Summary
Musmodellen AcroSensE och avbildningsmetoderna för levande celler som beskrivs här ger ett nytt tillvägagångssätt för att studera kalciumdynamiken i det subcellulära facket i spermieakrosomen och hur de reglerar mellanliggande steg som leder till membranfusion och akrosomexocytos.
Abstract
Akrosomexocytos (AE), där spermiens enda exocytotiska vesikel smälter samman med plasmamembranet, är en komplex, kalciumberoende process som är nödvändig för befruktning. Vår förståelse av hur kalciumsignalering reglerar AE är dock fortfarande ofullständig. I synnerhet är samspelet mellan intraakrosomal kalciumdynamik och de mellanliggande stegen som leder till biverkning inte väldefinierat. Här beskriver vi en metod som ger rumsliga och tidsmässiga insikter i akrosomal kalciumdynamik och deras relation till membranfusion och efterföljande exocytos av akrosomvesikeln. Metoden använder en ny transgen mus som uttrycker en akrosomriktad sensor för exocytos (AcroSensE). Sensorn kombinerar en genetiskt kodad kalciumindikator (GCaMP) sammansmält med mCherry. Detta fusionsprotein är speciellt utformat för att möjliggöra samtidig observation av akrosomal kalciumdynamik och membranfusionshändelser. Realtidsövervakning av akrosomal kalciumdynamik och AE i levande AcroSensE-spermier uppnås med hjälp av en kombination av avbildning med hög bildfrekvens och ett system för tillförsel av stimulantia som kan rikta in sig på enstaka spermier. Detta protokoll ger också flera exempel på grundläggande metoder för att kvantifiera och analysera rådata. Eftersom AcroSensE-modellen är genetiskt kodad kan dess vetenskapliga betydelse ökas genom att använda lättillgängliga genetiska verktyg, såsom korsning med andra genetiska musmodeller eller genredigeringsbaserade (CRISPR) metoder. Med denna strategi kan rollerna för ytterligare signalvägar i spermiekapacitering och befruktning lösas. Sammanfattningsvis ger metoden som beskrivs här ett bekvämt och effektivt verktyg för att studera kalciumdynamiken i ett specifikt subcellulärt fack - spermieakrosomen - och hur denna dynamik reglerar de mellanliggande stegen som leder till membranfusion och akrosomexocytos.
Introduction
Spermier får förmågan att befrukta under en process som kallas kapacitering1. En slutpunkt för denna process är att spermierna får förmågan att genomgå AE. Över två decennier av data stöder förekomsten av en komplex flerstegsmodell av AE i däggdjursspermier (sammanfattad i 2,3). Att studera biverkning i levande spermier är dock utmanande, och för närvarande tillgängliga metoder för att övervaka denna process med tillräcklig upplösning är besvärliga och kräver flera förberedelsesteg4, är begränsade till detektion av det sista steget av biverkning (t.ex. med hjälp av PNA5), är begränsade till mätningar av förändringar i cytosoliskt kalcium (i motsats till akrosomal kalciumdynamik), eller är begränsade till mätningar av antingen cytosolisk kalciumdynamik eller AE6.
För att övervinna några av de viktigaste begränsningarna med AE-studier i realtid under fysiologiska förhållanden och för att möjliggöra undersökning av samspelet mellan kalciumdynamik och AE, genererades en unik musmodell. I denna musmodell uttrycks och riktas ett fusionsprotein bestående av den genetiskt kodade Ca2+-sensorn (GCaMP3) och mCherry till akrosomen med hjälp av en akrosinpromotor och signalpeptid2. Den riktade dubbla GCaMP3-mCherry-sensorn möjliggör samtidiga realtidsmätningar av kalciumkoncentrationer och status för det akrosomala innehållet i levande spermier under fysiologiska förhållanden med hjälp av mikroskopi och ett encellsstimulerande leveranssystem (figur 1). Som en komponent i den akrosomala matrisen skulle membranfusion och AE resultera i förlust av den fotostabila och pH-okänsliga mCherry-fluorescensen från spermierna, eftersom detta protein diffunderar ut ur akrosomvesikeln. I detta avseende är modellens förmåga att återspegla tidpunkten och förekomsten av AE besläktad med fördelarna med den akrosomriktade GFP-muslinjen 7,8,9.
GCaMP3-varianten som används i denna transgena muslinje har en ungefärlig KD på 400 μM och ett dynamiskt omfång för Ca2+ på 10-4-10-3 M10, vilket är lämpligt för denna vesikel. Vi visade att denna kombination av egenskaper hos GCaMP3 kunde avslöja fusionsporbildning mellan plasmamembranet och det yttre akrosomala membranet (OAM)2. Fusionspordetektionen är ett resultat av att porstorleken är för liten för att AcroSensE-proteinet ska kunna spridas ut ur akrosomen (via förlust av akrosominnehåll) samtidigt som det ger en membrankanal som möjliggör inflödet av Ca2+-joner in i akrosomlumen, vilket leder till en ökning av fluorescensintensiteten hos GCaMP3.
Det ljusa, monomera, icke-kalciumkänsliga fluorescerande proteinet mCherry stöder visualisering av akrosomen medan GCaMP3-signalen är svag (t.ex. före Ca2+ -bindning, figur 2), och det möjliggör också identifiering av akrosomintakta spermier som är lämpliga för avbildning.
Följande protokoll beskriver användningen av den unika musmodellen AcroSensE och de metoder för mikroskopi som används experimentellt för att studera AE och spermiekalciumdynamik med hög rumslig och tidsmässig upplösning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes enligt riktlinjerna och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Cornell University (#2002-0095). 8-10 veckor gamla AcroSensE-möss2 användes för den aktuella studien. Begäran om information om tillgängligheten av AcroSensE-mössen kan skickas till korresponderande författare.
1. Spermainsamling och tvättning
- Samla in cauda epididymal spermier (mer information om denna procedur finns i11) från AcroSensE-möss. Låt bada i 15 minuter i en 3,5 cm vävnadsodlingsskål som innehåller 0,5 ml modifierat Whittens medium (MW) vid 37 °C. Skålen bör täckas för att minska avdunstningen av MW och bör lutas så att mediet har tillräckligt djup för att täcka cauda bitestiklarna.
OBS: Modifierat Whittens medium (MW) inkluderar 22 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1 mM pyrodruvsyra, 4.8 mM mjölksyra hemi-Ca2+ salt, pH 7.35. Glukos (5,5 mM), NaHCO3 (10 mM) och 2-hydroxipropyl--cyklodextrin (CD; 3 mM) kompletteras (se materialtabell) efter behov för induktion av kapacitering, och koncentrationerna kan modifieras för specifika experiment. Dessutom kan alternativa sterolacceptorer användas i stället för CD (t.ex. bovint serumalbumin eller lipoproteiner med hög densitet). - Använd en fin pincett för att ta bort eventuell bitestikelvävnad från uppsamlingsskålen. Överför mediet som innehåller spermierna till ett 15 ml koniskt rör och centrifugera suspensionen vid 100 x g i 1 minut i en svängande skoprotor vid rumstemperatur. Använd en plastpipett för att ta bort MW-supernatanten som innehåller spermierna från alla grova vävnadsrester som kommer att ha pelleterats i detta steg.
- Värm MW-supernatanten som innehåller spermien till en total volym av 3 ml genom att tillsätta MW vid 37 °C. Centrifugera vid 400 x g i 8 minuter (vid rumstemperatur) i ett rundbottnat rör. Ta långsamt bort supernatanten av MW från den löst pelleterade spermien.
- Om det är livskraftigt bör spermierna se ut som en "fluffig" pellet. Blanda försiktigt om spermierna via triturering med en överföringspipett med stor borrning eller genom försiktiga manuella knackningar på röret ("fingerknäppning"). När de har återsuspenderats jämnt, överför dem till ett nytt rör med rund botten. Använd 10-20 μl av spermiesuspensionen för att räkna och bedöma motiliteten. Späd sperma i MW för användning.
OBS: För de flesta experiment som involverar musspermiekapacitering används en slutlig koncentration på 5-10 miljoner spermier/ml MW. Avbildningsprotokollet som beskrivs här kräver inte kapacitering av spermier, även om det är nödvändigt för spermier att förvärva förmågan att genomgå fysiologiskt relevant akrosomexocytos. Man skulle kunna studera patologisk exocytos eller exocytos inducerad genom reagenser som en kalciumjonofor utan att kapacitera spermierna. Dessutom kan man utforska potentiella förändringar i akrosomalt kalcium i icke-kapaciterade celler som svar på olika stimuli. - Använd spermierna inom 3-5 timmar från insamlingen, håll tiden så kort som möjligt och konsekvent bland experimentella försök.
- Utför alla steg i uppsamling och tvätt vid 37 °C med MW-medium, med metoder för att minimera membranskador. Detta inkluderar användning av plastöverföringspipetter med stor borrning eller pipettspetsar med stor öppning, som rekommenderas för användning under alla stadier av proceduren.
2. Poly-D-lysinbeläggning av täckglas för avbildning
OBS: Rätter med poly-D-lysin (PDL) bör tillagas färska före varje experiment.
- Dosera en 0.5 μL droppe PDL (0.5 mg/ml, se materialtabell) i mitten av en täckglasskål.
- Använd en 10 μL graderad spets och smeta ut PDL-droppen över täckglaset (kors och tvärs som visas i figur 1B).
- Låt torka vid 37 °C i 10 min. Förvara PDL-belagda skålar täckta och vid 37 °C fram till användning.
3. Kapillärdragning, belastning för puffning
- Dra bosilikatglaskapillärer (OD, 2 mm, ID, 1.56 mm, se materialtabell) med följande inställningar - Värme: 330, Drag: 250, Hastighet: 250 och Tid: 70. Det här steget bör optimeras för den specifika avdragare som används.
- Före varje experiment, ladda en enda kapillär med den stimulerande lösningen som innehåller 3-5 gånger koncentrationen av stimulanten (för att ta hänsyn till lösningens snabba diffusion vid puffning). Innan du fyller på, använd en fin pincett för att bryta upp kapillärspetsen cirka 1-2 mm från änden. Detta bör ge en öppningsdiameter på ∼5 μm. Värmepolering krävs inte.
- Använd en tunn plastöverföringspipett och injicera långsamt den stimulerande lösningen i kapillären tills tre fjärdedelar av dess längd är full.
- Ta bort eventuella luftbubblor som bildas under påfyllningen genom att försiktigt snärta med kapillären.
- Montera fylld kapillär på mikromanipulatorn (se materialförteckning).
4. Förberedelse av tillförsel av stimulering för puffning
OBS: För att minimera risken för användarskada bör skyddsglasögon bäras under puffningsproceduren.
- Ställ in inställningarna för encellsleveranssystemet för att ge en 10 s puls vid 5 psi.
- Anslut borosilikatkapillären till pipetthållaren för encellsleveranssystemet. Se till att tätningarna är täta.
- Medan du observerar kapillärspetsen, applicera en kort puff på 2 s vid 20 psi för att säkerställa att lösningen verkligen dispenseras genom spetsens ände (en liten droppe bör vara uppenbar i slutet av spetsen).
5. Mikroskopi och bildtagning
OBS: Flera märken av mikroskop finns tillgängliga och kan användas; En minsta bildfrekvens på 3 bildrutor/s är dock önskvärd. När det gäller temperatur- och miljökontroll, observera att den faktiska temperaturen på mediet i skålen bör bekräftas, t.ex.ample, med en beröringsfri infraröd termometer.
- Tillsätt 80 μL utspädd sperma i mitten av en poly-D-lysinbelagd 35 mm täckglasform. För de flesta experiment som involverar musspermiekapacitering används en slutlig koncentration på 5-10 miljoner spermier/ml.
- Tillsätt långsamt 3 ml varmt (37 °C) MW-basmaterial till spermierna kompletterat med 10 mM CaCl2.
OBS: Man kan utföra experiment vid rumstemperatur för att bromsa cellulära processer, men det är viktigt att notera att eftersom kapacitering medieras av lipidutbyten och fluiditeten i mikro- och makrodomäner, måste man komma ihåg att fysiologiskt relevant kapacitering och akrosomexocytos är temperaturberoende processer. - Montera skålen med spermierna i mikroskopet (förvärmd till 37 °C).
- Excitera GCaMP3 med en 488 nm laserlinje och visa med ett 505-550 nm bandpassfilter (BP). Excitera mCherry med en 555 nm laserlinje och view med ett 575-615 nm BP-filter.
- Använd en mikromanipulator (det rekommenderas att fästa manipulatorn på luftbordet på vilket mikroskopet var uppsatt.), placera kapillärens spets cirka 100 μm åt sidan och 5-10 μm över planet för cellen av intresse.
OBS: De stimulerande lösningarna görs vid 3-5 gånger den normala koncentrationen för att kompensera för den snabba diffusionen som sker i volymen mellan kapillären och cellen. - Starta bildsekvensen på mikroskopet.
- Bilda spermier med en hög bildfrekvens, helst >10 bilder/s. Här användes en resonansskanner som möjliggör avbildning vid 33 ms/bild.
- Tio sekunder efter att du har startat bildinsamlingen på mikroskopet, aktivera encellsleveranssystemet för att initiera 10 s puff av stimulantia.
- Bildceller under en varaktighet av 10-15 min.
- Med hjälp av encellsleveranssystemet avbildar du flera celler från en enda maträtt enligt de platser som anges i figur 1B.
OBS: Obehandlade/icke-stimulerade spermier under mikroskopet ska se mestadels röda ut, med en låg intensitet av den gröna signalen. Spermiehuvuden ska fästas på täckglaset, och levande spermier kan identifieras genom deras rörliga svansar. I spermier som genomgår AE kommer den gröna GCaMP3-signalen initialt att öka, och både den röda mCherry-signalen och GCaMP3-gröna signalen försvinner om AE är klar, som illustreras i figur 2. Minskningen av mCherry-fluorescens ger en mer specifik indikator på den tid då AE börjar eftersom förändringar i Ca2+ -koncentrationer kontinuerligt kommer att orsaka förändringar i GCaMP3-fluorescensintensiteten.
6. Bild- och dataanalys
OBS: Offline-bildanalys utförs med ImageJ (se Materialförteckning). Tidigare rapporterades flera mellansteg i processen som ledde till biverkning, inklusive akrosomal kalciumhöjning (ACR) och full membranfusion. Det senare leder till förlust av mCherry-fluorescens och representerar därför full AE. I vissa celler observeras signaler som liknar pre-spike foot events (PSF) vid användning av amperometriska metoder i studier av exocytos (för mer information, sepunkt 2). Flera valfria metoder finns tillgängliga för att analysera AcroSensE-rådata för att kvantifiera ACR, AE och dess mellanliggande steg. Nedan beskrivs några av de grundläggande analysmetoderna.
- Beroende på det specifika mikroskopsystemets filändelse, använd verktyget för delad kanal (Image > Colors > Split Channels) för att generera individuella fönster för GCaMP3- och mCherry-kanalerna.
- Synkronisera de enskilda fönstren med hjälp av verktyget "Synkronisera fönster" (Analysera > verktyg > Synkronisera fönster).
- Välj ett intresseområde (ROI) runt spermiehuvudet i den röda kanalen för att inkludera akrosomregionen (Figur 3A,B). Synkroniseringsverktyget gör att samma områdesval kan tillämpas automatiskt på den gröna kanalen, där spermierna fortfarande är för svaga för att vara synliga.
- Välj plugin-programmet "Z Profiler" (Plugins > Stacks > Z Profiler) eller "Time Series Analyzer" (Plugins > Stacks > Time Series Analyzer) för att plotta förändringen i fluorescensintensitet som en funktion av bildrutor/tid för var och en av de två kanalerna.
- Kopiera data till ett kalkylprogram (t.ex. Microsoft Excel) för plottning och vidare analys.
OBS: När data har kopierats till ett kalkylblad kan flera parametrar extraheras för analys, inklusive följande, som illustreras i figur 4.- Starttid för Fusion Pore (FP): mät tiden från tidpunkt 0 till den tidpunkt då GCaMP3-signalen börjar stiga. Denna parameter indikerar fördröjningen mellan stimuleringen och spermiernas ACR-svar.
- AE-starttid: mät tiden från tidpunkt 0 till den tidpunkt då mCherry-signalen börjar förfalla. Denna parameter indikerar fördröjningen mellan stimuleringen och spermiernas AE-svar. Denna parameter kan också användas för att beräkna fördröjningen mellan FP-bildning och AE-respons.
- Peak FP amplitud: mät fluorescenssignalen från basen till toppen av GCaMP3-signalökningen. Den här parametern anger den totala ökningen av ACR-svaret.
- Förlusthastighet för mCherry: bestäm denna parameter genom en linjär eller exponentiell anpassning på sektionen av mCherry-signalförlusten (som indikeras av "lutning" i figur 4B).
OBS: Alternativt, bestäm avklingningshastigheten med residualsignalmetoden (R) vid olika tidpunkter (t.ex. R60: varaktighetstid i sekunder till en restsignal på 60 % från baslinjen för mCherry-signalen). Denna parameter kan användas för att kvantifiera den hastighet med vilken det akrosomala innehållet dispergeras vid AE. - Signalminskning för mCherry-förlust: bestäm skillnaden i amplitud mellan baslinjen för mCherry-fluorescensintensitet och signalen efter AE. Denna parameter anger den totala mängden akrosomalt innehåll som sprids vid AE.
- Plotta förändringarna i fluorescens (F) för både den röda och den gröna kanalen som rådata, eller normalisera dem med den initiala fluorescensen (F0) och uttryck dem som ΔF/F0. Det senare ger bättre visualisering av förändringarna i både rött och grönt på ett enda diagram (se t.ex. figur 3D och figur 3H).
OBS: Slutligen kan de olika uppmätta parametrarna jämföras mellan olika förhållanden för att bestämma förhållandet mellan förändringar i akrosomal kalciumkoncentration och AE. För exempel på olika experimentella betingelser, se referens2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 ger en förenklad illustration som visar sekvensen av fluorescensförändringar som förväntas efter framgångsrik stimulering av spermier. Den övre panelen i figur 2 illustrerar förändringarna i GCaMP3-fluorescensintensiteten, där signalen initialt är svag (baslinjekoncentrationerna av akrosomalt kalcium är lägre än GCaMP3 KD), och vid inträde av kalciumjoner via fusionsporer ökar fluorescensen i ljusstyrka. Slutligen, vid AE, sker en förlust av signal på grund av diffusion och förlust av sensorn till det extracellulära utrymmet. Den nedre panelen i figur 2 illustrerar förändringarna i mCherry-fluorescensintensiteten, där den initiala signalen är ljus, och endast vid AE och diffusion av sensorn tillsammans med annat innehåll i den akrosomala matrisen sker en försvagning av den röda signalen.
Figur 3 ger faktiska uppmätta data för de stadier som illustreras ovan i två levande spermier stimulerade med 125 μM av gangliosiden GM1 (för mer information om hur GM1 reglerar AE i spermier12), fångade i ett enda synfält. Figur 3A,B och Figur 3E,F visar de röda och gröna signalerna uppmätta i två spermier vid tidpunkt 0 (före stimulering), där mCherry-signalen initialt är ljus och GCaMP3 är svag. Figur 3C, figur 3G och figur 3D, figur 3H ger Z Profiler-analysen under hela experimentets varaktighet (rådata eller F/F0respektive). Infoga paneler ger en inzoomad vy av tidsfönstret där ACR och AE inträffar.
Eftersom spermier är både mycket heterogena och mycket känsliga för membranskador på grund av olika hanteringsprocedurer, ger figur 5 exempel på två typer av negativa resultat. Figur 5A,C visar flera spermier som fångats inom ett synfält. Den gula konturen markerar två spermier som visar en hög GCaMP3-signal vid tidpunkt 0 (före stimulering). I de aktuella experimenten undveks sådana celler, eftersom de indikerar att den akrosomala vesikeln redan genomgår någon membranfusionsprocess eller att de har upplevt någon membranskada som gör att kalcium kan läcka. Spermierna i figur 5A som indikeras av pilen (cirkel ROI i figur 5A,C) visar en initial mCherry-signal men ingen respons i de röda eller gröna kanalerna (figur 5B,D, som visar Z-Profiler-analysfönstret som tillhandahålls av ImageJ) efter stimulering med 125 μM GM1. Även om en subpopulation av spermier, som den som anges i det här exemplet, inte visar något svar på stimulering, ingår dessa i den slutliga analysen och beräknas i analysen av procentuell responsdata2 (figur 3).
Figur 1: Instrumentering och experimentell uppställning. A) Levande spermier på en PDL-belagd täckglasskål placerad i en inkubationskammare vid 37 °C. En borosilikatkapillär, som dras och fästs vid ett encellsleveranssystem, är placerad nära spermien i mitten av avbildningsområdet för direkt tillförsel av stimulantia. Både gröna (GCaMP3) och röda (mCherry) kanaler övervakas kontinuerligt och spelas in med hög bildhastighet (t.ex. 10 bilder/s) under stimulering. (B) Schematisk framställning av PDL-avsättningsmönstret på täckglaset. (C) Schematisk representation av de specifika områden på skålen där spermier kan stimuleras med hjälp av kapillären för att minimera icke-specifik stimulering från tidigare puffar i samma skål. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Förändringar i fluorescenssignal och intensitet. Topppanel: En ökning av GCaMP3-signalen innebär kalciuminflöde till akrosomen, följt av signalförlust på grund av diffusion av AcroSensE-fusionsproteinet. Bottenpanel: mCherry-signalen förblir stabil under initial membranfusion, med efterföljande försvagning vid AcroSensE-diffusion och akrosomal exocytos (AE). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa data och fluorescensspår. Ett fält med två spermier avbildades. Grön/röd kanalfluorescens kvantifierades offline med hjälp av ImageJ och plottades i Excel (enligt beskrivningen i steg 6). (A-D) Kvantifiering av fluorescensintensiteten i röd (A) och grön (B) kanal för cell #1 över tid, beräknad för valda ROI:er och sedan presenterad som rådata (C) eller normaliserad till den initiala signalen (D, F/F0). Insatsen i (D) ger en inzoomad vy av tidsramen från 25-125 s. (E-H) Kvantifiering av röd (E) och grön (F) kanalfluorescensintensitet för cell #2 över tid, beräknad för valda ROI:er och sedan presenterad som rådata (G) eller normaliserad till den initiala signalen (H, F/F0). Insatsen i (H) ger en inzoomad vy av tidsramen från 25-125 s. Skalstapel = 5 μm. Alla x-axlar representerar tid i sekunder (s). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Parametrar för dataanalys och kvantifiering. (A) Illustration av ett typiskt GCaMP3-spår av fluorescensintensitet, som visar kvantifierbara parametrar, inklusive starttid (sekunder), amplitud (fluorescensintensitet) och varaktighet (sekunder). (B) Illustration av ett typiskt mCherry-fluorescensintensitetsspår, som visar kvantifierbara parametrar, inklusive starttid (sekunder), varaktighet (sekunder), lutning (F/s), R60 (fluorescensintensitet) och amplitud (fluorescensintensitet). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Negativa resultat. (A,C) mCherry (röd) och GCaMP3 (grön) kanaler som visar flera spermier fångade i ett enda synfält. Pilen i (A) indikerar en spermie som initialt uppvisar mCherry-fluorescens men inga efterföljande förändringar av fluorescensintensiteten som svar på 125 μM GM1-stimulering, vilket observerats i de Z-Profiler-genererade spåren i (B) (mCherry) och (D) (GCaMP3). Celler inom den gula rektangeln uppvisar förhöjd GCaMP3-fluorescensintensitet vid tidpunkt 0, före stimulering. Skalstapel = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskrivs en mikroskopibaserad metod för att använda den nygenererade AcroSensE-musmodellen för realtidsövervakning och analys av samspelet mellan akrosomal kalciumdynamik och mellansteg som leder till AE. Tillsammans med lättillgängliga genetiska metoder, såsom korsning med andra musgenetiska modeller eller genredigering, ger denna modell och metod ett kraftfullt system för att studera rollen för olika komponenter och vägar som deltar i spermiesignalvägar relaterade till kapacitering, AE och befruktning.
Kritiska steg
Det är viktigt att i alla steg i spermiehanteringen använda plastöverföringspipetter med stor diameter eller pipettspetsar med stor öppning och att utföra alla steg för insamling och tvättning vid 37 °C för att minimera membranskador. På samma sätt är en svängskopsrotor att föredra framför en rotor med fast vinkel för att undvika membranskador på grund av att celler interagerar med mikrocentrifugrörets sidovägg. Om Z-positionsdriftkorrigering är tillgänglig, rekommenderas starkt att använda hårdvara/programvara för z-positionskorrigering för att undvika att den avbildade spermien driver ut ur fokalplanet under avbildningsintervallet.
Modifieringar och felsökning
Protokollet som beskrivs här har optimerats för studier av lipidmedierad signalering 2,3 och kan tillämpas på både kapaciterade och icke-kapaciterade spermier. Olika metoder för spermiekapacitering kan användas; Till exempel kan antingen albumin eller cyklodextrin fungera som sterolacceptorer. Dessutom kan olika energisubstrat eller bikarbonat läggas till eller utelämnas. Observera dock att bikarbonat kommer att bildas i vattenhaltiga medier från exponering för luft, så testning av verkligt "bikarbonatfria" förhållanden skulle kräva noggrann användning av en kvävemiljö i alla steg av tillverkningen/beredningen/hanteringen av mediet och utförandet av experimentet. Protokollet ovan inkluderar användning av 10 mM kalcium tillsatt till den experimentella lösningen; Kalciumjoner kan dock utelämnas, kelateras (t.ex. EGTA) eller tillsättas i lägre koncentrationer för kalciumkänsliga experimentella tillämpningar. Observera att sänkning eller utelämnande av kalciumkoncentrationer kommer att minska den förväntade GCaMP3-signalen vid AE2. Dessutom kan man använda andra medier för detta protokoll (jämfört med MW som används här) som bättre passar deras experimentella design och mål. Det tillhandahållna protokollet beskriver användningen av encellsavbildning och encellsleverans av stimulantia; En förenklad variation kan dock uppnås genom bulkstimulering, till exempel genom att tillsätta det stimulerande reagenset till hela rätten och inte genom puffning. Dessutom är det möjligt att utföra experiment i hela populationen med hjälp av AcroSensE-modellen med hjälp av fluorimetrar eller plattläsare med fluorescensförmåga.
Begränsningar
Metoden som tillhandahålls här kräver tillgänglighet, underhåll och användning av en AcroSensE-muskoloni. Metoden är också beroende av tillgången till ett avancerat bildsystem, vilket är kostsamt och kräver utbildad personal. För vissa experimentella tillämpningar gäller en möjlig begränsning oförmågan att samtidigt mäta cytosoliskt kalcium i AcroSensE-spermier, eftersom många tillgängliga syntetiska kalciumindikatorer har liknande våglängd som GCaMP3. Även om det ligger utanför ramen för detta protokoll, kan potentiella begränsningar av experiment på populationsnivå inkludera avläsning av mCherry-signalen efter AE och spridning i mediet eller GCaMP3-signalen som kommer från döda/permeabiliserade celler. För att optimera sådana metoder kan man utforska att använda z-fokusering för att minimera bakgrundsbrus från utsöndrat mCherry och/eller använda skenbehandlade kontroller för att säkerställa GCaMP-kvantifiering från döda eller permeabiliserade spermier.
Metodens betydelse i förhållande till befintliga/alternativa metoder
Under de senaste två decennierna har det rapporterats om flera metoder för realtidsstudier av AE-dynamik i levande spermier, inklusive akrosomriktade GFP-transgena möss7, kalciumfärgämnen laddade i akrosomen (t.ex. Fluo-412), eller användning av exocytosspecifika indikatorer som det syntetiska färgämnet FM-6413. Men i jämförelse med dessa metoder ger AcroSensE-modellen bekvämligheten att använda minimalt behandlade spermier som inte kräver någon färgladdning eller andra potentiellt membranstörande procedurer. Viktigt är att det finns en stor fördel med att ha spermier som uttrycker en dubbel indikator som kan övervaka akrosomal kalciumdynamik, membranfusion och porbildning, såväl som AE och den därav följande frisättningen av akrosomalt innehåll.
Metodens betydelse och potentiella tillämpningar inom specifika forskningsområden
Observera att de experimentella applikationsexemplen nedan kan utföras som encells- eller populationsanalyser, där det senare har betydande fördelar när analys med hög genomströmning önskas. Studier av AE-dynamik i olika musmodeller kan utföras med hjälp av korsning med AcroSensE-musmodellen, inklusive (1) noll- eller muterade former av olika kalciumkanaler eller kalciumkanalsubenheter (t.ex. korsning med α1E- och CatSper-null-modeller); (2) noll- eller muterade former av proteiner som förmedlar membranfusion (t.ex. SNAREs). Dessutom kan studier genomföras för att undersöka hur olika farmakologiska medel relaterade till olika signalvägar modulerar akrosomalt kalcium och AE-dynamik. Vidare kan forskning bedrivas om hur miljöförändringar påverkar AE, inklusive temperatur, pH och närvaro eller koncentration av olika joner eller små molekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga författare har intressekonflikter att rapportera relaterade till detta arbete.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health-anslagen R01-HD093827 och R03-HD090304 (A.J.T).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
References
- Austin, C. R. Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg. Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).
- Cohen, R., et al. A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis. J Biol Chem. 298 (5), 101868 (2022).
- Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J.
- Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm. J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).
- Sosa, C. M., et al. Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis). Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).
- Balestrini, P. A., et al. Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time. Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).
- Nakanishi, T., et al. Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein. FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).
- Kim, K. S., Gerton, G. L. Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm. Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).
- Hasuwa, H., et al. Transgenic mouse sperm that have green acrosome and red mitochondria allow visualization of sperm and their acrosome reaction in vivo. Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science. 59 (1), 105-107 (2010).
- Henderson, M. J., et al. A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store. PloS one. 10 (10), 0139273 (2015).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. J Biol Chem. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Cohen, R., et al. Lipid modulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis and fertilization. Dev Cell. 28 (3), 310-321 (2014).
- Sanchez-Cardenas, C., et al. Acrosome reaction and Ca(2)(+) imaging in single human spermatozoa: new regulatory roles of [Ca(2)(+)]i. Biol Reprod. 91 (2), 67 (2014).
