme.
- Ti sekunder etter at du har startet bildeoppkjøpet på mikroskopet, aktiverer du enkeltcelleleveringssystemet for å starte 10 s pust av stimulant.
- Bildeceller i en varighet på 10-15 min.
- Bruk enkeltcelleleveringssystemet, avbilde flere celler fra en enkelt tallerken i henhold til stedene som er angitt i figur 1B.
MERK: Ubehandlet/ikke-stimulert sæd under mikroskopet skal for det meste vises rødt, med lav intensitet på det grønne signalet. Spermhoder skal festes til dekselet, og levende sæd kan identifiseres ved deres bevegelige haler. I sæd som gjennomgår AE, vil GCaMP3 grønt signal i utgangspunktet øke, og både mCherry rødt signal og GCaMP3 grønt signal vil forsvinne hvis AE er fullført, som illustrert i figur 2. Reduksjonen av mCherry-fluorescens gir en mer spesifikk indikator på tidspunktet da AE begynner fordi endringer i Ca2+ konsentrasjoner kontinuerlig vil forårsake endringer i GCaMP3-fluorescensintensiteten.
6. Bilde- og dataanalyse
MERK: Offline bildeanalyse utføres ved hjelp av ImageJ (se Materialfortegnelse). Tidligere ble flere mellomtrinn rapportert i prosessen som førte til bivirkning, inkludert akrosomal kalsiumstigning (ACR) og full membranfusjon. Sistnevnte fører til tap av mCherry-fluorescens og representerer derfor full AE. I noen celler observeres signaler som ligner på pre-spike foot events (PSF) ved bruk av amperometriske tilnærminger i studier av eksocytose (for mer informasjon, se2). Flere valgfrie metoder er tilgjengelige for å analysere AcroSensE-rådataene for å kvantifisere ACR, AE og de mellomliggende trinnene. Nedenfor beskrives noen av de grunnleggende analysemetodene.
- Avhengig av den spesifikke filtypen i mikroskopsystemet, bruk verktøyet for delt kanal (Bilde > Farger > Split Channels) for å generere individuelle vinduer for GCaMP3- og mCherry-kanalene.
- Synkroniser de enkelte vinduene ved hjelp av verktøyet "Synkroniser vindu" (Analyser > Verktøy > Synkroniser Windows).
- Velg et interesseområde (ROI) rundt sædhodet i den røde kanalen for å inkludere akrosomregionen (figur 3A,B). Synkroniseringsverktøyet gjør det mulig å bruke det samme områdevalget automatisk på den grønne kanalen, der sædcellene fortsatt er for svake til å være synlige.
- Velg "Z Profiler" plugin (Plugins > Stacks > Z Profiler) eller "Time Series Analyzer" (Plugins > Stacks > Time Series Analyzer) for å plotte endringen i fluorescensintensitet som en funksjon av rammer / tid for hver av de to kanalene.
- Kopier data til et regnearkprogram (f.eks. Microsoft Excel) for plotting og videre analyse.
MERK: Når dataene er kopiert til et regneark, kan flere parametere trekkes ut for analyse, inkludert følgende, som illustrert i figur 4.- Fusion Pore (FP) starttid: måle tiden fra tidspunkt 0 til tidspunktet der GCaMP3-signalet begynner å stige. Denne parameteren indikerer forsinkelsen mellom stimuleringen og sperm ACR-responsen.
- AE-starttid: Mål tiden fra tidspunkt 0 til tidspunktet der mCherry-signalet begynner å forfalle. Denne parameteren indikerer forsinkelsen mellom stimuleringen og sperm AE-responsen. Denne parameteren kan også brukes til å beregne forsinkelsen mellom FP-dannelse og AE-respons.
- Peak FP-amplitude: måle fluorescenssignalet fra basen til toppen av GCaMP3-signalstigningen. Denne parameteren indikerer den totale økningen i ACR-respons.
- Tapshastighet for mCherry: bestem denne parameteren med en lineær eller en eksponentiell tilpasning på delen av mCherry-signaltapet (som indikert med "skråning" i figur 4B).
MERK: Alternativt kan du bestemme forfallshastigheten ved hjelp av gjenværende (R) signalmetoden ved forskjellige tidspunkter (f.eks. R60: varighetstid i sekunder til et restsignal på 60 % fra grunnlinjen til mCherry-signalet). Denne parameteren kan brukes til å kvantifisere hastigheten som det akrosomale innholdet spres ved AE. - Signalreduksjon for mCherry-tap: bestem forskjellen i amplitude mellom baseline mCherry-fluorescensintensiteten og signalet etter AE. Denne parameteren angir den totale mengden akrosomalt innhold spredt ved AE.
- Plott endringene i fluorescens (F) for både de røde og grønne kanalene som rådata, eller normaliser dem ved den opprinnelige fluorescensen (F0) og uttrykk dem som ΔF / F0. Sistnevnte gir bedre visualisering av endringene i både rødt og grønt på en enkelt tomt (se f.eks. figur 3D og figur 3H).
MERK: Til slutt kan de forskjellige målte parametrene sammenlignes mellom forskjellige forhold for å bestemme forholdet mellom endringer i akrosomal kalsiumkonsentrasjon og AE. For eksempler på ulike eksperimentelle tilstandssammenligninger, se referanse2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 gir en forenklet illustrasjon som viser sekvensen av fluorescensendringer som forventes etter vellykket stimulering av sædceller. Det øverste panelet i figur 2 illustrerer endringene i GCaMP3-fluorescensintensiteten, hvor signalet i utgangspunktet er svakt (baseline akrosomale kalsiumkonsentrasjoner er lavere enn GCaMP3 KD), og ved innføring av kalsiumioner via fusjonsporene øker fluorescensen i lysstyrke. Til slutt, ved AE, er det tap av signal på grunn av diffusjon og tap av sensoren til det ekstracellulære rommet. Det nederste panelet i figur 2 illustrerer endringene i mCherry-fluorescensintensiteten, der det opprinnelige signalet er lyst, og bare ved AE og diffusjon av sensoren sammen med annet innhold i den akrosomale matrisen, er det en dimming av det røde signalet.
Figur 3 gir faktiske målte data for stadiene illustrert ovenfor i to levende sædceller stimulert med 125 μM av gangliosid GM1 (for mer informasjon om hvordan GM1 regulerer AE i sæd12), fanget i et enkelt synsfelt. Figur 3A, B og figur 3E, F viser de røde og grønne signalene målt i to sædceller ved tidspunkt 0 (før stimulering), hvor mCherry-signalet i utgangspunktet er lyst, og GCaMP3 er svakt. Figur 3C, figur 3G og figur 3D, figur 3H gir Z Profiler-analysen for hele varigheten av eksperimentet (rådata eller F / F0, henholdsvis). Innsettingspaneler gir en zoomet inn visning av tidsvinduet der ACR og AE forekommer.
Fordi sædceller både er svært heterogene og svært følsomme for membranskader på grunn av ulike håndteringsprosedyrer, gir figur 5 eksempler på to typer negative resultater. Figur 5A,C viser flere sædceller fanget innenfor ett synsfelt. Det gule omrisset fremhever to sædceller som viser et høyt GCaMP3-signal ved tidspunkt 0 (før stimulering). I de nåværende forsøkene ble slike celler unngått, da de indikerer at den akrosomale vesikkelen allerede går gjennom en membranfusjonsprosess, eller at de har opplevd noen membranskader som gjør at kalsium kan lekke. Sperma i figur 5A indikert med pilen (sirkelavkastning i figur 5A, C) viser et innledende mCherry-signal, men ingen respons i de røde eller grønne kanalene (henholdsvis figur 5B, D, som viser Z-Profiler-analysevinduet som gitt av ImageJ) etter stimulering med 125 μM GM1. Selv om en underpopulasjon av sædceller, som den som er gitt i dette eksemplet, ikke viser noen respons på stimulering, er disse inkludert i den endelige analysen og beregnes i prosentvis responsdataanalyse2 (figur 3).
Figur 1: Instrumentering og eksperimentelt oppsett. (A) Levende sædceller på en PDL-belagt dekkseddelskål plassert i et inkubasjonskammer ved 37 °C. En borosilikatkapillær, trukket og festet til et enkeltcelleleveringssystem, er plassert nær sædcellen i midten av bildeområdet for direkte stimulerende levering. Både grønne (GCaMP3) og røde (mCherry) kanaler overvåkes kontinuerlig og registreres med høy bildefrekvens (f.eks. 10 bilder/s) under stimulering. (B) Skjematisk fremstilling av PDL-avsetningsmønsteret på omslagsfatet. (C) Skjematisk fremstilling av de spesifikke områdene på parabolen hvor sæd kan stimuleres ved hjelp av kapillæren for å minimere uspesifikk stimulering fra tidligere trekk i samme tallerken. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Endringer i fluorescenssignal og intensitet. Topppanel: En økning i GCaMP3-signalet betyr kalsiuminnstrømning til akrosomet, etterfulgt av signaltap på grunn av diffusjon av AcroSensE-fusjonsproteinet. Bunnpanel: mCherry-signalet forblir stabilt under innledende membranfusjon, med påfølgende dimming ved AcroSensE-diffusjon og akrosomal eksocytose (AE). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative data og fluorescensspor. Et felt med to sædceller ble avbildet. Grønn/rød kanalfluorescens ble kvantifisert frakoblet ved hjelp av ImageJ og plottet inn i Excel (som beskrevet i trinn 6). (AD) Kvantifisering av rød (A) og grønn (B) kanalfluorescensintensitet for celle #1 over tid, beregnet for utvalgte avkastninger, og deretter presentert som rådata (C) eller normalisert til det opprinnelige signalet (D, F/F0). Innsatsen i (D) gir en zoomet inn visning av tidsrammen fra 25-125 s. (E-H) Kvantifisering av rød (E) og grønn (F) kanalfluorescensintensitet for celle #2 over tid, beregnet for utvalgte avkastninger, og deretter presentert som rådata (G) eller normalisert til det opprinnelige signalet (H, F / F0). Innsatsen i (H) gir en zoomet inn visning av tidsrammen fra 25-125 s. Skala bar = 5 μm. Alle x-akser representerer tid i sekunder (er). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Dataanalyse og kvantifiseringsparametere. (A) Illustrasjon av et typisk GCaMP3-fluorescensintensitetsspor, som viser kvantifiserbare parametere, inkludert starttid (sekunder), amplitude (fluorescensintensitet) og varighet (sekunder). (B) Illustrasjon av et typisk mCherry-fluorescensintensitetsspor, som viser kvantifiserbare parametere, inkludert starttid (sekunder), varighet (sekunder), stigningstall (F/s), R60 (fluorescensintensitet) og amplitude (fluorescensintensitet). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Negative resultater. (A,C) mCherry (rød) og GCaMP3 (grønn) kanaler som viser flere sædceller fanget i ett enkelt synsfelt. Pilen i (A) indikerer en sædcelle som i utgangspunktet viste mCherry-fluorescens, men ingen påfølgende fluorescensintensitetsendringer som respons på 125 μM GM1-stimulering, som observert i Z-Profiler-genererte spor gitt i (B) (mCherry) og (D) (GCaMP3). Celler i det gule rektangelet viser forhøyet GCaMP3-fluorescensintensitet ved tidspunkt 0, før stimulering. Skala bar = 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrives en mikroskopibasert metode for å utnytte den nylig genererte AcroSensE-musemodellen for sanntids, encelleovervåking og analyse av samspillet mellom akrosomal kalsiumdynamikk og mellomtrinn som fører til AE. Sammen med lett tilgjengelige genetiske tilnærminger, for eksempel kryssavl med andre musegenetiske modeller eller genredigering, gir denne modellen og metoden et kraftig system for å studere rollen til forskjellige komponenter og veier som deltar i sædsignalveier relatert til kapasitasjon, AE og befruktning.
Kritiske skritt
I alle trinn for håndtering av sæd er det viktig å bruke plastoverføringspipetter med stor boring eller pipettespisser med stor åpning og å utføre alle trinn for innsamling og vask ved 37 °C for å minimere membranskade. På samme måte er en svingende bøtterotor å foretrekke fremfor en rotor med fast vinkel for å unngå membranskader på grunn av celler som interagerer med sideveggen til mikrosentrifugerøret. Hvis Z-posisjonskorreksjon er tilgjengelig, anbefales det sterkt å bruke maskinvare/programvare for korrigering av z-posisjon for å unngå at den avbildede sædcellen driver ut av fokalplanet under avbildningsintervallet.
Endringer og feilsøking
Protokollen beskrevet her ble optimalisert for studier av lipidmediert signalering 2,3 og kan brukes på både kapasitert og ikke-kapasitert sæd. Ulike metoder for spermapasitasjon kan brukes; For eksempel kan enten albumin eller cyklodekstrin tjene som sterolakseptorer. I tillegg kan forskjellige energisubstrater eller bikarbonat tilsettes eller utelates. Vær imidlertid oppmerksom på at bikarbonat vil dannes i vandige medier fra eksponering for luft, så testing av virkelig "bikarbonatfrie" forhold vil kreve forsiktig bruk av et nitrogenmiljø i alle trinn for å lage / forberede / håndtere mediet og utføre eksperimentet. Protokollen ovenfor inkluderer bruk av 10 mM kalsium tilsatt den eksperimentelle løsningen; Imidlertid kan kalsiumioner utelates, chelateres (f.eks. EGTA) eller tilsettes i lavere konsentrasjoner for kalsiumfølsomme eksperimentelle applikasjoner. Vær oppmerksom på at senking eller utelatelse av kalsiumkonsentrasjoner vil redusere det forventede GCaMP3-signalet ved AE2. I tillegg kan man bruke andre medier for denne protokollen (i motsetning til MW som brukes her) som passer bedre til deres eksperimentelle design og mål. Den medfølgende protokollen beskriver bruken av enkeltcelleavbildning og enkeltcellelevering av stimulanter; Imidlertid er en forenklet variasjon oppnåelig ved bulkstimulering, for eksempel ved å tilsette det stimulerende reagenset til hele parabolen og ikke via puffing. I tillegg er det også mulig å bruke AcroSensE-modellen ved bruk av fluorimetre eller platelesere med fluorescensfunksjon.
Begrensninger
Metoden som beskrives her, krever tilgjengelighet, vedlikehold og bruk av en AcroSensE-musekoloni. Metoden avhenger også av tilgjengeligheten av et avansert bildesystem, noe som er kostbart og krever opplært personell. For noen eksperimentelle applikasjoner gjelder en mulig begrensning manglende evne til samtidig å måle cytosolisk kalsium i AcroSensE-sæd, da mange tilgjengelige syntetiske kalsiumindikatorer har lignende bølgelengde som GCaMP3. Selv om det er utenfor omfanget av denne protokollen, kan potensielle begrensninger av populasjonsnivåeksperimenter omfatte lesing av mCherry-signalet etter AE og spredning i mediet eller GCaMP3-signalet som kommer fra døde / permeabiliserte celler. For å optimalisere slike metoder kan man utforske å bruke z-fokusering for å minimere bakgrunnsstøy fra utskilt mCherry, og / eller bruke falske behandlede kontroller for å sikre grunnleggende GCaMP-kvantifisering fra død eller permeabilisert sæd.
Metodens betydning for eksisterende/alternative metoder
I løpet av de siste to tiårene har det vært rapporter om flere metoder for sanntidsstudier av AE-dynamikk i levende sæd, inkludert akrosommålrettede GFP-transgene mus7, kalsiumfargestoffer lastet inn i akrosomet (f.eks. Fluo-412), eller ved bruk av eksocytose-spesifikke indikatorer som det syntetiske fargestoffet FM-6413. Imidlertid, i forhold til disse metodene, gir AcroSensE-modellen bekvemmeligheten av å bruke minimalt behandlet sæd som ikke krever fargebelastning eller andre potensielt membranforstyrrende prosedyrer. Det er viktig at det er en stor fordel å ha sædceller som uttrykker en dobbel indikator som kan overvåke akrosomal kalsiumdynamikk, membranfusjon og poredannelse, samt AE og den påfølgende frigjøringen av det akrosomale innholdet.
Betydningen og potensielle anvendelser av metoden i spesifikke forskningsområder
Merk at de eksperimentelle applikasjonseksemplene nedenfor kan utføres som enkeltcelle- eller populasjonsanalyser, med sistnevnte som har betydelige fordeler når høy gjennomstrømningsanalyse er ønsket. Studier av bivirkningsdynamikk i ulike musemodeller kan utføres ved hjelp av kryssavl med AcroSensE-musemodellen, inkludert (1) null eller muterte former av forskjellige kalsiumkanaler eller kalsiumkanalunderenheter (f.eks. kryssing med α1E- og CatSper-null-modeller); (2) null eller muterte former av proteiner som medierer membranfusjon (f.eks. SNAREs). I tillegg kan studier utføres for å undersøke hvordan ulike farmakologiske midler relatert til forskjellige signalveier modulerer akrosomalt kalsium og AE-dynamikk. Videre kan det forskes på hvordan miljøendringer påvirker AE, inkludert temperatur, pH, og tilstedeværelse eller konsentrasjon av forskjellige ioner eller små molekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen forfattere har interessekonflikter å rapportere relatert til dette arbeidet.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health tilskudd R01-HD093827 og R03-HD090304 (AJT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
References
- Austin, C. R. Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg. Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).
- Cohen, R., et al. A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis. J Biol Chem. 298 (5), 101868 (2022).
- Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J.
- Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm. J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).
- Sosa, C. M., et al. Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis). Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).
- Balestrini, P. A., et al. Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time. Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).
- Nakanishi, T., et al. Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein. FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).
- Kim, K. S., Gerton, G. L. Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm. Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).
- Hasuwa, H., et al. Transgenic mouse sperm that have green acrosome and red mitochondria allow visualization of sperm and their acrosome reaction in vivo. Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science. 59 (1), 105-107 (2010).
- Henderson, M. J., et al. A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store. PloS one. 10 (10), 0139273 (2015).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. J Biol Chem. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Cohen, R., et al. Lipid modulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis and fertilization. Dev Cell. 28 (3), 310-321 (2014).
- Sanchez-Cardenas, C., et al. Acrosome reaction and Ca(2)(+) imaging in single human spermatozoa: new regulatory roles of [Ca(2)(+)]i. Biol Reprod. 91 (2), 67 (2014).
