Summary
O modelo de camundongo AcroSensE e os métodos de imagem de células vivas descritos aqui fornecem uma nova abordagem para estudar a dinâmica do cálcio no compartimento subcelular do acrossoma espermático e como eles regulam etapas intermediárias que levam à fusão da membrana e exocitose acrossomal.
Abstract
A exocitose acrossômica (AE), na qual a única vesícula exocitótica do espermatozoide se funde com a membrana plasmática, é um processo complexo, cálcio-dependente, essencial para a fecundação. No entanto, nossa compreensão de como a sinalização do cálcio regula o EA ainda é incompleta. Em particular, a interação entre a dinâmica intra-acrossomal do cálcio e as etapas intermediárias que levam ao EA não é bem definida. Aqui, descrevemos um método que fornece informações espaciais e temporais sobre a dinâmica do cálcio acrossomal e sua relação com a fusão de membrana e subsequente exocitose da vesícula acrossomal. O método utiliza um novo camundongo transgênico expressando um sensor para exocitose (AcroSensE) direcionado a um acrossoma. O sensor combina um indicador de cálcio codificado geneticamente (GCaMP) fundido com mCherry. Esta proteína de fusão foi projetada especificamente para permitir a observação simultânea da dinâmica do cálcio acrossomal e eventos de fusão de membrana. O monitoramento em tempo real da dinâmica do cálcio acrossomal e AE em espermatozoides vivos AcroSensE é obtido usando uma combinação de imagens de alta taxa de quadros e um sistema de entrega de estimulantes que pode atingir um único espermatozoide. Este protocolo também fornece vários exemplos de métodos básicos para quantificar e analisar os dados brutos. Como o modelo AcroSensE é codificado geneticamente, seu significado científico pode ser aumentado usando ferramentas genéticas prontamente disponíveis, como cruzamento com outros modelos genéticos de camundongos ou métodos baseados em edição genética (CRISPR). Com essa estratégia, os papéis de vias de sinalização adicionais na capacitação e fertilização espermática podem ser resolvidos. Em resumo, o método descrito aqui fornece uma ferramenta conveniente e eficaz para estudar a dinâmica do cálcio em um compartimento subcelular específico - o acrossoma espermático - e como essas dinâmicas regulam as etapas intermediárias que levam à fusão da membrana e à exocitose acrossomal.
Introduction
Os espermatozoides adquirem a capacidade de fecundar durante um processo chamado capacitação1. Um ponto final desse processo é que os espermatozoides adquirem a capacidade de sofrer EA. Mais de duas décadas de dados suportam a presença de um modelo complexo e de várias etapas de EA em espermatozoides de mamíferos (resumido em 2,3). No entanto, estudar EA em espermatozoides vivos é um desafio, e os métodos atualmente disponíveis para monitorar esse processo com resolução adequada são complicados e requerem várias etapas de preparação4, são limitados à detecção da etapa final do EA (por exemplo, usando PNA5), são limitados a medidas de alterações no cálcio citosólico (em contraste com a dinâmica do cálcio acrossomal), ou limitam-se a medidas da dinâmica citosólica do cálcio ou AE6.
Para superar algumas das principais limitações dos estudos de EA em tempo real sob condições fisiológicas e permitir a investigação da interação entre a dinâmica do cálcio e EA, um modelo único de camundongo foi gerado. Neste modelo de camundongo, uma proteína de fusão composta pelo sensor Ca2+ codificado geneticamente (GCaMP3) e mCherry é expressa e direcionada para o acrossoma usando um promotor de acrosina e peptídeo de sinalização2. O sensor duplo GCaMP3-mCherry direcionado permite medições simultâneas em tempo real das concentrações de cálcio e do estado do conteúdo acrossomal em espermatozoides vivos em condições fisiológicas usando microscopia e um sistema de liberação de estimulante de célula única (Figura 1). Como componente da matriz acrisomal, a fusão da membrana e o AE resultariam na perda da fluorescência mCherry fotosestável e insensível ao pH do espermatozoide, uma vez que essa proteína se difunde para fora da vesícula do acrossoma. Nesse sentido, a capacidade do modelo de refletir o momento e a ocorrência de EA é semelhante aos benefícios da linhagem de camundongos GFP direcionada para acrossoma7,8,9.
A variante GCaMP3 usada nesta linha de camundongos transgênicos tem um KD aproximado de 400 μM e uma faixa dinâmica para Ca2+ de 10-4-10-3 M10, o que é adequado para esta vesícula. Mostramos que essa combinação de características da GCaMP3 poderia revelar a formação de poros de fusão entre a membrana plasmática e a membrana acrossomal externa (MAO)2. A detecção de poros de fusão é resultado do tamanho dos poros ser muito pequeno para permitir que a proteína AcroSensE se disperse para fora do acrossoma (através da perda de conteúdo acrossomo) enquanto fornece um "canal" de membrana que permite o influxo de íons Ca2+ no lúmen acrossomo, levando a um aumento na intensidade de fluorescência do GCaMP3.
A proteína fluorescente brilhante, monomérica e não sensível ao cálcio mCherry suporta a visualização do acrossoma enquanto o sinal GCaMP3 é fraco (por exemplo, antes da ligação de Ca2+ , Figura 2) e, importante, também permite a identificação de espermatozoides intactos de acrossoma adequados para exames de imagem.
O protocolo a seguir descreve a utilização do modelo único de camundongos AcroSensE e os métodos de microscopia usados experimentalmente para estudar a dinâmica do cálcio espermático e AE com alta resolução espacial e temporal.
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Protocol
Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Cornell (#2002-0095). Camundongos AcroSensE2 com 8-10 semanas de idade foram utilizados para o presente estudo. Pedidos de informação sobre a disponibilidade dos ratos AcroSensE podem ser submetidos ao autor correspondente.
1. Coleta e lavagem de espermatozoides
- Coletar espermatozoides epididimais caudais (mais detalhes sobre este procedimento são fornecidos em11) de camundongos AcroSensE. Permitir 15 min de procedimento de nadar em uma placa de cultura de tecidos de 3,5 cm contendo 0,5 mL de meio de Whitten modificado (MW) a 37 °C. A placa deve ser coberta para reduzir a evaporação do MW, e deve ser inclinada para que o meio tenha profundidade suficiente para cobrir a cauda dos epidídimos.
NOTA: O meio de Whitten modificado (MW) inclui 22 mM HEPES, 1,2 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1 mM ácido pirúvico, 4,8 mM ácido láctico hemi-Ca2+ sal, pH 7,35. Glicose (5,5 mM), NaHCO3 (10 mM) e 2-hidroxipropil-ciclodextrina (CD; 3 mM) são suplementados (ver Tabela de Materiais) conforme necessário para indução de capacitação, e as concentrações podem ser modificadas para experimentos específicos. Além disso, aceptores alternativos de esterol poderiam ser usados em vez de CD (por exemplo, albumina de soro bovino ou lipoproteínas de alta densidade). - Usando pinças finas, remova qualquer tecido epididimal da placa de coleta de natação. Transfira o meio contendo os espermatozoides para um tubo cônico de 15 mL e centrifugar a suspensão a 100 x g por 1 min em um rotor de balde oscilante à temperatura ambiente. Usando uma pipeta de plástico, remova o sobrenadante MW que contém os espermatozoides de qualquer detrito de tecido grosseiro que terá peletizado nesta etapa.
- Levar o sobrenadante de MW contendo os espermatozoides a um volume total de 3 mL adicionando MW a 37 °C. Centrifugar a 400 x g durante 8 min (à temperatura ambiente) num tubo de fundo redondo. Remova lentamente o sobrenadante de MW dos espermatozoides soltos.
- Se viável, o espermatozoide deve aparecer como uma pelota de aparência "fofa". Ressuspenda suavemente os espermatozoides através da trituração com uma pipeta de transferência de furo grande ou através de toques manuais suaves no tubo ("toque do dedo"). Uma vez ressuspensos uniformemente, transfira-os para um novo tubo de fundo redondo. Use 10-20 μL da suspensão de espermatozoides para contar e avaliar a motilidade. Diluir os espermatozoides em MW para uso.
NOTA: Para a maioria dos experimentos envolvendo a capacitação de espermatozoides de camundongos, uma concentração final de 5-10 milhões de espermatozoides/mL MW é utilizada. O protocolo de imagem aqui descrito não requer a capacitação dos espermatozoides, embora seja necessário que os espermatozoides adquiram a capacidade de se submeter a exocitose acrossômica fisiologicamente relevante. Pode-se estudar exocitose patológica ou exocitose induzida através de reagentes como um ionóforo de cálcio sem capacitar os espermatozoides. Adicionalmente, pode-se explorar possíveis alterações no cálcio acrossomal em células não capacitadas em resposta a vários estímulos. - Use os espermatozoides dentro de 3-5 h da coleta, mantendo o tempo o mais curto possível e consistente entre os ensaios experimentais.
- Realizar todas as etapas de coleta e lavagem a 37 °C utilizando meio MW, empregando métodos para minimizar os danos à membrana. Isso inclui o uso de pipetas de transferência de plástico de grande calibre ou pontas de pipeta de orifício grande, que são recomendadas para uso durante todas as etapas do procedimento.
2. Revestimento poli-D-lisina de placas de deslizamento para imagem
NOTA: Pratos de poli-D-lisina (PDL) devem ser preparados frescos antes de cada experimento.
- Dispense uma gota de PDL de 0,5 μL (0,5 mg/mL, ver Tabela de Materiais) no centro de uma placa de cobertura.
- Usando uma ponta graduada de 10 μL, esfregue a gota PDL através da lamínula (padrão cruzado como mostrado na Figura 1B).
- Deixe secar a 37 °C durante 10 min. Mantenha os pratos revestidos com PDL cobertos e a 37 °C até usar.
3. Tração capilar, carregamento para puffing
- Puxe os capilares de vidro borossilicato (O.D, 2 mm, I.D, 1,56 mm, consulte a Tabela de Materiais) usando as seguintes configurações: Calor: 330, Puxar: 250, Velocidade: 250 e Tempo: 70. Esta etapa deve ser otimizada para o extrator específico em uso.
- Antes de cada experimento, carregar um único capilar com a solução estimulante contendo 3-5x a concentração do estimulante (para explicar a rápida difusão da solução ao puffing). Antes do enchimento, use uma pinça fina para abrir a ponta capilar a aproximadamente 1-2 mm da extremidade. Isso deve produzir um diâmetro de abertura de ∼5 μm. Não é necessário polimento térmico.
- Usando uma pipeta de transferência de plástico fina, injete lentamente a solução estimulante no capilar até que três quartos de seu comprimento esteja cheio.
- Remova quaisquer bolhas de ar formadas durante o enchimento por meio de movimentos suaves do capilar.
- Monte capilar preenchido no micromanipulador (ver Tabela de Materiais).
4. Preparação da aplicação de estimulação para puffing
NOTA: Para minimizar o risco de lesão do usuário, óculos de segurança devem ser usados durante a operação do procedimento de puffing.
- Configure as configurações do sistema de entrega de célula única para fornecer um pulso de 10 s a 5 psi.
- Conecte o capilar de borossilicato ao suporte da pipeta do sistema de entrega de célula única. Certifique-se de que as vedações estejam apertadas.
- Ao observar a ponta capilar, aplique um sopro curto de 2 s a 20 psi para garantir que a solução seja realmente dispensada através da extremidade da ponta (uma pequena gota deve ser óbvia no final da ponta).
5. Microscopia e aquisição de imagens
NOTA: Várias marcas de microscópios estão disponíveis e podem ser usados; no entanto, uma taxa de quadros mínima de 3 quadros / s é desejável. Em relação à temperatura e ao controle ambiental, observe que a temperatura real do meio no prato deve ser confirmada, por exemplo, usando um termômetro infravermelho sem contato.
- Adicionar 80 μL de esperma diluído ao centro de uma placa de cobertura de 35 mm revestida com poli-D-lisina. Para a maioria dos experimentos envolvendo a capacitação de espermatozoides em camundongos, uma concentração final de 5-10 milhões de espermatozoides/mL é utilizada.
- Adicionar lentamente ao esperma 3 mL de meio base MW morno (37 °C) suplementado com CaCl2 10 mM.
NOTA: Pode-se realizar experimentos à temperatura ambiente para retardar os processos celulares, mas é importante notar que, como a capacitação é mediada pelas trocas lipídicas e pela fluidez dos micro e macrodomínios, deve-se ter em mente que a capacitação fisiologicamente relevante e a exocitose acrossômica são processos dependentes da temperatura. - Monte o prato com os espermatozoides no microscópio (pré-aquecido a 37 °C).
- Excite o GCaMP3 usando uma linha de laser de 488 nm e visualize com um filtro passa-banda (BP) de 505-550 nm. Excite o mCherry usando uma linha laser de 555 nm e visualize com um filtro BP de 575-615 nm.
- Usando um micromanipulador (recomenda-se fixar o manipulador à mesa de ar na qual o microscópio foi montado.), posicione a ponta do capilar aproximadamente 100 μm ao lado e 5-10 μm acima do plano da célula de interesse.
NOTA: As soluções estimulantes são feitas a 3-5x a concentração normal para compensar a rápida difusão que ocorre no volume entre o capilar e a célula. - Inicie a sequência de imagens no microscópio.
- Imagem de espermatozoides a uma alta taxa de quadros, de preferência >10 quadros/s. Aqui, foi utilizado um scanner ressonante que permite a obtenção de imagens a 33 ms/frame.
- Dez segundos após iniciar a aquisição da imagem ao microscópio, ative o sistema de liberação unicelular para iniciar o sopro de 10 s do estimulante.
- Células de imagem por uma duração de 10-15 min.
- Usando o sistema de liberação de célula única, imagine várias células de um único prato de acordo com os locais fornecidos na Figura 1B.
NOTA: Os espermatozoides não tratados/não estimulados ao microscópio devem aparecer principalmente vermelhos, com baixa intensidade do sinal verde. As cabeças de espermatozoides devem ser presas à lamínula, e os espermatozoides vivos podem ser identificados por suas caudas em movimento. Nos espermatozoides que sofrem EA, o sinal verde GCaMP3 aumentará inicialmente, e tanto o sinal vermelho mCherry quanto o sinal verde GCaMP3 desaparecerão se o AE estiver completo, como ilustrado na Figura 2. A redução da fluorescência mCherry fornece um indicador mais específico do momento em que o AE começa, pois mudanças nas concentrações de Ca2+ causarão continuamente mudanças na intensidade da fluorescência GCaMP3.
6. Análise de imagens e dados
NOTA: A análise de imagem off-line é realizada usando o ImageJ (consulte a Tabela de Materiais). Anteriormente, várias etapas intermediárias foram relatadas no processo que levou ao EA, incluindo elevação do cálcio acrossomal (RAC) e fusão completa da membrana. Este último leva à perda da fluorescência mCherry e, portanto, representa AE completo. Em algumas células, sinais semelhantes a eventos pré-pé de espícula (PSF) são observados ao usar abordagens amperométricas em estudos de exocitose (para mais detalhes, consulte2). Vários métodos opcionais estão disponíveis para analisar os dados brutos do AcroSensE para quantificar ACR, AE e suas etapas intermediárias. A seguir, descrevemos alguns dos métodos analíticos básicos.
- Dependendo da extensão de arquivo do sistema do microscópio específico, use a ferramenta de canal dividido (Image > Colors > Split Channels) para gerar janelas individuais para os canais GCaMP3 e mCherry.
- Sincronize as janelas individuais usando a ferramenta "Sincronizar janela" (Analisar > Ferramentas > Sincronizar Windows).
- Selecione uma região de interesse (ROI) ao redor da cabeça do espermatozoide no canal vermelho para incluir a região acrossômica (Figura 3A,B). A ferramenta de sincronização permite que a mesma seleção de área seja aplicada automaticamente no canal verde, no qual os espermatozoides ainda estão muito escuros para serem visíveis.
- Escolha o plugin "Z Profiler" (Plugins > Stacks > Z Profiler) ou "Time Series Analyzer" (Plugins > Stacks > Time Series Analyzer) para plotar a mudança na intensidade da fluorescência em função de quadros/tempo para cada um dos dois canais.
- Copie os dados para um software de planilha (por exemplo, Microsoft Excel) para plotagem e análise adicional.
Observação : uma vez que os dados são copiados para uma planilha, vários parâmetros podem ser extraídos para análise, incluindo o seguinte, conforme ilustrado na Figura 4.- Tempo de início do Fusion Pore (FP): meça o tempo do ponto de tempo 0 até o ponto de tempo em que o sinal GCaMP3 começa a subir. Esse parâmetro indica o atraso entre a estimulação e a resposta do ACR espermático.
- Hora de início AE: meça o tempo do ponto de tempo 0 até o ponto de tempo onde o sinal mCherry começa a decair. Esse parâmetro indica o atraso entre a estimulação e a resposta espermática AE. Esse parâmetro também pode ser usado para calcular o atraso entre a formação do PF e a resposta do EA.
- Pico de amplitude de FP: mede o sinal de fluorescência da base até o pico de elevação do sinal GCaMP3. Esse parâmetro indica o aumento total na resposta do ACR.
- Taxa de perda de mCherry: determine este parâmetro por um ajuste linear ou exponencial na seção da perda do sinal mCherry (como indicado por "inclinação" na Figura 4B).
NOTA: Alternativamente, determine a taxa de decaimento pelo método do sinal residual (R) em vários pontos de tempo (por exemplo, R60: tempo de duração em segundos para um sinal residual de 60% da linha de base do sinal mCherry). Esse parâmetro pode ser usado para quantificar a taxa de dispersão do conteúdo arossomal sobre EA. - Diminuição do sinal para perda de mCherry: determine a diferença de amplitude entre a intensidade de fluorescência mCherry basal e o sinal após AE. Esse parâmetro indica a quantidade total de conteúdo acrossomal disperso sobre EA.
- Plotar as mudanças na fluorescência (F) para os canais vermelho e verde como dados brutos, ou normalizá-los pela fluorescência inicial (F0) e expressá-los como ΔF/F0. Este último fornece melhor visualização das mudanças em vermelho e verde em um único gráfico (por exemplo, veja a Figura 3D e a Figura 3H).
NOTA: Finalmente, os diferentes parâmetros medidos podem ser comparados entre diferentes condições para determinar a relação entre mudanças na concentração de cálcio acrossomal e EA. Para exemplos de várias comparações de condições experimentais, ver referência2.
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Representative Results
A Figura 2 fornece uma ilustração simplificada mostrando a sequência de mudanças de fluorescência esperadas após a estimulação bem-sucedida dos espermatozoides. O painel superior da Figura 2 ilustra as mudanças na intensidade da fluorescência do GCaMP3, onde o sinal é inicialmente fraco (as concentrações basais de cálcio acrossomal são menores que o GCaMP3 KD), e na entrada de íons cálcio através dos poros de fusão, a fluorescência aumenta em brilho. Finalmente, na EA, há perda do sinal devido à difusão e à perda do sensor para o espaço extracelular. O painel inferior da Figura 2 ilustra as mudanças na intensidade de fluorescência mCherry, onde o sinal inicial é brilhante, e somente após AE e difusão do sensor juntamente com outros conteúdos da matriz acrossomal, há um escurecimento do sinal vermelho.
A Figura 3 fornece dados reais medidos para os estágios ilustrados acima em dois espermatozoides vivos estimulados com 125 μM do gangliosídeo GM1 (para obter mais detalhes sobre como o GM1 regula o AE no espermatozoide12), capturados em um único campo de visão. As Figuras 3A,B e 3E,F mostram os sinais vermelho e verde medidos em dois espermatozoides no ponto de tempo 0 (antes da estimulação), onde, inicialmente, o sinal mCherry é brilhante e o GCaMP3 é fraco. A Figura 3C, a Figura 3G e a Figura 3D, Figura 3H fornecem a análise do Z Profiler para toda a duração do experimento (dados brutos ou F/F0, respectivamente). Os painéis de inserção fornecem uma exibição ampliada da janela de tempo em que o ACR e o AE ocorrem.
Como os espermatozoides são altamente heterogêneos e muito sensíveis a danos na membrana devido a vários procedimentos de manuseio, a Figura 5 fornece exemplos de dois tipos de resultados negativos. A Figura 5A,C mostra vários espermatozoides capturados dentro de um campo de visão. O contorno amarelo destaca dois espermatozoides que demonstram um alto sinal GCaMP3 no ponto de tempo 0 (antes da estimulação). Nos experimentos atuais, tais células foram evitadas, pois indicam que a vesícula acrossomal já está passando por algum processo de fusão de membrana ou que sofreram algum dano à membrana que permite o vazamento de cálcio. O espermatozoide na Figura 5A indicado pela seta (círculo ROI na Figura 5A,C) demonstra um sinal mCherry inicial, mas nenhuma resposta nos canais vermelho ou verde (Figura 5B,D, respectivamente, mostrando a janela de análise Z-Profiler fornecida pelo ImageJ) após estimulação com 125 μM GM1. Embora uma subpopulação de espermatozoides, como a fornecida neste exemplo, não mostre resposta à estimulação, estes são incluídos na análise final e são calculados na análise dos dados de resposta percentual2 (Figura 3).
Figura 1: Instrumentação e montagem experimental. (A) Espermatozoides vivos em uma placa de cobertura revestida de PDL colocados em uma câmara de incubação a 37 °C. Um capilar de borossilicato, tracionado e ligado a um sistema de entrega de célula única, é posicionado perto do espermatozoide no centro da área de imagem para entrega direta de estimulantes. Ambos os canais verde (GCaMP3) e vermelho (mCherry) são continuamente monitorados e gravados a uma alta taxa de quadros (por exemplo, 10 quadros / s) durante a estimulação. (B) Representação esquemática do padrão de deposição PDL na placa de cobertura-deslizamento. (C) Representação esquemática das áreas específicas do prato onde os espermatozoides podem ser estimulados usando o capilar para minimizar a estimulação inespecífica de baforadas anteriores no mesmo prato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Alterações no sinal e intensidade da fluorescência. Painel superior: Um aumento no sinal GCaMP3 significa influxo de cálcio para o acrossoma, seguido por perda de sinal devido à difusão da proteína de fusão AcroSensE. Painel inferior: o sinal mCherry permanece estável durante a fusão inicial da membrana, com subsequente escurecimento após a difusão do AcroSensE e exocitose acrossomal (AE). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Dados representativos e traços de fluorescência. Um campo contendo dois espermatozoides foi fotografado. A fluorescência dos canais verde/vermelho foi quantificada offline usando ImageJ e plotada no Excel (conforme descrito na etapa 6). (A-D) Quantificação da intensidade de fluorescência dos canais vermelho (A) e verde (B) para a célula #1 ao longo do tempo, calculada para ROIs selecionadas e, em seguida, apresentada como dados brutos (C) ou normalizada para o sinal inicial (D, F/F0). A inserção em (D) fornece uma visão ampliada do período de tempo de 25-125 s. (E-H) Quantificação da intensidade de fluorescência dos canais vermelho (E) e verde (F) para a célula #2 ao longo do tempo, calculada para ROIs selecionadas e, em seguida, apresentada como dados brutos (G) ou normalizada para o sinal inicial (H, F/F0). A inserção em (H) fornece uma exibição ampliada do período de tempo de 25-125 s. Barra de escala = 5 μm. Todos os eixos x representam o tempo em segundos (s). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise dos dados e parâmetros de quantificação. (A) Ilustração de um traço típico de intensidade de fluorescência GCaMP3, exibindo parâmetros quantificáveis, incluindo Hora de Início (segundos), Amplitude (intensidade de fluorescência) e Duração (segundos). (B) Ilustração de um traço típico de intensidade de fluorescência mCherry, exibindo parâmetros quantificáveis, incluindo Tempo de Início (segundos), Duração (segundos), Inclinação (F/s), R60 (intensidade de fluorescência) e Amplitude (intensidade de fluorescência). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Resultados negativos. (A,C) canais mCherry (vermelho) e GCaMP3 (verde) mostrando múltiplos espermatozoides capturados em um único campo de visão. A seta em (A) indica um espermatozoide exibindo inicialmente fluorescência mCherry, mas nenhuma mudança subsequente na intensidade da fluorescência em resposta à estimulação de 125 μM GM1, como observado nos traços gerados pelo Z-Profiler fornecidos em (B) (mCherry) e (D) (GCaMP3). As células dentro do retângulo amarelo exibem intensidade elevada de fluorescência GCaMP3 no ponto de tempo 0, antes da estimulação. Barra de escala = 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, um método baseado em microscopia é descrito para utilizar o modelo de camundongo AcroSensE recém-gerado para monitoramento em tempo real, de célula única e análise da interação entre a dinâmica do cálcio acrossomal e as etapas intermediárias que levam ao EA. Juntamente com abordagens genéticas prontamente disponíveis, como cruzamento com outros modelos genéticos de camundongos ou edição de genes, este modelo e método fornecem um sistema poderoso para estudar o papel de vários componentes e vias que participam das vias de sinalização espermática relacionadas à capacitação, AE e fertilização.
Etapas críticas
É importante em todas as etapas de manuseio de espermatozoides usar pipetas de transferência de plástico de grande calibre ou pontas de pipeta de orifício grande e executar todas as etapas de coleta e lavagem a 37 °C para minimizar os danos à membrana. Da mesma forma, um rotor de caçamba oscilante é preferível a um rotor de ângulo fixo para evitar danos à membrana devido às células interagindo com a parede lateral do tubo de microcentrífuga. Se a correção de desvio de posição Z estiver disponível, a aplicação de hardware/software de correção de posição z é altamente recomendada para evitar a deriva dos espermatozoides fotografados para fora do plano focal durante o intervalo de imagem.
Modificações e solução de problemas
O protocolo aqui descrito foi otimizado para estudos de sinalização mediada porlipídios 2,3 e pode ser aplicado tanto em espermatozoides capacitados quanto em não capacitados. Diferentes métodos para capacitação espermática podem ser usados; Por exemplo, albumina ou ciclodextrina podem servir como aceptores de esterol. Além disso, vários substratos energéticos ou bicarbonato podem ser adicionados ou omitidos. No entanto, observe que o bicarbonato se formará em meios aquosos a partir da exposição ao ar, portanto, o teste de condições verdadeiramente "livres de bicarbonato" exigiria o uso cuidadoso de um ambiente de nitrogênio em todas as etapas de fabricação/preparação/manuseio do meio e realização do experimento. O protocolo acima inclui o uso de 10 mM de cálcio adicionado à solução experimental; no entanto, íons cálcio podem ser omitidos, quelatados (por exemplo, EGTA) ou adicionados em concentrações mais baixas para aplicações experimentais sensíveis ao cálcio. Observe que reduzir ou omitir as concentrações de cálcio diminuirá o sinal GCaMP3 esperado no AE2. Além disso, pode-se utilizar outros meios para este protocolo (versus os MW aqui utilizados) que melhor se ajustem ao seu desenho experimental e objetivos. O protocolo fornecido descreve o uso de imagens de célula única e liberação de estimulantes de célula única; no entanto, uma variação simplificada é alcançável por estimulação em massa, como pela adição do reagente estimulante a todo o prato e não por meio de puffing. Além disso, experimentos com populações inteiras também são possíveis usando o modelo AcroSensE por meio do uso de fluorímetros ou leitores de placas com capacidade de fluorescência.
Limitações
O método fornecido aqui requer a disponibilidade, manutenção e uso de uma colônia de camundongos AcroSensE. O método também depende da disponibilidade de um sistema de imagem avançado, que é caro e requer pessoal treinado. Para algumas aplicações experimentais, uma possível limitação diz respeito à incapacidade de medir concomitantemente o cálcio citosólico em espermatozoides AcroSensE, já que muitos indicadores sintéticos de cálcio disponíveis são de comprimento de onda semelhante ao GCaMP3. Embora fora do escopo deste protocolo, potenciais limitações de experimentos em nível populacional podem incluir a leitura do sinal mCherry após AE e dispersão no meio ou sinal GCaMP3 proveniente de células mortas/permeabilizadas. Para otimizar tais métodos, pode-se explorar o emprego de foco z para minimizar o ruído de fundo do mCherry secretado e/ou utilizar controles tratados com simulação para garantir a quantificação basal de GCaMP de espermatozoides mortos ou permeabilizados.
A importância do método em relação aos métodos existentes/alternativos
Nas últimas duas décadas, houve relatos de vários métodos para estudos em tempo real da dinâmica de EA em espermatozoides vivos, incluindo camundongos transgênicos GFP 7 direcionados para acrossoma, corantes de cálcio carregados no acrossoma (por exemplo, Fluo-412) ou usando indicadores específicos de exocitose, como o corante sintético FM-6413. No entanto, em comparação com esses métodos, o modelo AcroSensE fornece a conveniência de usar espermatozoides minimamente tratados que não requerem qualquer carga de corante ou outros procedimentos potencialmente perturbadores da membrana. É importante ressaltar que há uma grande vantagem em ter espermatozoides que expressam um indicador duplo que pode monitorar a dinâmica do cálcio acrossomal, a fusão da membrana e a formação de poros, bem como AE e a consequente liberação do conteúdo acrossomal.
Importância e potencial de aplicação do método em áreas específicas de pesquisa
Observe que os exemplos de aplicação experimental abaixo podem ser realizados como ensaios de célula única ou de população, com o último tendo vantagens significativas quando a análise de alto rendimento é desejada. Estudos da dinâmica de EA em vários modelos de camundongos podem ser realizados por meio de cruzamento com o modelo de camundongos AcroSensE, incluindo (1) formas nulas ou mutadas de vários canais de cálcio ou subunidades de canais de cálcio (por exemplo, cruzamento com modelos α1E e CatSper nulo); (2) formas nulas ou mutadas de proteínas que medeiam a fusão da membrana (por exemplo, SNAREs). Além disso, estudos podem ser conduzidos para investigar como vários agentes farmacológicos relacionados a diferentes vias de sinalização modulam a dinâmica do cálcio acrossomal e do AE. Além disso, pesquisas podem ser conduzidas sobre como as mudanças ambientais afetam o AE, incluindo temperatura, pH e a presença ou concentração de vários íons ou pequenas moléculas.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse a relatar relacionados a este trabalho.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do National Institutes of Health R01-HD093827 e R03-HD090304 (A.J.T).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
References
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