Summary
Il modello murino AcroSensE e i metodi di imaging di cellule vive qui descritti forniscono un nuovo approccio allo studio della dinamica del calcio nel compartimento subcellulare dell'acrosoma spermatico e di come regolano i passaggi intermedi che portano alla fusione della membrana e all'esocitosi dell'acrosoma.
Abstract
L'esocitosi acrosomica (AE), in cui la singola vescicola esocitotica dello spermatozoo si fonde con la membrana plasmatica, è un processo complesso e calcio-dipendente essenziale per la fecondazione. Tuttavia, la nostra comprensione di come la segnalazione del calcio regoli l'AE è ancora incompleta. In particolare, l'interazione tra la dinamica del calcio intra-acrosomiale e le fasi intermedie che portano all'AE non è ben definita. Qui, descriviamo un metodo che fornisce approfondimenti spaziali e temporali sulla dinamica del calcio acrosomiale e sulla loro relazione con la fusione di membrana e la successiva esocitosi della vescicola acrosomiale. Il metodo utilizza un nuovo topo transgenico che esprime un sensore per l'esocitosi mirato all'acrosoma (AcroSensE). Il sensore combina un indicatore di calcio geneticamente codificato (GCaMP) fuso con mCherry. Questa proteina di fusione è stata specificamente progettata per consentire l'osservazione simultanea della dinamica del calcio acrosomiale e degli eventi di fusione della membrana. Il monitoraggio in tempo reale della dinamica del calcio acrosomiale e dell'AE negli spermatozoi vivi AcroSensE si ottiene utilizzando una combinazione di imaging ad alta frequenza di fotogrammi e un sistema di somministrazione stimolante in grado di colpire singoli spermatozoi. Questo protocollo fornisce anche diversi esempi di metodi di base per quantificare e analizzare i dati grezzi. Poiché il modello AcroSensE è geneticamente codificato, il suo significato scientifico può essere aumentato utilizzando strumenti genetici prontamente disponibili, come l'incrocio con altri modelli genetici murini o metodi basati sull'editing genetico (CRISPR). Con questa strategia, è possibile risolvere il ruolo di ulteriori vie di segnalazione nella capacitazione e nella fecondazione degli spermatozoi. In sintesi, il metodo qui descritto fornisce uno strumento conveniente ed efficace per studiare la dinamica del calcio in uno specifico compartimento subcellulare - l'acrosoma spermatico - e come tali dinamiche regolano i passaggi intermedi che portano alla fusione della membrana e all'esocitosi dell'acrosoma.
Introduction
Gli spermatozoi acquisiscono la capacità di fecondare durante un processo chiamato capacitazione1. Un endpoint di questo processo è che gli spermatozoi acquisiscono la capacità di sottoporsi a AE. Oltre due decenni di dati supportano la presenza di un modello complesso e multi-step di AE negli spermatozoi dei mammiferi (riassunto in 2,3). Tuttavia, lo studio dell'AE negli spermatozoi vivi è impegnativo e i metodi attualmente disponibili per monitorare questo processo con una risoluzione adeguata sono ingombranti e richiedono più fasi di preparazione4, sono limitati al rilevamento della fase finale dell'AE (ad esempio, utilizzando PNA5), sono limitati alle misurazioni dei cambiamenti nel calcio citosolico (in contrasto con la dinamica del calcio acrosomiale), o sono limitati alle misurazioni della dinamica del calcio citosolico o dell'AE6.
Per superare alcuni dei limiti chiave degli studi di eventi avversi in tempo reale in condizioni fisiologiche e per consentire lo studio dell'interazione tra la dinamica del calcio e l'evento avverso, è stato generato un modello murino unico. In questo modello murino, una proteina di fusione composta dal sensore Ca2+ geneticamente codificato (GCaMP3) e mCherry viene espressa e indirizzata all'acrosoma utilizzando un promotore dell'acrosina e un peptidedi segnalazione 2. Il doppio sensore GCaMP3-mCherry consente di misurare simultaneamente in tempo reale le concentrazioni di calcio e lo stato del contenuto acrosomiale negli spermatozoi vivi in condizioni fisiologiche utilizzando la microscopia e un sistema di somministrazione di stimolanti a singola cellula (Figura 1). Come componente della matrice acrosomiale, la fusione della membrana e l'AE comporterebbero la perdita della fluorescenza fotostabile e insensibile al pH mCherry dallo sperma, poiché questa proteina si diffonde fuori dalla vescicola acrosomiale. A questo proposito, la capacità del modello di riflettere la tempistica e l'occorrenza dell'AE è simile ai benefici della lineamurina GFP mirata all'acrosoma 7,8,9.
La variante GCaMP3 utilizzata in questa linea di topi transgenici ha un KD approssimativo di 400 μM e un intervallo dinamico per Ca2+ di 10-4-10-3 M10, che è adatto a questa vescicola. Abbiamo dimostrato che questa combinazione di caratteristiche di GCaMP3 potrebbe rivelare la formazione di pori di fusione tra la membrana plasmatica e la membrana acrosomiale esterna (OAM)2. Il rilevamento dei pori di fusione è il risultato del fatto che la dimensione dei pori è troppo piccola per consentire alla proteina AcroSensE di disperdersi fuori dall'acrosoma (attraverso la perdita di contenuto dell'acrosoma), fornendo al contempo un "canale" di membrana che consente l'afflusso di ioni Ca2+ nel lume dell'acrosoma, portando ad un aumento dell'intensità di fluorescenza del GCaMP3.
La proteina fluorescente mCherry, luminosa, monomerica e non sensibile al calcio, supporta la visualizzazione dell'acrosoma mentre il segnale GCaMP3 è debole (ad esempio, prima del legame con Ca2+ , Figura 2) e, soprattutto, consente anche l'identificazione di spermatozoi intatti dell'acrosoma adatti per l'imaging.
Il seguente protocollo descrive l'utilizzo dell'esclusivo modello murino AcroSensE e i metodi per la microscopia utilizzati sperimentalmente per studiare la dinamica degli eventi avversi e del calcio degli spermatozoi con un'elevata risoluzione spaziale e temporale.
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Protocol
Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite secondo le linee guida e approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Cornell University (#2002-0095). Per il presente studio sono stati utilizzati topi AcroSensE2 di 8-10 settimane. Le richieste di informazioni sulla disponibilità dei topi AcroSensE possono essere inoltrate all'autore corrispondente.
1. Raccolta e lavaggio degli spermatozoi
- Raccogliere gli spermatozoi dell'epididimo della cauda (maggiori dettagli su questa procedura sono forniti in11) da topi AcroSensE. Lasciare la procedura di swim-out di 15 minuti in una piastra di coltura tissutale da 3,5 cm contenente 0,5 mL di terreno di Whitten modificato (MW) a 37 °C. La piastra deve essere coperta per ridurre l'evaporazione del MW e deve essere inclinata in modo che il mezzo abbia una profondità sufficiente per coprire la cauda epididimi.
NOTA: Il terreno di Whitten modificato (MW) include 22 mM di HEPES, 1,2 mM di MgCl2, 100 mM di NaCl, 4,7 mM di KCl, 1 mM di acido piruvico, 4,8 mM di sale di acido lattico hemi-Ca2+ , pH 7,35. Il glucosio (5,5 mM), il NaHCO3 (10 mM) e la 2-idrossipropil--ciclodestrina (CD; 3 mM) sono integrati (vedi Tabella dei materiali) secondo necessità per l'induzione della capacitazione e le concentrazioni possono essere modificate per esperimenti specifici. Inoltre, accettori di steroli alternativi potrebbero essere utilizzati al posto della CD (ad esempio, albumina sierica bovina o lipoproteine ad alta densità). - Utilizzando una pinza fine, rimuovere l'eventuale tessuto dell'epididimo dalla capsula di raccolta swim-out. Trasferire il terreno contenente lo sperma in una provetta conica da 15 mL e centrifugare la sospensione a 100 x g per 1 minuto in un rotore a secchiello oscillante a temperatura ambiente. Utilizzando una pipetta di plastica, rimuovere il surnatante MW contenente lo sperma da eventuali detriti di tessuto grossolano che si saranno pellettati in questa fase.
- Portare il surnatante MW contenente gli spermatozoi ad un volume totale di 3 mL aggiungendo MW a 37 °C. Centrifugare a 400 x g per 8 minuti (a temperatura ambiente) in una provetta a fondo tondo. Rimuovere lentamente il surnatante di MW dallo sperma debolmente pellettato.
- Se vitale, lo sperma dovrebbe apparire come una pallina dall'aspetto "soffice". Risospendere delicatamente lo sperma mediante triturazione con una pipetta di trasferimento di grande diametro o tramite delicati picchietti manuali sulla provetta ("finger flicking"). Una volta risospesi in modo uniforme, trasferirli in un nuovo tubo a fondo tondo. Utilizzare 10-20 μL di sospensione spermatica per contare e valutare la motilità. Diluire gli spermatozoi in MW per l'uso.
NOTA: Per la maggior parte degli esperimenti che coinvolgono la capacitazione degli spermatozoi di topo, viene utilizzata una concentrazione finale di 5-10 milioni di spermatozoi/mL MW. Il protocollo di imaging qui descritto non richiede la capacitazione degli spermatozoi, sebbene sia necessario che gli spermatozoi acquisiscano la capacità di subire l'esocitosi dell'acrosoma fisiologicamente rilevante. Si potrebbe studiare l'esocitosi patologica o l'esocitosi indotta attraverso reagenti come uno ionoforo di calcio senza capacitare lo sperma. Inoltre, si potrebbero esplorare i potenziali cambiamenti nel calcio acrosomiale nelle cellule non capacitate in risposta a vari stimoli. - Utilizzare gli spermatozoi entro 3-5 ore dal prelievo, mantenendo il tempo il più breve possibile e coerente tra le prove sperimentali.
- Eseguire tutte le fasi di raccolta e lavaggio a 37 °C utilizzando un mezzo MW, impiegando metodi per ridurre al minimo i danni alla membrana. Ciò include l'uso di pipette di trasferimento in plastica di grande diametro o puntali per pipette a orifizio largo, che sono raccomandati per l'uso durante tutte le fasi della procedura.
2. Rivestimento in poli-D-lisina di piastre coprioggetti per imaging
NOTA: I piatti a base di poli-D-lisina (PDL) devono essere preparati freschi prima di ogni esperimento.
- Erogare una gocciolina da 0,5 μL di PDL (0,5 mg/mL, vedere Tabella dei materiali) al centro di un vetrino coprioggetto.
- Utilizzando una punta graduata da 10 μL, spalmare la gocciolina PDL sul vetrino coprioggetto (schema incrociato come mostrato nella Figura 1B).
- Lasciare asciugare a 37 °C per 10 min. Tenere le stoviglie rivestite in PDL coperte e a 37 °C fino all'uso.
3. Trazione capillare, caricamento per sbuffo
- Tirare i capillari in vetro borosilicato (D.E., 2 mm, D.I., 1.56 mm, vedere la tabella dei materiali) utilizzando le seguenti impostazioni: Calore: 330, Tirare: 250, Velocità: 250 e Tempo: 70. Questo passaggio deve essere ottimizzato per l'estrattore specifico in uso.
- Prima di ogni esperimento, caricare un singolo capillare con la soluzione stimolante contenente 3-5 volte la concentrazione dello stimolante (per tenere conto della rapida diffusione della soluzione durante la boccata). Prima di riempire, utilizzare una pinzetta fine per aprire la punta capillare a circa 1-2 mm dall'estremità. Questo dovrebbe produrre un diametro di apertura di ∼5 μm. Non è necessaria la lucidatura a caldo.
- Utilizzando una sottile pipetta di trasferimento in plastica, iniettare lentamente la soluzione stimolante nel capillare fino a riempire i tre quarti della sua lunghezza.
- Rimuovere eventuali bolle d'aria formatesi durante il riempimento muovendo delicatamente il capillare.
- Montare il capillare riempito sul micromanipolatore (vedi Tabella dei materiali).
4. Preparazione dell'erogazione della stimolazione per il soffio
NOTA: Per ridurre al minimo il rischio di lesioni all'utente, è necessario indossare occhiali di sicurezza durante l'operazione della procedura di sbuffo.
- Impostare le impostazioni del sistema di erogazione a cella singola per fornire un impulso di 10 s a 5 psi.
- Collegare il capillare in borosilicato al portapipetta del sistema di erogazione a cella singola. Assicurarsi che le guarnizioni siano ermetiche.
- Osservando la punta capillare, applicare un breve soffio di 2 s a 20 psi per assicurarsi che la soluzione venga effettivamente erogata attraverso l'estremità della punta (una piccola goccia dovrebbe essere evidente all'estremità della punta).
5. Microscopia e acquisizione di immagini
NOTA: Sono disponibili e possono essere utilizzati microscopi di diverse marche; Tuttavia, è auspicabile un frame rate minimo di 3 fotogrammi/s. Per quanto riguarda la temperatura e il controllo ambientale, si prega di notare che la temperatura effettiva del mezzo nel piatto deve essere confermata, ad esempio, utilizzando un termometro a infrarossi senza contatto.
- Aggiungere 80 μL di spermatozoi diluiti al centro di un vetrino coprioggetti da 35 mm rivestito in poli-D-lisina. Per la maggior parte degli esperimenti che coinvolgono la capacitazione degli spermatozoi di topo, viene utilizzata una concentrazione finale di 5-10 milioni di spermatozoi/mL.
- Aggiungere lentamente allo sperma 3 mL di terreno di base caldo (37 °C) MW integrato con 10 mM di CaCl2.
NOTA: Si potrebbero eseguire esperimenti a temperatura ambiente per rallentare i processi cellulari, ma è importante notare che, poiché la capacitazione è mediata dagli scambi lipidici e dalla fluidità dei micro e macro domini, è necessario tenere presente che la capacitazione fisiologicamente rilevante e l'esocitosi dell'acrosoma sono processi dipendenti dalla temperatura. - Montare la capsula con lo sperma sul microscopio (preriscaldato a 37 °C).
- Eccita il GCaMP3 utilizzando una linea laser da 488 nm e visualizza con un filtro passa-banda (BP) da 505-550 nm. Eccita l'mCherry utilizzando una linea laser da 555 nm e visualizza con un filtro BP da 575-615 nm.
- Utilizzando un micromanipolatore (si consiglia di fissare il manipolatore al tavolo d'aria su cui è stato installato il microscopio), posizionare la punta del capillare a circa 100 μm di lato e 5-10 μm sopra il piano della cella di interesse.
NOTA: Le soluzioni stimolanti sono prodotte a 3-5 volte la concentrazione normale per compensare la rapida diffusione che si verifica nel volume tra il capillare e la cellula. - Avviare la sequenza di imaging al microscopio.
- Immagine di spermatozoi a una frequenza di fotogrammi elevata, preferibilmente >10 fotogrammi/s. In questo caso, è stato utilizzato uno scanner risonante che consente l'imaging a 33 ms/fotogramma.
- Dieci secondi dopo aver avviato l'acquisizione dell'immagine al microscopio, attivare il sistema di rilascio a cellula singola per avviare il soffio di 10 secondi di stimolante.
- Celle di immagine per una durata di 10-15 min.
- Utilizzando il sistema di somministrazione a cella singola, è possibile acquisire l'immagine di più cellule da una singola parabola in base alle posizioni fornite nella Figura 1B.
NOTA: Gli spermatozoi non trattati/non stimolati al microscopio dovrebbero apparire per lo più rossi, con una bassa intensità del segnale verde. Le teste degli spermatozoi devono essere attaccate al vetrino coprioggetti e gli spermatozoi vivi possono essere identificati dalle loro code in movimento. Negli spermatozoi sottoposti a AE, il segnale verde GCaMP3 inizialmente aumenta e sia il segnale rosso mCherry che il segnale verde GCaMP3 scompaiono se l'AE è completa, come illustrato nella Figura 2. La riduzione della fluorescenza mCherry fornisce un indicatore più specifico del momento in cui inizia l'AE perché i cambiamenti nelle concentrazioni di Ca2+ causeranno continuamente cambiamenti nell'intensità della fluorescenza GCaMP3.
6. Analisi delle immagini e dei dati
NOTA: L'analisi delle immagini offline viene eseguita utilizzando ImageJ (vedere Tabella dei materiali). In precedenza, sono stati riportati diversi passaggi intermedi nel processo che porta all'AE, tra cui l'aumento acrosomiale del calcio (ACR) e la fusione completa della membrana. Quest'ultimo porta alla perdita di fluorescenza mCherry e quindi rappresenta un AE completo. In alcune cellule, si osservano segnali simili agli eventi pre-spike foot (PSF) quando si utilizzano approcci amperometrici negli studi di esocitosi (per maggiori dettagli, vedere2). Sono disponibili diversi metodi opzionali per analizzare i dati grezzi di AcroSensE per quantificare ACR, AE e i relativi passaggi intermedi. Di seguito vengono descritti alcuni dei metodi analitici di base.
- A seconda dell'estensione specifica del file di sistema del microscopio, utilizzare lo strumento Dividi canale (Immagine > Colori > Dividi canali) per generare finestre individuali per i canali GCaMP3 e mCherry.
- Sincronizza le singole finestre utilizzando lo strumento "Sincronizza finestra" (Analizza > Strumenti > Sincronizza finestre).
- Selezionare una regione di interesse (ROI) attorno alla testa dello spermatozoo nel canale rosso per includere la regione dell'acrosoma (Figura 3A,B). Lo strumento di sincronizzazione consente di applicare automaticamente la stessa selezione dell'area sul canale verde, in cui gli spermatozoi sono ancora troppo deboli per essere visibili.
- Scegli il plug-in "Z Profiler" (Plugins > Stacks > Z Profiler) o "Time Series Analyzer" (Plugins > Stacks > Time Series Analyzer) per tracciare la variazione dell'intensità della fluorescenza in funzione dei fotogrammi/tempo per ciascuno dei due canali.
- Copiare i dati in un software per fogli di calcolo (ad esempio, Microsoft Excel) per la creazione di grafici e ulteriori analisi.
NOTA: una volta copiati i dati in un foglio di calcolo, è possibile estrarre più parametri per l'analisi, inclusi i seguenti, come illustrato nella Figura 4.- Tempo di inizio del poro di fusione (FP): misura il tempo dal punto di tempo 0 al punto di tempo in cui il segnale GCaMP3 inizia a salire. Questo parametro indica il ritardo tra la stimolazione e la risposta ACR degli spermatozoi.
- Ora di inizio AE: misura il tempo dal punto di tempo 0 al punto di tempo in cui il segnale mCherry inizia a decadere. Questo parametro indica il ritardo tra la stimolazione e la risposta AE degli spermatozoi. Questo parametro potrebbe anche essere utilizzato per calcolare il ritardo tra la formazione di FP e la risposta AE.
- Ampiezza FP di picco: misura il segnale di fluorescenza dalla base al picco dell'aumento del segnale GCaMP3. Questo parametro indica l'aumento totale della risposta del Registro Azure Container.
- Tasso di perdita di mCherry: determinare questo parametro mediante un adattamento lineare o esponenziale sulla sezione della perdita di segnale di mCherry (come indicato da "pendenza" nella Figura 4B).
NOTA: In alternativa, determinare il tasso di decadimento con il metodo del segnale residuo (R) in vari punti temporali (ad es. R60: tempo di durata in secondi a un segnale residuo del 60% dalla linea di base del segnale mCherry). Questo parametro può essere utilizzato per quantificare la velocità con cui il contenuto acrosomiale viene disperso durante l'AE. - Diminuzione del segnale per la perdita di mCherry: determinare la differenza di ampiezza tra l'intensità di fluorescenza di mCherry al basale e il segnale successivo all'AE. Questo parametro indica la quantità totale di contenuto acrosomiale disperso su AE.
- Tracciare le variazioni di fluorescenza (F) per entrambi i canali rosso e verde come dati grezzi, oppure normalizzarle in base alla fluorescenza iniziale (F0) ed esprimerle come ΔF/F0. Quest'ultimo fornisce una migliore visualizzazione delle variazioni sia in rosso che in verde su un singolo grafico (ad esempio, vedere la Figura 3D e la Figura 3H).
NOTA: Infine, i diversi parametri misurati possono essere confrontati tra diverse condizioni per determinare la relazione tra le variazioni della concentrazione acrosomiale di calcio e l'AE. Per esempi di vari confronti di condizioni sperimentali, vedere il riferimento2.
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Representative Results
La Figura 2 fornisce un'illustrazione semplificata che mostra la sequenza di cambiamenti di fluorescenza previsti dopo la stimolazione riuscita degli spermatozoi. Il pannello superiore della Figura 2 illustra i cambiamenti nell'intensità della fluorescenza GCaMP3, dove il segnale è inizialmente debole (le concentrazioni di calcio acrosomiale al basale sono inferiori a GCaMP3 KD) e all'ingresso di ioni calcio attraverso i pori di fusione, la fluorescenza aumenta di luminosità. Infine, in caso di AE, si verifica una perdita di segnale dovuta alla diffusione e alla perdita del sensore nello spazio extracellulare. Il pannello inferiore della Figura 2 illustra le variazioni dell'intensità della fluorescenza mCherry, dove il segnale iniziale è luminoso e solo dopo l'AE e la diffusione del sensore insieme ad altri contenuti della matrice acrosomiale, si verifica un oscuramento del segnale rosso.
La Figura 3 fornisce i dati misurati effettivi per le fasi sopra illustrate in due spermatozoi vivi stimolati con 125 μM del ganglioside GM1 (per maggiori dettagli su come GM1 regola l'AE negli spermatozoi12), catturati in un singolo campo visivo. La Figura 3A,B e la Figura 3E,F mostrano i segnali rosso e verde misurati in due spermatozoi nel punto 0 (prima della stimolazione), dove inizialmente il segnale mCherry è luminoso e il GCaMP3 è debole. La Figura 3C, la Figura 3G e la Figura 3D, Figura 3H forniscono l'analisi del Profiler Z per l'intera durata dell'esperimento (dati grezzi o F/F0, rispettivamente). I pannelli Inserisci forniscono una visualizzazione ingrandita dell'intervallo di tempo in cui si verificano ACR e AE.
Poiché gli spermatozoi sono altamente eterogenei e molto sensibili ai danni alla membrana dovuti a varie procedure di manipolazione, la Figura 5 fornisce esempi di due tipi di risultati negativi. Le figure 5A,C mostrano diversi spermatozoi catturati all'interno di un campo visivo. Il contorno giallo evidenzia due spermatozoi che dimostrano un segnale GCaMP3 elevato al punto 0 (prima della stimolazione). Nei presenti esperimenti, tali cellule sono state evitate, in quanto indicano che la vescicola acrosomiale sta già attraversando un processo di fusione della membrana o che hanno subito un danno alla membrana che consente la fuoriuscita di calcio. Lo spermatozoo nella Figura 5A indicato dalla freccia (cerchio ROI nella Figura 5A,C) mostra un segnale mCherry iniziale ma nessuna risposta nei canali rosso o verde (Figura 5B,D, rispettivamente, che mostra la finestra di analisi Z-Profiler fornita da ImageJ) dopo la stimolazione con 125 μM GM1. Sebbene una sottopopolazione di spermatozoi, come quella fornita in questo esempio, non mostri alcuna risposta alla stimolazione, questi sono inclusi nell'analisi finale e sono calcolati nell'analisi dei dati di risposta percentuale2 (Figura 3).
Figura 1: Strumentazione e configurazione sperimentale. (A) Spermatozoi vivi su un vetrino coprioggetto rivestito di PDL posto in una camera di incubazione a 37 °C. Un capillare in borosilicato, tirato e collegato a un sistema di rilascio a singola cellula, è posizionato vicino alla cellula spermatica al centro dell'area di imaging per la somministrazione diretta dello stimolante. Sia il canale verde (GCaMP3) che quello rosso (mCherry) vengono continuamente monitorati e registrati a una frequenza di fotogrammi elevata (ad esempio, 10 fotogrammi/s) durante la stimolazione. (B) Rappresentazione schematica del modello di deposizione PDL sulla parabola di scorrimento. (C) Rappresentazione schematica delle aree specifiche della capsula in cui gli spermatozoi possono essere stimolati utilizzando il capillare per ridurre al minimo la stimolazione aspecifica da precedenti boccate nella stessa capanna. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Variazioni del segnale e dell'intensità della fluorescenza. Pannello superiore: Un aumento del segnale GCaMP3 indica l'afflusso di calcio nell'acrosoma, seguito dalla perdita di segnale dovuta alla diffusione della proteina di fusione AcroSensE. Pannello inferiore: il segnale mCherry rimane stabile durante la fusione iniziale della membrana, con successivo oscuramento in seguito alla diffusione di AcroSensE e all'esocitosi acrosomiale (AE). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Dati rappresentativi e tracce di fluorescenza. È stato visualizzato un campo contenente due spermatozoi. La fluorescenza del canale verde/rosso è stata quantificata offline utilizzando ImageJ e tracciata in Excel (come descritto nel passaggio 6). (A-D) Quantificazione dell'intensità di fluorescenza dei canali rosso (A) e verde (B) per la cella #1 nel tempo, calcolata per ROI selezionate, e quindi presentata come dati grezzi (C) o normalizzata al segnale iniziale (D, F/F0). L'inserto in (D) fornisce una vista ingrandita dell'intervallo di tempo da 25 a 125 s. (E-H) Quantificazione dell'intensità di fluorescenza del canale rosso (E) e verde (F) per la cella #2 nel tempo, calcolata per ROI selezionati e quindi presentata come dati grezzi (G) o normalizzata al segnale iniziale (H, F/F0). L'inserto in (H) fornisce una visualizzazione ingrandita dell'intervallo di tempo da 25 a 125 s. Barra della scala = 5 μm. Tutti gli assi x rappresentano il tempo in secondi (s). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Parametri di analisi e quantificazione dei dati. (A) Illustrazione di una tipica traccia dell'intensità della fluorescenza GCaMP3, che mostra parametri quantificabili, tra cui l'ora di inizio (secondi), l'ampiezza (intensità della fluorescenza) e la durata (secondi). (B) Illustrazione di una tipica traccia dell'intensità della fluorescenza mCherry, che mostra parametri quantificabili, tra cui l'ora di inizio (secondi), la durata (secondi), la pendenza (F/s), R60 (intensità della fluorescenza) e l'ampiezza (intensità della fluorescenza). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Risultati negativi. (A,C) canali mCherry (rosso) e GCaMP3 (verde) che mostrano più spermatozoi catturati in un unico campo visivo. La freccia in (A) indica uno spermatozoo che inizialmente mostra fluorescenza mCherry ma nessuna successiva variazione dell'intensità della fluorescenza in risposta alla stimolazione GM1 da 125 μM, come osservato nelle tracce generate dallo Z-Profiler fornite in (B) (mCherry) e (D) (GCaMP3). Le cellule all'interno del rettangolo giallo mostrano un'elevata intensità di fluorescenza GCaMP3 al punto 0, prima della stimolazione. Barra della scala = 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, viene descritto un metodo basato sulla microscopia per utilizzare il modello murino AcroSensE appena generato per il monitoraggio in tempo reale di una singola cellula e l'analisi dell'interazione tra la dinamica del calcio acrosomiale e i passaggi intermedi che portano all'AE. Insieme ad approcci genetici prontamente disponibili, come l'incrocio con altri modelli genetici murini o l'editing genetico, questo modello e metodo forniscono un potente sistema per studiare il ruolo di vari componenti e percorsi che prendono parte alle vie di segnalazione degli spermatozoi relative alla capacitazione, all'AE e alla fecondazione.
Passaggi critici
In tutte le fasi di manipolazione degli spermatozoi è importante utilizzare pipette di trasferimento in plastica di grande diametro o puntali per pipette a orifizio largo ed eseguire tutte le fasi di raccolta e lavaggio a 37 °C per ridurre al minimo i danni alla membrana. Allo stesso modo, un rotore a secchiello oscillante è preferibile a un rotore ad angolo fisso per evitare danni alla membrana dovuti all'interazione delle cellule con la parete laterale della provetta per microcentrifuga. Se è disponibile la correzione della deriva della posizione Z, si consiglia vivamente di applicare l'hardware/software di correzione della posizione Z per evitare la deriva degli spermatozoi ripresi dal piano focale durante l'intervallo di imaging.
Modifiche e risoluzione dei problemi
Il protocollo qui descritto è stato ottimizzato per gli studi sulla segnalazione 2,3 mediata dai lipidi e può essere applicato sia agli spermatozoi capacitati che a quelli non capacitati. Possono essere utilizzati diversi metodi per la capacitazione degli spermatozoi; Ad esempio, l'albumina o la ciclodestrina possono fungere da accettori di steroli. Inoltre, è possibile aggiungere o omettere vari substrati energetici o bicarbonato. Tuttavia, si noti che il bicarbonato si forma in mezzi acquosi dall'esposizione all'aria, quindi il test di condizioni veramente "prive di bicarbonato" richiederebbe un uso attento di un ambiente azotato in tutte le fasi di produzione/preparazione/manipolazione del mezzo e dell'esecuzione dell'esperimento. Il protocollo di cui sopra prevede l'utilizzo di 10 mM di calcio aggiunto alla soluzione sperimentale; tuttavia, gli ioni calcio possono essere omessi, chelati (ad esempio, EGTA) o aggiunti in concentrazioni inferiori per applicazioni sperimentali sensibili al calcio. Si prega di notare che l'abbassamento o l'omissione delle concentrazioni di calcio diminuirà il segnale GCaMP3 previsto dopo AE2. Inoltre, è possibile utilizzare altri supporti per questo protocollo (rispetto al MW utilizzato qui) che si adattano meglio al loro progetto sperimentale e ai loro obiettivi. Il protocollo fornito descrive l'uso dell'imaging a singola cellula e della somministrazione di stimolanti a singola cellula; Tuttavia, una variazione semplificata è ottenibile mediante stimolazione di massa, ad esempio aggiungendo il reagente stimolante all'intero piatto e non tramite sbuffo. Inoltre, sono possibili esperimenti sull'intera popolazione utilizzando il modello AcroSensE tramite l'uso di fluorimetri o lettori di piastre con capacità di fluorescenza.
Limitazioni
Il metodo qui fornito richiede la disponibilità, la manutenzione e l'uso di una colonia di topi AcroSensE. Il metodo dipende anche dalla disponibilità di un sistema di imaging avanzato, che è costoso e richiede personale qualificato. Per alcune applicazioni sperimentali, una possibile limitazione riguarda l'impossibilità di misurare contemporaneamente il calcio citosolico negli spermatozoi AcroSensE, poiché molti indicatori sintetici di calcio disponibili hanno una lunghezza d'onda simile a GCaMP3. Sebbene esuli dall'ambito di questo protocollo, le potenziali limitazioni degli esperimenti a livello di popolazione potrebbero includere la lettura del segnale mCherry dopo AE e la dispersione nel terreno o il segnale GCaMP3 proveniente da cellule morte/permeabilizzate. Per ottimizzare tali metodi, si potrebbe esplorare l'utilizzo della messa a fuoco z per ridurre al minimo il rumore di fondo da mCherry secreto e/o utilizzare controlli trattati in modo fittizio per garantire la quantificazione GCaMP di base da spermatozoi morti o permeabilizzati.
L'importanza del metodo rispetto ai metodi esistenti/alternativi
Negli ultimi due decenni, sono stati segnalati diversi metodi per studi in tempo reale delle dinamiche degli eventi avversi negli spermatozoi vivi, tra cui topi transgenici GFPmirati all'acrosoma 7, coloranti di calcio caricati nell'acrosoma (ad esempio, Fluo-412) o l'utilizzo di indicatori specifici per l'esocitosi come il colorante sintetico FM-6413. Tuttavia, rispetto a questi metodi, il modello AcroSensE offre la comodità di utilizzare spermatozoi minimamente trattati che non richiedono alcun carico di colorante o altre procedure potenzialmente perturbanti per la membrana. È importante sottolineare che c'è un grande vantaggio nell'avere spermatozoi che esprimono un doppio indicatore in grado di monitorare la dinamica del calcio acrosomiale, la fusione della membrana e la formazione dei pori, nonché l'AE e il conseguente rilascio del contenuto acrosomiale.
Importanza e potenziali applicazioni del metodo in specifiche aree di ricerca
Si noti che gli esempi di applicazione sperimentale riportati di seguito potrebbero essere eseguiti come saggi a singola cellula o di popolazione, con questi ultimi che presentano vantaggi significativi quando si desidera un'analisi ad alto rendimento. Gli studi sulla dinamica degli eventi avversi in vari modelli murini possono essere condotti mediante incrocio con il modello murino AcroSensE, tra cui (1) forme nulle o mutate di vari canali del calcio o subunità dei canali del calcio (ad esempio, incrocio con modelli α1E- e CatSper-null); (2) forme nulle o mutate di proteine che mediano la fusione di membrana (e.g., SNARE). Inoltre, possono essere condotti studi per studiare come vari agenti farmacologici correlati a diverse vie di segnalazione modulano il calcio acrosomiale e le dinamiche AE. Inoltre, è possibile condurre ricerche su come i cambiamenti ambientali influenzano l'AE, tra cui temperatura, pH e presenza o concentrazione di vari ioni o piccole molecole.
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Disclosures
Nessun autore ha conflitti di interesse da segnalare in relazione a questo lavoro.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni R01-HD093827 e R03-HD090304 (A.J.T) del National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
References
- Austin, C. R. Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg. Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).
- Cohen, R., et al. A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis. J Biol Chem. 298 (5), 101868 (2022).
- Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J.
- Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm. J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).
- Sosa, C. M., et al. Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis). Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).
- Balestrini, P. A., et al. Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time. Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).
- Nakanishi, T., et al. Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein. FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).
- Kim, K. S., Gerton, G. L. Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm. Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).
- Hasuwa, H., et al. Transgenic mouse sperm that have green acrosome and red mitochondria allow visualization of sperm and their acrosome reaction in vivo. Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science. 59 (1), 105-107 (2010).
- Henderson, M. J., et al. A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store. PloS one. 10 (10), 0139273 (2015).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. J Biol Chem. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Cohen, R., et al. Lipid modulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis and fertilization. Dev Cell. 28 (3), 310-321 (2014).
- Sanchez-Cardenas, C., et al. Acrosome reaction and Ca(2)(+) imaging in single human spermatozoa: new regulatory roles of [Ca(2)(+)]i. Biol Reprod. 91 (2), 67 (2014).
