यहाँ हम कोशिका विभाजन में शामिल जीनों के लिए एक उच्च throughput स्क्रीन में एक मानव esiRNA लायब्रेरी का उपयोग करें. हम कैसे स्थापित करने के लिए और एक esiRNA स्क्रीन, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विश्लेषण करने के लिए और परिणाम को मान्य करने के आचरण का प्रदर्शन.
शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) जीन अभिव्यक्ति के नियंत्रण के लिए एक बुनियादी सेलुलर तंत्र है. आरएनएआई कम भी छोटे दखल RNAs (siRNAs) के रूप में जाना जाता है डबल असहाय RNAs के द्वारा प्रेरित है. कम डबल असहाय RNAs अब पासा खेलनेवाला, endonucleases के RNase III परिवार के एक प्रोटीन की गतिविधि से डबल असहाय व्यापारियों से उत्पन्न. परिणामस्वरूप टुकड़े शाही सेना प्रेरित मुंह बंद जटिल (RISC) के घटक हैं, यह भाईचारे का लक्ष्य mRNA निर्देशन. RISC लक्ष्य mRNA जिससे इनकोडिंग 1,2,3 प्रोटीन की अभिव्यक्ति को कम करने cleaves. आरएनएआई जीन समारोह के अध्ययन के स्तनधारी कोशिकाओं में छोटे दखल RNAs का उपयोग नुकसान के लिए एक शक्तिशाली और व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता प्रयोगात्मक विधि बन गया है.
वर्तमान में दो मुख्य तरीके छोटे दखल RNAs के उत्पादन के लिए उपलब्ध हैं. एक विधि रासायनिक संश्लेषण शामिल है, जबकि एक वैकल्पिक तरीका RNase क्ष्क्ष्क्ष् द्वारा इन विट्रो में लक्ष्य विशिष्ट लंबे समय डबल असहाय RNAs के endonucleolytic दरार कार्यरत हैं. इस प्रकार, siRNA तरह oligonucleotides की एक विविध पूल का उत्पादन किया है जो endoribonuclease तैयार siRNA या esiRNA के रूप में भी जाना जाता है. रासायनिक व्युत्पन्न siRNAs और esiRNAs की प्रभावकारिता की तुलना से पता चलता है कि दोनों चलाता लक्ष्य जीन मुंह बंद में शक्तिशाली हैं. अंतर, तथापि, जब विशिष्टता की तुलना कर सकते हैं देखा जा. कई एकल रासायनिक संश्लेषित siRNAs प्रमुख बंद लक्ष्य प्रभाव उत्पादन, जबकि esiRNAs में निहित जटिल मिश्रण एक अधिक विशिष्ट 10 पछाड़ना की ओर जाता है है .
इस अध्ययन में, हम जीनोम पैमाने मिशन esiRNA पुस्तकालयों और आरएनएआई स्क्रीनिंग कोशिका चक्र प्रगति में शामिल जीनों की पहचान के लिए डीएनए सामग्री स्क्रीन के द्वारा उदाहरण के लिए इसके उपयोग के डिजाइन प्रस्तुत करते हैं. हम बताते हैं कैसे अभिकर्मक प्रोटोकॉल और उच्च throughput में स्क्रीनिंग के लिए परख का अनुकूलन करने के लिए. हम भी कैसे बड़े डेटा सेट प्रदर्शित सांख्यिकीय मूल्यांकन किया जा सकता है और तरीकों को पेश करने के लिए प्राथमिक हिट मान्य है. अंत में, हम संभावित मान्य हिट के आगे कार्यात्मक characterizations के लिए शुरू अंक दे.
शाही सेना के हस्तक्षेप नुकसान के समारोह phenotypes का अध्ययन करने के लिए एक मानक तकनीक बन गया है. आरएनएआई मध्यस्थों के बड़े पैमाने पर संग्रह अलग आपूर्तिकर्ताओं से उपलब्ध हैं और जीन मुंह बंद करने के लिए एक आसान, लागत प्रभावी और तेजी से विधि प्रदान करते हैं. यह कई जैविक प्रक्रियाओं में प्रमुख खिलाड़ियों जीनोम पैमाने पर विभिन्न प्रजातियों और सेल प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला पर एक परिप्रेक्ष्य की अनुमति के लिए व्यवस्थित स्क्रीनिंग के लिए गेट खोला.
उच्च झूठी सकारात्मक और नकारात्मक झूठी दरों आरएनएआई स्क्रीन में एक आम चुनौती हैं. इस समस्या का समाधान करने के लिए, प्रभावकारिता में सुधार के लिए काफी प्रयास करने के लिए किया गया निवेश किया है और विशेष रूप में मुंह बंद करने की विशिष्टता से चलाता है. एक महत्वपूर्ण खोज थी कि अलग ही प्रतिलेख लक्ष्यीकरण siRNAs की एक पूल बहुत लक्ष्य विशिष्टता को बढ़ाता है. क्योंकि विभिन्न siRNAs की एक बहुत जटिल पूल endoribonuclease द्वारा निर्मित है, esiRNAs उच्च लक्ष्य विशिष्टता चलाता है, आरएनएआई स्क्रीन में झूठी सकारात्मक दर को कम करने. esiRNAs भी कुशल knockdowns प्राप्त करने के लिए, यह भी झूठी नकारात्मक दर को कम करने के लिए प्रदर्शन किया है.
क्योंकि आरएनएआई स्क्रीन तकनीकी की मांग कर रहे हैं, वे संभावना कुछ समय के लिए एक नियमित आधार पर प्रदर्शन करने के लिए चुनौतीपूर्ण रहेगा. हालांकि, अभिकर्मकों और उपकरणों के रूप में मिलता है बेहतर और अधिक प्रयोगशालाओं उनकी विशेषज्ञता का हिस्सा, आधुनिक जीव विज्ञान में आरएनएआई स्क्रीन का उपयोग करने के लिए भविष्य में वृद्धि माना जाता है.
The authors have nothing to disclose.
हम चर्चा के लिए Buchholz प्रयोगशाला और सिग्मा Aldrich आरएनएआई टीम के सदस्यों को स्वीकार करना चाहते हैं. हम मैक्स प्लैंक सोसायटी और Bundesministerium फर Bildung und Forschung समर्थन के लिए [0315105] जाओ जैव Grands धन्यवाद देना चाहूंगा.
मिशन ® सिग्मा Aldrich जैव प्रौद्योगिकी एल.पी. के एक पंजीकृत ट्रेडमार्क है
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comments |
MISSION esiRNA | Sigma-Aldrich | For additional information contact: rnai@sial.com | ||
Wellmate | ThermoScientific | |||
Breathable sealing tape | Corning | Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345) | ||
OptiMEM | Invitrogen | |||
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof (absolute), for molecular biology | |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology | |
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D8417 | Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC) | |
Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | For molecular biology, ≥70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder | |
Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich | T9285 | 100 x, for molecular biology |