Här använder vi ett mänskligt esiRNA bibliotek i en hög genomströmning skärm för gener involverade i celldelningen. Vi visar hur du ställer upp och genomföra en esiRNA skärmar, samt hur man kan analysera och validera resultaten.
RNA-interferens (RNAi) är en grundläggande cellulära mekanism för kontroll av genuttryck. RNAi är induceras av kort dubbelsträngat RNA även känd som små störande RNA (siRNA). Den korta dubbel-strängat RNA härstammar från längre strandsatta dubbelt prekursorer av verksamheten i Dicer, ett protein av RNas III familjen endonukleaser. Den resulterande fragment är delar av RNA-inducerad tysta komplex (RISC), rikta den till besläktat målet mRNA. RISC klyver målet mRNA och därmed minska uttrycket av protein som bildas 1,2,3. RNAi har blivit en kraftfull och används ofta experimentell metod för förlust av studier geners funktion i däggdjursceller utnyttja små störande RNA.
För närvarande två huvudsakliga metoder finns tillgängliga för produktion av små störande RNA. En metod innebär kemisk syntes, medan en alternativ metod sysselsätter endonucleolytic klyvning av målspecifika långa dubbel-strängat RNA som RNas III in vitro. Därmed är ett mångsidigt pool av siRNA-liknande oligonukleotider fram som också är känd som endoribonuclease förberedda siRNA eller esiRNA. En jämförelse av effekten av kemiskt framställda siRNA och esiRNAs visar att både triggers är potenta i Target-geners uttryck. Skillnaderna kan dock ses vid en jämförelse specificitet. Många ensamstående kemiskt syntetiserade siRNA producera framstående ej åsyftade effekter, medan den komplexa blandningen inneboende i esiRNAs leder till en mer specifik ÖVERVÄLDIGANDE 10.
I denna studie presenterar vi designen av genomet skala bibliotek MISSION esiRNA och dess användning för RNAi screening exemplifieras av ett DNA-innehåll på skärmen för att identifiera gener involverade i cellcykelreglering. Vi visar hur man kan optimera transfektion protokollet och analysen för screening med hög genomströmning. Vi visar också hur stora data-uppsättningar kan utvärderas statistiskt och presentera metoder för att validera primära träffar. Slutligen ger vi möjligheter utgångspunkter för ytterligare funktionella karakteriseringar av validerade träffar.
RNA-interferens har blivit en standardiserad teknik för att studera förlust-av-funktion fenotyper. Storskalig samlingar av RNAi-medlare är tillgängliga från olika leverantörer och ger en enkel, kostnadseffektiv och snabb metod för gen-tystas. Detta öppnade grinden för systematisk screening för nyckel-spelare i många biologiska processer möjliggör en genomet skala perspektiv på ett brett spektrum av olika arter och celltyper.
Hög falskt positiva och falskt negativa resultat är en gemensam utmaning i RNAi skärmar. För att lösa detta problem har stora ansträngningar har investerats för att förbättra effektivitet och i synnerhet specificitet tysta triggers. En viktig upptäckt var att en pool av olika siRNA inriktade på samma avskriften kraftigt förbättrar mål specificitet. Eftersom en mycket komplex grupp av olika siRNA produceras av endoribonuclease, esiRNAs är höga mål specificitet triggers, minska falska positiva ränta i RNAi skärmar. esiRNAs har också visat att uppnå en effektiv knockdowns, minskar också den falska negativ ränta.
Eftersom RNAi-skärmar är tekniskt krävande, kommer de fortfarande sannolikt en utmaning att utföra på ett rutinmässigt under en tid. Men som reagens och instrument bli bättre och laboratorier dela sina kunskaper, är användningen av RNAi skärmar i modern biologi bedöms öka i framtiden.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka för medlemmar i Buchholz laboratoriet och Sigma-Aldrich RNAi-team för diskussion. Vi vill tacka Max Planck Society och Bundesministerium für Bildung und Forschung Grands Go-Bio [0315105] för stöd.
MISSION ® är ett registrerat varumärke som tillhör Sigma-Aldrich Bioteknik LP
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comments |
MISSION esiRNA | Sigma-Aldrich | For additional information contact: rnai@sial.com | ||
Wellmate | ThermoScientific | |||
Breathable sealing tape | Corning | Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345) | ||
OptiMEM | Invitrogen | |||
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof (absolute), for molecular biology | |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology | |
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D8417 | Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC) | |
Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | For molecular biology, ≥70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder | |
Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich | T9285 | 100 x, for molecular biology |