Summary
Burada açıklanan AcroSensE fare modeli ve canlı hücre görüntüleme yöntemleri, sperm akrozomunun hücre altı bölmesindeki kalsiyum dinamiklerini ve bunların membran füzyonu ve akrozom ekzositozuna yol açan ara adımları nasıl düzenlediğini incelemek için yeni bir yaklaşım sağlar.
Abstract
Spermin tek ekzositik vezikülünün plazma zarı ile birleştiği akrozom ekzositozu (AE), döllenme için gerekli olan karmaşık, kalsiyuma bağımlı bir süreçtir. Bununla birlikte, kalsiyum sinyalinin AE'yi nasıl düzenlediğine dair anlayışımız hala eksiktir. Özellikle, intraakrozomal kalsiyum dinamikleri ile AE'ye giden ara adımlar arasındaki etkileşim iyi tanımlanmamıştır. Burada, akrozomal kalsiyum dinamikleri ve bunların membran füzyonu ve ardından akrozom vezikülünün ekzositozu ile ilişkisi hakkında uzamsal ve zamansal bilgiler sağlayan bir yöntemi açıklıyoruz. Yöntem, Ekzositoz için Akrozom hedefli bir Sensörü (AcroSensE) eksprese eden yeni bir transgenik fare kullanır. Sensör, mCherry ile kaynaşmış genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum göstergesini (GCaMP) birleştirir. Bu füzyon proteini, akrozomal kalsiyum dinamiği ve membran füzyon olaylarının eşzamanlı gözlemini sağlamak için özel olarak tasarlanmıştır. Canlı AcroSensE sperminde akrozomal kalsiyum dinamiklerinin ve AE'nin gerçek zamanlı izlenmesi, yüksek kare hızlı görüntüleme ve tek spermi hedefleyebilen bir uyarıcı dağıtım sisteminin bir kombinasyonu kullanılarak elde edilir. Bu protokol ayrıca ham verileri ölçmek ve analiz etmek için birkaç temel yöntem örneği sağlar. AcroSensE modeli genetik olarak kodlandığından, diğer fare genetik modelleriyle melezleme veya gen düzenleme (CRISPR) tabanlı yöntemler gibi hazır genetik araçlar kullanılarak bilimsel önemi artırılabilir. Bu strateji ile ek sinyal yolaklarının sperm kapasitasyonu ve döllenmedeki rolleri çözülebilir. Özetle, burada açıklanan yöntem, belirli bir hücre altı bölmedeki (sperm akrozomunda) kalsiyum dinamiklerini ve bu dinamiklerin membran füzyonu ve akrozom ekzositozuna yol açan ara adımları nasıl düzenlediğini incelemek için uygun ve etkili bir araç sağlar.
Introduction
Sperm, kapasitasyon1 adı verilen bir işlem sırasında döllenme yeteneği kazanır. Bu sürecin bir son noktası, spermin AE'ye girme yeteneğini kazanmasıdır. Yirmi yılı aşkın veriler, memeli sperminde karmaşık, çok adımlı bir AE modelinin varlığını desteklemektedir (2,3'te özetlenmiştir). Bununla birlikte, AE'yi canlı spermde incelemek zordur ve bu süreci yeterli çözünürlükle izlemek için şu anda mevcut olan yöntemler zahmetlidir ve birden fazla hazırlık adımı gerektirir4, AE'nin son adımının tespiti ile sınırlıdır (ör., PNA5 kullanılarak), sitozolik kalsiyumdaki değişikliklerin ölçümleri ile sınırlıdır (akrozomal kalsiyum dinamiklerinin aksine), veya sitozolik kalsiyum dinamiği veya AE6 ölçümleriyle sınırlıdır.
Fizyolojik koşullar altında gerçek zamanlı AE çalışmalarının bazı temel sınırlamalarının üstesinden gelmek ve kalsiyum dinamiği ile AE arasındaki etkileşimin araştırılmasını sağlamak için benzersiz bir fare modeli oluşturuldu. Bu fare modelinde, genetik olarak kodlanmış Ca2 + sensörü (GCaMP3) ve mCherry'den oluşan bir füzyon proteini eksprese edilir ve bir akrosin promotörü ve sinyal peptidi2 kullanılarak akrozoma hedeflenir. Hedeflenen çift GCaMP3-mCherry sensörü, mikroskopi ve tek hücreli uyarıcı dağıtım sistemi kullanılarak fizyolojik koşullar altında canlı spermdeki kalsiyum konsantrasyonlarının ve akrozomal içeriğin durumunun eş zamanlı gerçek zamanlı ölçümlerini sağlar (Şekil 1). Akrozomal matrisin bir bileşeni olarak, membran füzyonu ve AE, bu protein akrozom vezikülünden dışarı yayıldığından, spermden fototable ve pH'a duyarsız mCherry floresansının kaybına neden olur. Bu bağlamda, modelin AE'nin zamanlamasını ve oluşumunu yansıtma yeteneği, akrozom hedefli GFP fare serisi 7,8,9'un faydalarına benzer.
Bu transgenik fare serisinde kullanılan GCaMP3 varyantı, yaklaşık 400 μM'lik bir KD'ye ve bu vezikül için uygun olan 10-4-10-3 M 10'luk Ca2+ için dinamik bir aralığa sahiptir. GCaMP3'ün bu özellik kombinasyonunun, plazma membranı ile dış akrozomal membran (OAM)2 arasında füzyon gözenek oluşumunu ortaya çıkarabileceğini gösterdik. Füzyon gözenek tespiti, gözenek boyutunun AcroSensE proteininin akrozomdan dağılmasına izin vermeyecek kadar küçük olmasının bir sonucudur (akrozom içeriğinin kaybı yoluyla) ve Ca2+ iyonlarının akrozom lümenine akışını sağlayan bir membran "kanalı" sağlar, GCaMP3'ün floresan yoğunluğunda bir artışa yol açar.
Parlak, monomerik, kalsiyuma duyarlı olmayan floresan protein mCherry, GCaMP3 sinyali zayıfken (örneğin, Ca2+ bağlanmadan önce, Şekil 2) akrozomun görselleştirilmesini destekler ve daha da önemlisi, görüntüleme için uygun akrozom-bozulmamış sperm hücrelerinin tanımlanmasına da izin verir.
Aşağıdaki protokol, benzersiz AcroSensE fare modelinin kullanımını ve AE ve sperm kalsiyum dinamiklerini yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle incelemek için deneysel olarak kullanılan mikroskopi yöntemlerini açıklamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri yönergelere göre gerçekleştirildi ve Cornell Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı (#2002-0095). Bu çalışma için 8-10 haftalık AcroSensE fareleri2 kullanıldı. AcroSensE farelerin kullanılabilirliği hakkında bilgi talepleri ilgili yazara gönderilebilir.
1. Sperm toplama ve yıkama
- AcroSensE farelerinden kauda epididimal spermi toplayın (bu prosedürle ilgili daha fazla ayrıntı11'de verilmiştir). 37 ° C'de 0,5 mL Modifiye Whitten ortamı (MW) içeren 3,5 cm'lik bir doku kültürü kabında 15 dakikalık yüzme prosedürüne izin verin. MW'nin buharlaşmasını azaltmak için çanak örtülmeli ve ortam kauda epididimitlerini örtmek için yeterli derinliğe sahip olacak şekilde eğilmelidir.
NOT: Modifiye Whitten'in ortamı (MW), 22 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1 mM pirüvik asit, 4.8 mM laktik asit hemi-Ca2+ tuzu, pH 7.35 içerir. Glikoz (5.5 mM), NaHCO3 (10 mM) ve 2-hidroksipropil - siklodekstrin (CD; 3 mM), kapasitasyon indüksiyonu için gerektiği gibi desteklenir (Malzeme Tablosuna bakınız) ve konsantrasyonlar spesifik deneyler için değiştirilebilir. Ek olarak, CD yerine alternatif sterol alıcıları kullanılabilir (ör., sığır serum albümini veya yüksek yoğunluklu lipoproteinler). - İnce forseps kullanarak, yüzme toplama kabından herhangi bir epididimal dokuyu çıkarın. Sperm içeren ortamı 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve süspansiyonu oda sıcaklığında sallanan bir kova rotorunda 1 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyin. Plastik bir pipet kullanarak, spermi içeren MW süpernatanı, bu adımda peletlenecek herhangi bir brüt doku kalıntısından çıkarın.
- Spermi içeren MW süpernatanı 37 ° C'de MW ekleyerek toplam 3 mL hacme getirin. Yuvarlak tabanlı bir tüpte 400 x g'da 8 dakika (oda sıcaklığında) santrifüjleyin. MW'nin süpernatantını gevşek peletlenmiş spermden yavaşça çıkarın.
- Canlıysa, sperm "kabarık" görünümlü bir topak olarak görünmelidir. Spermi, büyük delikli bir transfer pipeti ile öğütme yoluyla veya tüpe hafif manuel dokunuşlarla ("parmak hareketi") nazikçe yeniden süspanse edin. Eşit şekilde yeniden süspanse edildikten sonra, bunları yeni bir yuvarlak tabanlı tüpe aktarın. Hareketliliği saymak ve değerlendirmek için 10-20 μL sperm süspansiyonu kullanın. Kullanım için spermi MW cinsinden seyreltin.
NOT: Fare sperm kapasitasyonunu içeren çoğu deney için, 5-10 milyon sperm / mL MW'lık bir nihai konsantrasyon kullanılır. Burada tarif edilen görüntüleme protokolü, spermin fizyolojik olarak ilgili akrozom ekzositozuna girme yeteneğini kazanması gerekmesine rağmen, spermin kapasitasyonunu gerektirmez. Spermi kapasitif hale getirmeden kalsiyum iyonofor gibi reaktifler yoluyla indüklenen patolojik ekzositoz veya ekzositoz incelenebilir. Ek olarak, çeşitli uyaranlara yanıt olarak kapasitif olmayan hücrelerde akrozomal kalsiyumdaki potansiyel değişiklikler araştırılabilir. - Spermi toplandıktan sonra 3-5 saat içinde kullanın, süreyi mümkün olduğunca kısa tutun ve deneysel denemeler arasında tutarlı olun.
- Membran hasarını en aza indirecek yöntemler kullanarak MW ortamı kullanarak tüm toplama ve yıkama adımlarını 37 °C'de gerçekleştirin. Bu, prosedürün tüm aşamalarında kullanılması önerilen büyük delikli plastik transfer pipetlerinin veya büyük delikli pipet uçlarının kullanımını içerir.
2. Görüntüleme için lamel tabakların poli-D-lizin kaplaması
NOT: Poli-D-lizin (PDL) kapları her deneyden önce taze olarak hazırlanmalıdır.
- Bir lamel kabının ortasına 0,5 μL'lik bir PDL damlası (0,5 mg/mL, Malzeme Tablosuna bakınız) dağıtın.
- 10 μL dereceli bir uç kullanarak, PDL damlacığını lamel boyunca sürün ( Şekil 1B'de gösterildiği gibi çapraz desen).
- 37 °C'de 10 dakika kurumaya bırakın. PDL kaplı tabakları kullanana kadar kapalı ve 37 °C'de tutun.
3. Kılcal çekme, şişirme için yükleme
- Borosilikat cam kılcal damarları (OD, 2 mm, ID, 1.56 mm, Malzeme Tablosuna bakın) aşağıdaki ayarları kullanarak çekin: Isı: 330, Çekme: 250, Hız: 250 ve Zaman: 70. Bu adım, kullanımdaki belirli çektirme için optimize edilmelidir.
- Her deneyden önce, uyarıcının konsantrasyonunun 3-5 katını içeren uyarıcı çözelti ile tek bir kılcal damar yükleyin (çözeltinin şişirildikten sonra hızlı difüzyonunu hesaba katmak için). Doldurmadan önce, kılcal ucu uçtan yaklaşık 1-2 mm uzakta kırmak için ince cımbız kullanın. Bu, ∼5 μm'lik bir açıklık çapı üretmelidir. Isı parlatma gerekli değildir.
- İnce bir plastik transfer pipeti kullanarak, uyarıcı çözeltiyi, uzunluğunun dörtte üçü dolana kadar kılcal damara yavaşça enjekte edin.
- Doldurma sırasında oluşan hava kabarcıklarını kılcal damarı hafifçe vurarak çıkarın.
- Doldurulmuş kılcal damarı mikromanipülatöre monte edin (Malzeme Tablosuna bakın).
4. Şişirme için stimülasyon verilmesinin hazırlanması
NOT: Kullanıcının yaralanma riskini en aza indirmek için, şişirme prosedürünün çalışması sırasında koruyucu gözlük takılmalıdır.
- Tek hücreli dağıtım sistemi ayarlarını 10 psi'de 5 s'lik bir darbe sağlayacak şekilde ayarlayın.
- Borosilikat kılcalını tek hücreli dağıtım sistemi pipet tutucusuna bağlayın. Contaların sıkı olduğundan emin olun.
- Kılcal ucu gözlemlerken, çözeltinin gerçekten ucun ucundan dağıtıldığından emin olmak için 2 psi'de 20 s'lik kısa bir nefes uygulayın (ucun ucunda küçük bir damla belirgin olmalıdır).
5. Mikroskopi ve görüntü elde etme
NOT: Birden fazla mikroskop markası mevcuttur ve kullanılabilir; Bununla birlikte, minimum 3 kare/sn kare hızı arzu edilir. Sıcaklık ve çevre kontrolü ile ilgili olarak, çanaktaki ortamın gerçek sıcaklığının, örneğin temassız bir kızılötesi termometre kullanılarak doğrulanması gerektiğini lütfen unutmayın.
- Poli-D-lizin kaplı 35 mm'lik bir lamel kabının ortasına 80 μL seyreltilmiş sperm ekleyin. Fare sperm kapasitasyonunu içeren çoğu deney için, 5-10 milyon sperm / mL'lik bir nihai konsantrasyon kullanılır.
- Sperme, 10 mM CaCl2 ile desteklenmiş 3 mL ılık (37 ° C) MW baz ortamını yavaşça ekleyin.
NOT: Hücresel süreçleri yavaşlatmak için oda sıcaklığında deneyler yapılabilir, ancak kapasitasyona lipid değişimleri ve mikro ve makro alanların akışkanlığı aracılık ettiğinden, fizyolojik olarak ilgili kapasitasyon ve akrozom ekzositozunun sıcaklığa bağlı süreçler olduğu akılda tutulmalıdır. - Çanağı sperm ile mikroskoba monte edin (önceden 37 ° C'ye ısıtılmış).
- GCaMP3'ü 488 nm lazer çizgisi kullanarak heyecanlandırın ve 505-550 nm bant geçiren (BP) filtreyle görüntüleyin. 555 nm lazer çizgisi kullanarak mCherry'yi heyecanlandırın ve 575-615 nm BP filtresiyle görüntüleyin.
- Bir mikromanipülatör kullanarak (manipülatörün mikroskobun kurulduğu hava tablasına takılması önerilir.), kılcal damarın ucunu yaklaşık 100 μm yana ve ilgilenilen hücrenin düzleminin 5-10 μm yukarısına yerleştirin.
NOT: Uyarıcı çözeltiler, kılcal damar ve hücre arasındaki hacimde meydana gelen hızlı difüzyonu telafi etmek için normal konsantrasyonun 3-5 katında yapılır. - Mikroskopta görüntüleme dizisini başlatın.
- Sperm hücrelerini yüksek kare hızında, tercihen >10 kare/sn'de görüntüleyin. Burada, 33 ms/karede görüntülemeyi sağlayan bir rezonans tarayıcı kullanıldı.
- Mikroskopta görüntü alımını başlattıktan on saniye sonra, 10 saniyelik uyarıcı nefesini başlatmak için tek hücreli dağıtım sistemini etkinleştirin.
- 10-15 dakikalık bir süre için görüntü hücreleri.
- Tek hücreli dağıtım sistemini kullanarak, Şekil 1B'de verilen konumlara göre tek bir tabaktan birden fazla hücreyi görüntüleyin.
NOT: Mikroskop altında tedavi edilmemiş/uyarılmamış spermler, yeşil sinyalin düşük yoğunluğu ile çoğunlukla kırmızı görünmelidir. Sperm başları lamel üzerine tutturulmalıdır ve canlı spermler hareketli kuyrukları ile tanımlanabilir. AE geçiren spermlerde, GCaMP3 yeşil sinyali başlangıçta artacak ve Şekil 2'de gösterildiği gibi AE tamamlandığında hem mCherry kırmızı sinyali hem de GCaMP3 yeşil sinyali kaybolacaktır. mCherry floresansının azaltılması, AE'nin başladığı zamanın daha spesifik bir göstergesini sağlar, çünkü Ca2+ konsantrasyonlarındaki değişiklikler sürekli olarak GCaMP3 floresan yoğunluğunda değişikliklere neden olacaktır.
6. Görüntü ve veri analizi
NOT: Çevrimdışı görüntü analizi ImageJ kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Daha önce, AE'ye yol açan süreçte akrozomal kalsiyum artışı (ACR) ve tam membran füzyonu dahil olmak üzere birkaç ara adım bildirilmişti. İkincisi, mCherry floresan kaybına yol açar ve bu nedenle tam AE'yi temsil eder. Bazı hücrelerde, ekzositoz çalışmalarında amperometrik yaklaşımlar kullanılırken başak öncesi ayak olaylarına (PSF) benzer sinyaller gözlenir (daha fazla ayrıntı için lütfenbkz. 2). ACR, AE ve ara adımlarını ölçmek için AcroSensE ham verilerini analiz etmek için çeşitli isteğe bağlı yöntemler mevcuttur. Aşağıda bazı temel analitik yöntemler açıklanmaktadır.
- Belirli mikroskop sistemi dosya uzantısına bağlı olarak, GCaMP3 > mCherry kanalları için ayrı pencereler oluşturmak üzere bölünmüş kanal aracını (Görüntü > Renkler ve Bölünmüş Kanallar) kullanın.
- "Pencereyi Senkronize Et" aracını kullanarak tek tek pencereleri senkronize edin (Pencereleri Senkronize Et > > Araçlarını Analiz Et).
- Akrozom bölgesini dahil etmek için kırmızı kanaldaki sperm başının etrafında bir ilgi alanı (ROI) seçin (Şekil 3A,B). Senkronizasyon aracı, aynı alan seçiminin, spermin hala görülemeyecek kadar loş olduğu yeşil kanala otomatik olarak uygulanmasını sağlar.
- Floresan yoğunluğundaki değişimi iki kanalın her biri için karelerin/zamanın bir fonksiyonu olarak çizmek için "Z Profiler" eklentisini (Eklentiler > Yığınları > Z Profiler) veya "Zaman Serisi Çözümleyicisi" (Zaman Serisi Çözümleyicisi > Yığınları > Eklentileri) seçin.
- Çizim ve daha fazla analiz için verileri bir elektronik tablo yazılımına (örneğin, Microsoft Excel) kopyalayın.
NOT: Veriler bir elektronik tabloya kopyalandıktan sonra, Şekil 4'te gösterildiği gibi aşağıdakiler de dahil olmak üzere analiz için birden fazla parametre çıkarılabilir.- Fusion Pore (FP) başlangıç zamanı: 0 zaman noktasından GCaMP3 sinyalinin yükselmeye başladığı zaman noktasına kadar geçen süreyi ölçün. Bu parametre, stimülasyon ile sperm ACR yanıtı arasındaki gecikmeyi gösterir.
- AE başlangıç zamanı: 0 zaman noktasından mCherry sinyalinin bozulmaya başladığı zaman noktasına kadar geçen süreyi ölçün. Bu parametre, stimülasyon ile sperm AE yanıtı arasındaki gecikmeyi gösterir. Bu parametre, FP oluşumu ile AE yanıtı arasındaki gecikmeyi hesaplamak için de kullanılabilir.
- Tepe FP genliği: floresan sinyalini tabandan GCaMP3 sinyal artışının zirvesine kadar ölçün. Bu parametre, ACR yanıtındaki toplam artışı gösterir.
- mCherry kayıp oranı: bu parametreyi mCherry sinyal kaybının kesitine doğrusal veya üstel bir uyumla belirleyin ( Şekil 4B'de "eğim" ile gösterildiği gibi).
NOT: Alternatif olarak, çeşitli zaman noktalarında artık (R) sinyal yöntemiyle bozunma oranını belirleyin (örneğin, R60: mCherry sinyalinin taban çizgisinden% 60'lık bir artık sinyale saniye cinsinden süre). Bu parametre, akrozomal içeriğin AE üzerine dağılma hızını ölçmek için kullanılabilir. - mCherry kaybı için sinyal azalması: temel mCherry floresan yoğunluğu ile AE'yi takip eden sinyal arasındaki genlik farkını belirleyin. Bu parametre, AE üzerine dağılmış toplam akrozomal içerik miktarını gösterir.
- Hem kırmızı hem de yeşil kanallar için floresanstaki (F) değişiklikleri ham veri olarak çizin veya bunları ilk floresan (F0) ile normalleştirin ve ΔF/F0 olarak ifade edin. İkincisi, tek bir grafikte hem kırmızı hem de yeşil renkteki değişikliklerin daha iyi görselleştirilmesini sağlar (örneğin, bkz. Şekil 3D ve Şekil 3H).
NOT: Son olarak, akrozomal kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikler ile AE arasındaki ilişkiyi belirlemek için ölçülen farklı parametreler farklı koşullar arasında karşılaştırılabilir. Çeşitli deneysel koşul karşılaştırmalarının örnekleri için referans2'ye bakın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2 , spermin başarılı bir şekilde uyarılmasını takiben beklenen floresan değişikliklerinin sırasını gösteren basitleştirilmiş bir resim sunmaktadır. Şekil 2'nin üst paneli, sinyalin başlangıçta loş olduğu (temel akrozomal kalsiyum konsantrasyonları GCaMP3 KD'den daha düşüktür) ve kalsiyum iyonlarının füzyon gözeneklerinden girmesi üzerine GCaMP3 floresan yoğunluğundaki değişiklikleri göstermektedir. Son olarak, AE üzerine, difüzyon ve sensörün hücre dışı boşluğa kaybı nedeniyle bir sinyal kaybı olur. Şekil 2'nin alt paneli, ilk sinyalin parlak olduğu ve yalnızca AE ve akrozomal matrisin diğer içeriği ile birlikte sensörün difüzyonu üzerine kırmızı sinyalin karartıldığı mCherry floresan yoğunluğundaki değişiklikleri göstermektedir.
Şekil 3 , 125 μM gangliosid GM1 ile uyarılan iki canlı spermde (GM1'in sperm12'de AE'yi nasıl düzenlediği hakkında daha fazla ayrıntı için) yukarıda gösterilen aşamalar için gerçek ölçülen verileri sağlar. Şekil 3A, B ve Şekil 3E, F, 0 zaman noktasında (stimülasyondan önce) iki spermde ölçülen kırmızı ve yeşil sinyalleri gösterir, burada başlangıçta mCherry sinyali parlaktır ve GCaMP3 loştur. Şekil 3C, Şekil 3G ve Şekil 3D, Şekil 3H , deneyin tüm süresi için Z Profiler analizini sağlar (ham veriler veya F/F0, sırasıyla). Ekleme panelleri, ACR ve AE'nin oluştuğu zaman penceresinin yakınlaştırılmış bir görünümünü sağlar.
Sperm hem oldukça heterojen hem de çeşitli kullanım prosedürleri nedeniyle membran hasarına karşı çok hassas olduğundan, Şekil 5 iki tür negatif sonuç örneği sunmaktadır. Şekil 5A,C, bir görüş alanı içinde yakalanan birkaç spermi göstermektedir. Sarı anahat, 0 zaman noktasında (stimülasyondan önce) yüksek GCaMP3 sinyali gösteren iki sperm hücresini vurgular. Mevcut deneylerde, akrozomal vezikülün zaten bir zar füzyon sürecinden geçtiğini veya kalsiyumun sızmasına izin veren bir miktar zar hasarı yaşadıklarını gösterdikleri için bu tür hücrelerden kaçınılmıştır. Şekil 5A'daki sperm, okla gösterilir (Şekil 5A, C'deki daire ROI), 125 μM GM1 ile stimülasyonu takiben bir başlangıç mCherry sinyali gösterir, ancak kırmızı veya yeşil kanallarda yanıt vermez (Şekil 5B, D, sırasıyla, ImageJ tarafından sağlanan Z-Profiler analiz penceresini gösterir). Bu örnekte verilenler gibi bir sperm alt popülasyonu stimülasyona yanıt vermese de, bunlar son analize dahil edilir ve yüzde yanıt veri analizindehesaplanır 2 (Şekil 3).
Şekil 1: Enstrümantasyon ve deney düzeneği. (A) 37 ° C'de bir inkübasyon odasına yerleştirilmiş PDL kaplı bir lamel kabı üzerinde canlı sperm hücreleri. Tek hücreli bir dağıtım sistemine çekilen ve bağlanan bir borosilikat kılcal damarı, doğrudan uyarıcı iletim için görüntüleme alanının merkezindeki sperm hücresinin yanına yerleştirilir. Hem yeşil (GCaMP3) hem de kırmızı (mCherry) kanallar, stimülasyon sırasında sürekli olarak izlenir ve yüksek kare hızında (örn. 10 kare/sn) kaydedilir. (B) Kapak-sürgü çanağı üzerindeki PDL biriktirme modelinin şematik gösterimi. (C) Aynı tabaktaki önceki nefeslerden spesifik olmayan stimülasyonu en aza indirmek için kılcal damar kullanılarak spermin uyarılabileceği çanak üzerindeki belirli alanların şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Floresan sinyali ve yoğunluğundaki değişiklikler. Üst panel: GCaMP3 sinyalindeki bir artış, akrozoma kalsiyum akışını ve ardından AcroSensE füzyon proteininin difüzyonuna bağlı sinyal kaybını gösterir. Alt panel: mCherry sinyali, ilk membran füzyonu sırasında stabil kalır, ardından AcroSensE difüzyonu ve akrozomal ekzositoz (AE) üzerine kararır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Temsili veriler ve floresan izleri. İki sperm hücresi içeren bir alan görüntülendi. Yeşil/kırmızı kanal floresansı, ImageJ kullanılarak çevrimdışı olarak ölçüldü ve Excel'de çizildi (6. adımda açıklandığı gibi). (A-D) Hücre #1 için kırmızı (A) ve yeşil (B) kanal floresan yoğunluğunun zaman içinde ölçülmesi, seçilen ROI'ler için hesaplanması ve ardından ham veri (C) olarak sunulması veya ilk sinyale (D, F/F0) normalleştirilmesi. (D) girişi, 25-125 sn arasındaki zaman diliminin yakınlaştırılmış bir görünümünü sağlar. (EH) Hücre #2 için zaman içinde kırmızı (E) ve yeşil (F) kanal floresan yoğunluğunun ölçülmesi, seçilen ROI'ler için hesaplanır ve ardından ham veri (G) olarak sunulur veya ilk sinyale (H, F/F0) normalleştirilir. (H) içindeki ek, 25-125 s arasındaki zaman diliminin yakınlaştırılmış bir görünümünü sağlar. Ölçek çubuğu = 5 μm. Tüm x eksenleri saniye (s) cinsinden zamanı temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Veri analizi ve niceleme parametreleri. (A) Başlangıç Zamanı (saniye), Genlik (floresan yoğunluğu) ve Süre (saniye) dahil olmak üzere ölçülebilir parametreleri gösteren tipik bir GCaMP3 floresan yoğunluğu izinin gösterimi. (B) Başlangıç Zamanı (saniye), Süre (saniye), Eğim (F/s), R60 (floresan yoğunluğu) ve Genlik (floresan yoğunluğu) dahil olmak üzere ölçülebilir parametreleri gösteren tipik bir mCherry floresan yoğunluğu izinin gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Negatif sonuçlar. (A,C) mCherry (kırmızı) ve GCaMP3 (yeşil) kanalları, tek bir görüş alanında yakalanan birden fazla sperm hücresini gösterir. (A)'daki ok, başlangıçta mCherry floresansı sergileyen, ancak (B) (mCherry) ve (D) (GCaMP3) 'te sağlanan Z-Profiler tarafından üretilen izlerde gözlemlendiği gibi, 125 μM GM1 stimülasyonuna yanıt olarak daha sonra floresan yoğunluğu değişikliği olmayan bir sperm hücresini gösterir. Sarı dikdörtgen içindeki hücreler, stimülasyondan önce 0 zaman noktasında yüksek GCaMP3 floresan yoğunluğu sergiler. Ölçek çubuğu = 5 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, akrozomal kalsiyum dinamikleri ile AE'ye yol açan ara adımlar arasındaki etkileşimin gerçek zamanlı, tek hücreli izlenmesi ve analizi için yeni oluşturulan AcroSensE fare modelini kullanmak için mikroskopi tabanlı bir yöntem açıklanmaktadır. Diğer fare genetik modelleriyle melezleme veya gen düzenleme gibi hazır genetik yaklaşımlarla birlikte, bu model ve yöntem, kapasitasyon, AE ve döllenme ile ilgili sperm sinyal yollarında yer alan çeşitli bileşenlerin ve yolların rolünü incelemek için güçlü bir sistem sağlar.
Kritik adımlar
Membran hasarını en aza indirmek için tüm sperm işleme adımlarında büyük delikli plastik transfer pipetleri veya büyük delikli pipet uçları kullanmak ve tüm toplama ve yıkama adımlarını 37 °C'de gerçekleştirmek önemlidir. Benzer şekilde, mikro santrifüj tüpünün yan duvarı ile etkileşime giren hücrelerden kaynaklanan membran hasarını önlemek için sabit açılı bir rotor yerine sallanan bir kova rotoru tercih edilir. Z pozisyonu sürüklenme düzeltmesi mevcutsa, görüntüleme aralığı sırasında görüntülenen spermin odak düzleminden kaymasını önlemek için z pozisyonu düzeltme donanımı/yazılımı uygulanması şiddetle tavsiye edilir.
Değişiklikler ve sorun giderme
Burada tarif edilen protokol, lipid aracılı sinyal 2,3 çalışmaları için optimize edilmiştir ve hem kapasitif hem de kapasitasyonsuz spermlere uygulanabilir. Sperm kapasitasyonu için farklı yöntemler kullanılabilir; Örneğin, albümin veya siklodekstrin sterol alıcıları olarak işlev görebilir. Ek olarak, çeşitli enerji substratları veya bikarbonat eklenebilir veya çıkarılabilir. Bununla birlikte, bikarbonatın havaya maruz kalmasından sulu ortamda oluşacağını unutmayın, bu nedenle gerçekten 'bikarbonatsız' koşulların test edilmesi, ortamın yapılması/hazırlanması/işlenmesi ve deneyin gerçekleştirilmesi gibi tüm adımlarda bir nitrojen ortamının dikkatli bir şekilde kullanılmasını gerektirecektir. Yukarıdaki protokol, deneysel çözeltiye eklenen 10 mM kalsiyumun kullanılmasını içerir; bununla birlikte, kalsiyum iyonları atlanabilir, şelatlanabilir (örneğin, EGTA) veya kalsiyuma duyarlı deneysel uygulamalar için daha düşük konsantrasyonlarda eklenebilir. Kalsiyum konsantrasyonlarının düşürülmesinin veya ihmal edilmesinin, AE2'de beklenen GCaMP3 sinyalini azaltacağını lütfen unutmayın. Ek olarak, bu protokol için deneysel tasarımlarına ve hedeflerine daha iyi uyan başka ortamlar (burada kullanılan MW'ye karşı) kullanılabilir. Sağlanan protokol, tek hücreli görüntülemenin ve uyarıcıların tek hücreli dağıtımının kullanımını açıklar; Bununla birlikte, basitleştirilmiş bir varyasyon, uyarıcı reaktifin şişirme yoluyla değil, tüm yemeğe eklenmesi gibi toplu stimülasyon ile elde edilebilir. Ek olarak, florimetreler veya floresan özellikli plaka okuyucular kullanılarak AcroSensE modeli kullanılarak tüm popülasyon deneyleri de mümkündür.
Sınırlama
Burada sağlanan yöntem, bir AcroSensE fare kolonisinin kullanılabilirliğini, bakımını ve kullanımını gerektirir. Yöntem aynı zamanda maliyetli ve eğitimli personel gerektiren gelişmiş bir görüntüleme sisteminin mevcudiyetine de bağlıdır. Bazı deneysel uygulamalar için, olası bir sınırlama, mevcut birçok sentetik kalsiyum indikatörü GCaMP3'e benzer dalga boyunda olduğundan, AcroSensE sperminde sitozolik kalsiyumun aynı anda ölçülememesi ile ilgilidir. Bu protokolün kapsamı dışında olmasına rağmen, popülasyon düzeyindeki deneylerin potansiyel sınırlamaları, AE'den sonra mCherry sinyalinin okunmasını ve ölü / geçirgen hücrelerden gelen ortam veya GCaMP3 sinyalinde dağılmayı içerebilir. Bu tür yöntemleri optimize etmek için, salgılanan mCherry'den arka plan gürültüsünü en aza indirmek için z-odaklama kullanmayı ve / veya ölü veya geçirgen spermden temel GCaMP miktarını sağlamak için sahte işlem görmüş kontrolleri kullanmayı keşfedebilirsiniz.
Yöntemin mevcut/alternatif yöntemlere göre önemi
Son yirmi yılda, akrozom hedefli GFP transgenik fareler7, akrozoma yüklenen kalsiyum boyaları (örneğin, Fluo-412) veya sentetik boya FM-6413 gibi ekzositoza özgü göstergeler dahil olmak üzere, canlı spermde AE dinamiklerinin gerçek zamanlı çalışmaları için çeşitli yöntemler bildirilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemlerle karşılaştırıldığında, AcroSensE modeli, herhangi bir boya yüklemesi veya diğer potansiyel olarak membran bozucu prosedürler gerektirmeyen minimal işlem görmüş spermlerin kullanılmasının rahatlığını sağlar. Daha da önemlisi, akrozomal kalsiyum dinamiklerini, membran füzyonunu ve gözenek oluşumunu, ayrıca AE'yi ve bunun sonucunda akrozomal içeriğin salınmasını izleyebilen ikili bir göstergeyi ifade eden spermlere sahip olmanın büyük bir avantajı vardır.
Yöntemin belirli araştırma alanlarındaki önemi ve potansiyel uygulamaları
Aşağıdaki deneysel uygulama örneklerinin tek hücreli veya popülasyon tahlilleri olarak gerçekleştirilebileceğini ve yüksek verimli analiz istendiğinde ikincisinin önemli avantajlara sahip olduğunu unutmayın. Çeşitli fare modellerinde AE dinamiği çalışmaları, (1) çeşitli kalsiyum kanallarının veya kalsiyum kanalı alt birimlerinin boş veya mutasyona uğramış formları (örneğin, α1E- ve CatSper-null modelleri ile çaprazlama); (2) membran füzyonuna aracılık eden proteinlerin boş veya mutasyona uğramış formları (örneğin, SNARE'ler). Ek olarak, farklı sinyal yolakları ile ilgili çeşitli farmakolojik ajanların akrozomal kalsiyum ve AE dinamiklerini nasıl modüle ettiğini araştırmak için çalışmalar yapılabilir. Ayrıca, sıcaklık, pH ve çeşitli iyonların veya küçük moleküllerin varlığı veya konsantrasyonu dahil olmak üzere çevresel değişikliklerin AE'yi nasıl etkilediği konusunda araştırmalar yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbir yazarın bu çalışmayla ilgili rapor vermek için çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibeleri R01-HD093827 ve R03-HD090304 (AJT) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
References
- Austin, C. R. Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg. Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).
- Cohen, R., et al. A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis. J Biol Chem. 298 (5), 101868 (2022).
- Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J.
- Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm. J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).
- Sosa, C. M., et al. Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis). Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).
- Balestrini, P. A., et al. Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time. Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).
- Nakanishi, T., et al. Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein. FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).
- Kim, K. S., Gerton, G. L. Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm. Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).
- Hasuwa, H., et al. Transgenic mouse sperm that have green acrosome and red mitochondria allow visualization of sperm and their acrosome reaction in vivo. Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science. 59 (1), 105-107 (2010).
- Henderson, M. J., et al. A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store. PloS one. 10 (10), 0139273 (2015).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. J Biol Chem. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Cohen, R., et al. Lipid modulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis and fertilization. Dev Cell. 28 (3), 310-321 (2014).
- Sanchez-Cardenas, C., et al. Acrosome reaction and Ca(2)(+) imaging in single human spermatozoa: new regulatory roles of [Ca(2)(+)]i. Biol Reprod. 91 (2), 67 (2014).
