Summary
Denne protokol demonstrerer mikroskopi-guidet isolering og immunofluorescensfarvning af murin lungevener. Vi forbereder vævsprøver, der indeholder venstre atrium, lungevener og de tilsvarende lunger og pletter dem for hjerte-Troponin T og Connexin 43.
Abstract
Lungevener (PV'er) er den største kilde til ektopiske slag i atriale arytmier og spiller en afgørende rolle i udviklingen og progressionen af atrieflimren (AF). PV'er indeholder myokardieærmer (MS) sammensat af kardiomyocytter. MS er impliceret i initiering og vedligeholdelse af AF, da de bevarer ligheder med det hjertearbejdende myokardium, herunder evnen til at generere ektopiske elektriske impulser. Gnavere er meget udbredt og kan repræsentere fremragende dyremodeller til at studere lungevenens myokardium, da kardiomyocytter er bredt til stede over hele karvæggen. Imidlertid er præcis mikrodissektion og fremstilling af murin PV'er udfordrende på grund af den lille organstørrelse og indviklede anatomi.
Vi demonstrerer en mikroskopi-guidet mikrodissektionsprotokol til isolering af murin venstre atrium (LA) sammen med PV'erne. Immunofluorescensfarvning ved hjælp af hjerte-Troponin-T (cTNT) og connexin 43 (Cx43) antistoffer udføres for at visualisere LA og PV'er i fuld længde. Billeddannelse ved 10x og 40x forstørrelse giver et omfattende overblik over PV-strukturen samt detaljeret indsigt i myokardiearkitekturen, især fremhæver tilstedeværelsen af connexin 43 inden for MS.
Introduction
Atrieflimren (AF) er den mest almindelige vedvarende arytmi1. Forekomsten af AF stiger yderligere med et forventet antal ~ 17.9 millioner patienter i Europa i 20601. AF er klinisk meget vigtigt, da det er en væsentlig risikofaktor for udvikling af myokardieinfarkt, hjertesvigt eller slagtilfælde, hvilket resulterer i en enorm individuel, social og socioøkonomisk byrde1. Selvom AF har været kendt i årtier, er patofysiologien af AF stadig ikke fuldt ud forstået2.
Allerede i slutningen af 1990'erne viste undersøgelser den store virkning af lungevener (PV'er) i initiering og vedligeholdelse af AF, da de er den vigtigste kilde til AF-udløsende ektopiske slag3. Det er blevet påvist, at PV'er strukturelt adskiller sig fra andre blodkar. Mens typiske blodkar indeholder glatte muskelceller, indeholder tunikamediet af PV'er også kardiomyocytter4. Hos gnavere er denne hjertemuskulatur allestedsnærværende til stede i hele PV'erne, herunder intra- og ekstrapulmonale dele samt åbningsområdet5. Hos mennesker indeholder PV'er også kardiomyocytter, som kan observeres inden for forlængelser af venstre atriale (LA) myokardium-såkaldte myokardiehylstre (MS)6,7.
MS har morfologiske ligheder med atriel myokardium8. Formen og størrelsen af atriale og PV-kardiomyocytter varierer ikke signifikant mellem hinanden og viser sammenlignelige elektrofysiologiske egenskaber8. Elektrofysiologiske optagelser inden for PV har bevist den elektriske aktivitet af MS, og angiografisk billeddannelse har afsløret sammentrækninger synkroniseret med hjerteslag 9,10.
Gap junctions er poredannende proteinkomplekser sammensat af seks connexin underenheder, som tillader passage af ioner og små molekyler11. Gap-kryds findes i celle-til-celle-appositionerne, forbinder nabokardiomyocytter og muliggør en intercellulær elektrisk kobling mellem kardiomyocytter12,13. Flere connexin isoformer udtrykkes i hjertet med connexin 43 (Cx43) er den mest almindelige isoform udtrykt i alle regioner af hjertet14. Tidligere undersøgelser giver bevis for ekspression af Cx43 i kardiomyocytter af PV'erne15,16.
Det er fortsat udfordrende at undersøge MS inden for intakte solceller på grund af deres sarte struktur, især i små dyremodeller. Her demonstrerer vi, hvordan man identificerer og isolerer solceller sammen med LA og lungelapper i mus ved hjælp af mikroskopi-guidet mikrodissektion. Derudover demonstrerer vi immunofluorescens (IF) farvning af PV'er for at visualisere kardiomyocytter og deres sammenkoblinger inden for PV'erne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrepleje og alle eksperimentelle procedurer blev udført efter retningslinjerne fra Animal Care and Ethics Committee ved Ludwig-Maximilians-University of Munich, og alle procedurer med mus blev godkendt af Regierung von Oberbayern (ROB 55.2-2532. Vet_02-20-215, ROB 55,2-2532. Vet_02-18-46, ROB 55.2-2532. Vet_02-19-86, ROB 55,2-2532. Vet_02-21-178, ROB 55,2-2532. Vet_02-22-170). C57BL6/N-mus blev fremstillet kommercielt.
1. Forberedelse
- Forbered en 3% agarosegel ved at blande 3 mg agarose og 100 ml 1x Tris-bufret saltvand i en 500 ml Erlenmeyerkolbe. Opvarm opløsningen i en mikrobølgeovn ved 600 W i 2-3 minutter, indtil gelen bliver homogen.
- Forbered dissektionsskålen ved forsigtigt at hælde gelen i en petriskål med en diameter på 100 mm. Fyld petriskålen halvt med gel. Ryd bobler fra gelen for at sikre en homogen konsistens. Lad dissektionsskålen køle af, indtil gelen bliver fast.
- Forbered alle de nødvendige buffere og opløsninger, herunder fikseringsopløsning, permeabiliseringsopløsning, blokeringsbuffer og vaskebuffer i henhold til opskrifterne i tabel 1.
2. Organhøst og vævsforberedelse
BEMÆRK: En omfattende protokol, der beskriver proceduren for musebedøvelse og høst af hjertet, er tidligere blevet offentliggjort17,18. Således præsenterer vi kun en kort beskrivelse af denne del. Eksperimenter blev udført på 12 til 16 uger gamle C57BL6 mus (seks han, fire hun). Hanens kropsvægt strakte sig fra 26 g til 28 g og kvindens kropsvægt fra 19 g til 22 g. Følgende trin blev udført uden forudgående systemisk heparininjektion.
- Bedøv musen med isofluran (5%, 95% ilt, flow: 1 l / min) og sørg for tilstrækkelig anæstesidybde.
- Overfør musen til operationsbordet, og placer den i liggende stilling. Vedligehold narkosen med isofluranindånding (2%, 98% ilt, flow: 1 l / min) gennem en anæstesimaske og fastgør musen med tape i ekstremiteterne. Injicer fentanyl til analgesi (0,1 mg/25 g legemsvægt i.p.).
- Løft pelsen ved xiphoidal processen og sæt et tværgående 2 mm snit. Afbryd pelsen fra den subkutane fascia ved hjælp af stump dissektion (bagsiden af saksen) og forlæng snittet kranielt og lateralt for at udsætte brystkassen.
- Åbn forsigtigt maven kaudal til kystbuen. Løft den xiphoidale proces lidt for at skære membranen fra kaudale og få lungerne til at kollapse. Skær derefter membranen fra venstre mod højre uden at skade nogen organer og åbn brystkassen bilateralt for at udsætte hjertet.
- Skær den ringere vena cava (IVC), mens hjertet stadig slår for at ekssanguinere musen og fortsæt med at perfusere hjertet ved at trænge ind i venstre ventrikel med en 27 G nål og injicere 10 ml iskold 1x fosfatbufret saltvand (PBS).
- Efter at have ryddet blodet fra musens hjerte, skal du finde aortabuen, overlegen vena cava (SVC) og luftrøret. Skær dem ~ 3 mm over hjertebasen og høst hjertet sammen med de tilsluttede lunger.
- Nedsænk de høstede organer i et 10 ml konisk rør indeholdende 2 ml steriliseret 30% saccharoseopløsning. Prøverne dehydreres i 24 timer ved 4 °C.
3. Mikroskopi-guidet forberedelse af LA og PV'er
- Placer det dehydrerede hjerte og lunger i en dissektionsskål indeholdende 40-50 ml 1x PBS. Sæt det under et lyst feltmikroskop med 10x forstørrelse og opsæt belysningen. Placer hjertet med sin dorsale overflade på dissektionsskålen. Identificer overgangen mellem ventrikulær og atriel væg, og adskil forsigtigt ventriklerne fra atrierne ved hjælp af kirurgisk saks.
BEMÆRK: Skær ca. 1 mm ringere end atrierne for at holde noget ventrikulært væv. Dette vil være nødvendigt senere for at fastgøre atrierne til dissektionsskålen uden at beskadige strukturer ved hjertebasen. Vi foreslår at holde ventriklerne, da de kan bruges som en positiv kontrolprøve. For at indlejre ventrikelvævet skal du følge den samme procedure, der er beskrevet for indlejring af PV'erne, som beskrevet i afsnit 4. - Den adskilte atria anbringes med ventrikelskærefladen (trin 3.1) på dissektionsskålen, så hjertebasen vender opad. Orienter atrierne, så lungelapperne er bageste, LA og venstre atriale vedhæng (LAA) er til højre, og højre atrium (RA) og højre atriale vedhæng (RAA) er til venstre. Fastgør præparatet ved at fastgøre det resterende venstre ventrikulære væv til dissektionsskålen. Spred forsigtigt lungelapperne ud uden at anvende overdreven kraft og fastgør dem til dissektionsskålen (figur 1A).
- Få et overblik over de anatomiske landemærker i hjertebasen.
- Find aorta med aortabuen i midten af hjertebasen.
- Registrer lungestammen (PT) direkte til højre for aorta og følg dens kurs mod den bageste for at skelne lungearterierne (PA'er). Kontroller deres placering ved at følge deres kurs op til venstre lap og højre overordnede / midterste lobes for at finde den tilsvarende lungehilum (LH).
- Placeringen af luftrøret og/eller venstre og højre hovedbronchi (L Br, R Br), som er placeret bagved aorta, bestemmes, og deres placering kontrolleres ved at følge deres kurs mod LH (figur 1A).
- Find SVC til venstre for aorta og kontroller ved at følge dens kurs ind i RA ved siden af RAA.
- Fjern bindevæv og fedtvæv omkring hjertebasen, samtidig med at du bevarer alle de identificerede landemærker, der er nævnt ovenfor. Fjern desuden aortabuen og luftrøret for at få frit udsyn til hjertebasen (figur 1B).
- Adskil forsigtigt PA'erne fra atriumets øvre overflade ved stump dissektion med fine pincet. Skær dem derefter af ved LH og vend dem til siden for at afsløre den venstre atriale frie væg (LAFW) og PV'erne i deres fulde dimension. Afskær hovedbronkierne fra LH og fjern bronkierne (figur 1C).
BEMÆRK: LH fungerer både som det fælles indgangspunkt for PA'er og luftveje ind i lungerne samt udgangspunktet for PV'erne. Det er vigtigt at udføre alle procedurer på LH omhyggeligt for at undgå skader på PV'erne. - For at adskille LA / RA og venstre og højre ventrikel (LV, RV) skal du udføre et snit, der starter fra den forreste del af den resterende RV opad gennem tricuspidventilen (TV) indtil den forreste side af SVC for at åbne RA fra frontsiden. Skær den bageste RA-fri væg (RAFW) ved siden af den interatriale septum for at adskille RA og LA. Skær den bageste højre ventrikulære væg ved siden af det interventrikulære septum for fuldstændigt at adskille LV og RV.
BEMÆRK: En omfattende protokol, der beskriver proceduren for forberedelse og isolering af højre atrium i detaljer, er tidligere blevet offentliggjort19. Adskillelsen af RA er nyttig til at fjerne uønsket væv fra LA-PV-vævskomplekset og til at indsamle væv til yderligere eksperimenter. - Reducer størrelsen på lungelapperne ved at skære noget af basallungevævet af, så ca. 3-4 mm lungevæv er tilbage.
BEMÆRK: Bevar lungelappernes apices, da de tjener som flåd under de efterfølgende indlejringstrin, og tillad indlejring af PV'erne vandret i OCT-forbindelsen.
4. Indlejring af væv
- Overfør præparatet, herunder LA og PV'er, til en cryomold, og sørg for, at hjertebasen og lungetoppen vender opad. Arranger dem i en fysiologisk konfiguration - sørg for, at PV'erne ikke er snoet eller vendt.
- Fyld cryomold med O.C.T-forbindelse, og komprimer forsigtigt PV'erne med fine pincet for at fjerne eventuel resterende luft. Oprethold deres fysiologiske konfiguration uændret gennem hele processen.
- Sæt kryomolen med det indlejrede væv på tøris for at fryse O.C.T.-forbindelsen. Prøverne opbevares ved -80 °C til senere brug.
BEMÆRK: Det er afgørende at holde PV'erne i vandret position for at sikre opnåelse af sektioner, der indeholder PV'er i fuld længde til efterfølgende procedurer.
5. Opskæring og opsamling af frosne vævssektioner
BEMÆRK: For at skære vævsblokkene blev maskinindstillingerne justeret til en prøvetemperatur på -18 °C og bladtemperatur på -25 °C.
- Der anbringes en vævsblok på prøveholderen ved at påføre et lag O.C.T.-forbindelse mellem vævsblokken og prøveholderen. Frys dem i 3-4 min.
- Prøvehovedet blokeres, og prøveholderen fyldes med vævsblokken på prøvehovedet ved at lukke udløserhåndtaget til prøvepatronen. Finjuster vævsblokkens position ved hjælp af finjusteringsknapperne.
- Fjern cryomold fra prøven. Fjern blokeringen af prøvehovedet og kryostatens elektriske bremse.
- Indstil kryostaten til trimtilstand med en trimstørrelse mellem 30 μm og 50 μm. Trim vævsprøven, indtil PV'erne bliver synlige.
- Skift til finsnitskæringstilstand , og indstil tykkelsen til 10 μm. Begynd at indsamle sektioner, herunder PV'er og tilsluttet lunge- og atrievæv. Saml sektioner ved hjælp af en krængningsplade eller ved at fastgøre den frie ende af hver sektion til knivholderen med en fin kold børste og spred dem ud.
- Placer et objektglas (holdes ved stuetemperatur) ved siden af sektionen. Slip forsigtigt sektionen fra børsten, så sektionen naturligt klæber til diaset, da den frosne sektion og OCT-forbindelsen smelter, når den rører ved den varmere glideoverflade.
BEMÆRK: Oprethold en stabil og skånsom tilstand under sektionsprocessen for at forhindre brud eller folder i sektionerne. Udskift bladet med et nyt blad, hvis det er nødvendigt. - Saml op til tre sektioner på hvert dias. Mærk diasene og opbevar dem ved -20 °C.
BEMÆRK: Vi anbefaler at indsamle mindst fem sektioner (svarende til to dias) for hver PV.
6. Immunofluorescensfarvning af kryosektioner fra PV'erne
- Arranger de frosne dias på et farvningssystem, og lad sektionerne tø op i ca. 20 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Fyld farvningssystemet med vand for at holde prøverne befugtede. Tørring af vævet kan beskadige antigener, hvilket forårsager ikke-specifik antistofbinding og overfarvning af artefakter under farvningsprocedurerne. - Efter 20 minutters optøning dækkes sektionerne med et par dråber fikseringsopløsning (4% paraformaldehyd [PFA], tabel 1) for at fastgøre vævet på diasene i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Efter fiksering overføres diasene til det lodrette diasstativ og nedsænkes i en beholder fyldt med 1x PBS. Placer beholderen på en ryster ved lav hastighed og vask diasene i 5 min. Gentag denne vaskecyklus to gange mere, idet du bruger frisk 1x PBS hver gang.
- Efter vask sættes der en cirkel om hver enkelt sektion på hvert objektglas med en xylolholdig væskeblokkerpen. Omarranger diasene på farvningssystemet, og påfør 1 eller 2 dråber permeabiliseringsopløsning (0,1% Triton X-100, tabel 1) på hver prøve med en Pasteur-pipette. Lad sektionerne inkubere ved stuetemperatur i 10 minutter for at permeabilisere celle- og celleorganelmembranerne.
- Efter permeabilisering fjernes 0,1 % Triton X-100-opløsningen ved at vaske objektglassene i 3 x 5 minutter i 1x PBS efter samme fremgangsmåde som beskrevet i trin 6.3.
- Efter vask skal du omarrangere diasene på farvningssystemet og påføre 1 eller 2 dråber blokeringsbuffer (tabel 1) på hver sektion, og sørg for, at de er helt dækket af blokeringsbufferen. Lad objektglassene inkubere i 1 time ved stuetemperatur.
- Forbered 1 ml af den primære antistofblanding ved pipettering af 5 μL af et museanti-cTNT-antistof (fortyndet 1:200) og 1 μL af et kaninanti-Cx43-antistof (fortyndet 1:1.000) i et 1,5 ml mikrocentrifugeglas fyldt med 994 μL blokerende buffer. Pipetter blandingen op og ned for at sikre grundig blanding.
BEMÆRK: Juster mængden af anvendt antistofblanding i henhold til sektionens størrelse. Sørg for, at sektionerne er fuldt dækket af antistofblandingen. Antistoffernes koncentration, inkubationstid og optimale inkubationstemperatur kan variere afhængigt af faktorer som antistoftype, antistofkloner og vævsegenskaber. Vi anbefaler at teste og optimere farvningsforholdene individuelt for hvert antistof. - Efter blokeringstrinnet (trin 6.6) fjernes den resterende blokeringsbuffer, og 2 eller 3 dråber af den primære antistofblanding påføres direkte på hver sektion. Lad objektglassene inkubere natten over ved 4 °C.
- Efter den primære antistofinkubation vaskes objektglassene i 3 x 5 minutter med vaskebuffer under forsigtig omrystning (tabel 1).
- Forbered 1 ml af den sekundære antistofblanding ved pipettering af 1 μL af et AF488-konjugeret sekundært gedeantimusantistof (fortyndet 1:1.000) og 1 μL af et AF568-konjugeret sekundært gedeantikaninantistof (fortyndet 1:1.000) i et 1,5 ml mikrocentrifugerør fyldt med 998 μL vaskebuffer. Pipette blandingen op og ned for at blande godt.
- Efter vasketrinnet (trin 6.9) omarrangeres objektglassene i farvningssystemet og påføres 2 eller 3 dråber af den sekundære antistofblanding på hver sektion med en pipette. Lad antistofferne inkubere i 45 minutter ved stuetemperatur, mens prøverne beskyttes mod lys for at forhindre fluorofordæmpning. Efter den sekundære antistofinkubation vaskes objektglassene i 3 x 5 minutter med vaskebuffer under forsigtig omrystning (tabel 1).
- Omarranger diasene på farvningssystemet. Sektionerne befordres med Hoechst-33342 (i en fortynding på 1:1.000 i 1x PBS) ved at påføre 2 til 3 dråber Hoechst-33342-opløsning på hver sektion. Lad diasene inkubere i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Efter inkubationen vaskes diasene 3 x 5 min med Vaskebuffer under forsigtig omrystning (tabel 1). Monter lysbillederne ved at påføre 1 eller 2 dråber fluorescerende monteringsmedium på hvert dias. Dæk diasene med dæksedler.
BEMÆRK: Sørg for, at dækslet er fladt, når du placerer det. Hvis der er luftbobler til stede, skal du forsigtigt trykke på siden af boblen for at fjerne dem. - Opbevar de monterede lysbilleder i en lysbilledsparer ved 4 °C.
BEMÆRK: Det anbefales at tage billeder af diasene så tidligt som muligt. Denne protokol gælder ikke udelukkende for de nævnte antistoffer. Målantigener og antistoffer kan erstattes eller modificeres i henhold til kravene til individuelle forsøg eller alternative antigendetektionsstrategier.
7. Billeddannelse af immunofluorescensfarvningsskiverne
- Indstil mikroskopet.
- Start mikroskopet med laserlyskilden, den tilsluttede computer og den medfølgende software i henhold til producentens manual.
- Gå ind i menuen Konfiguration . Klik for at vælge den passende kameratype til fluorescensbilleddannelse (f.eks. DFC365FX monokromt kamera).
- Gå ind i menuen Erhverv, og opret tre kanaler.
- Vælg kanal FCr1 til registrering af Hoechst-33342, mærk den, og vælg DAP-filterkuben i valgafsnittet. Indstil eksponeringstiden til 200 ms, den elektroniske forstærkning til 2 og lysintensiteten til 17%.
- Vælg kanal FCr2 til påvisning af cTNT (farvet med AF488-konjugeret antistof), mærk den, og vælg L5-filterkuben i markeringsafsnittet. Indstil eksponeringstiden til 200-300 ms, den elektroniske forstærkning til 1,8 og lysintensiteten til 100%.
- Vælg kanal FCr3 til påvisning af Cx43 (farvet med AF568-konjugeret antistof), mærk den, og vælg TXR-filterkuben i markeringsafsnittet. Indstil eksponeringstiden til 150 ms, den elektroniske forstærkning til 2 og lysintensiteten til 100 %.
BEMÆRK: Filterkubernes spektrale egenskaber er angivet i tabel 2.
- Indlæs diaset på mikroskopstadiet.
- Udfør en oversigtsbilleddannelse ved 10x forstørrelse:
- Vælg målsætningen 10x, og åbn laserlukkeren ved at klikke på Live. Når FCr1-kanalen er valgt, skal du bruge navigatorfunktionen til at navigere gennem diaset, indtil der registreres et signal. Fokuser prøven groft, indtil cellekernerne kan skelnes.
- Start spiralscanningstilstanden for at fange en komplet forhåndsvisning af prøven. Deaktiver live ved at klikke på knappen igen for at beskytte prøven. Identificer LA, PV'er og lungevæv.
- Definer interesseområdet for den efterfølgende flisescanning; Vælg flere fokuspunkter inden for interesseområdet. Klik på Live i FCr1-kanalen , og juster fokus for hvert fokuspunkt. Gem de tilsvarende Z-positioner, som repræsenterer den nøjagtige fokusposition for hvert fokuspunkt. Start flisescanningen ved 10x forstørrelse for at tage et komplet oversigtsbillede af eksemplet.
- Når scanningen er fuldført, skal du åbne flisescanningen og flette de enkelte billeder. For at forbedre lysstyrken og kontrasten for enkelte kanaler skal du vælge dem på objektlinjen og justere deres signalområde med skyderne efter ønske.
- Få zoomede billeder ved 40x forstørrelse:
- Vælg målsætningen 40x. Juster indstillingerne for eksponeringstid og forstærkning for hver kanal som følger: FCr1: DAP-filterkube: eksponeringstid: 50 ms, forstærkning: 1,5; FCr2: L5 filterterning: eksponeringstid: 80 ms, forstærkning: 1,8; FCr3: TXR filter terning: eksponeringstid: 20 ms, forstærkning: 2.
- Brug oversigtsbilledet i trin 7.3 til at finde PV-åbningen (PVO) samt ekstrapulmonale og intrapulmonale PV-regioner (PVex, PVin). Definer dette område, der skal scannes.
- Åbn undermenuen Billede , og klik på z for at aktivere Z-Stack.
- Vælg FCr1-kanalen , og åbn laserlukkeren for at få en direkte forhåndsvisning.
- Gå til undermenuen Z-Stack, og bestem Z-Stack-start- og slutpunkterne ved at drejefocus-finjusteringsknappen med uret og mod uret, indtil det samlede signal begynder at miste fokus.
- Når du har konfigureret fokusområdet, skal du vælge tilstanden Systemoptimeret Z-Stack og aktivere indstillingen Beregn udvidede dybdeskarphedsbilleder (EDF). Afhængigt af hvor fladt vævet er, skal du forvente ca. 20 lag med et trininterval på ca. 0,5 μm.
- Start flisescanningen. Efter scanning skal du åbne flisescanningen og kun flette EDF-billedet. Hvis du vil forbedre lysstyrken og kontrasten for enkelte kanaler, skal du vælge dem på objektlinjen og justere deres signalområde med skyderne efter ønske (se trin 7.3.4).
- Når du har genereret billederne, skal du gemme projektet og eksportere både den flettede version og de rå kanaler for hvert billede som en TIFF-fil.
BEMÆRK: Hvis du gemmer filerne som ImageJ-læsbar TIFF, kan ImageJ importere den oprindelige flisestørrelse i μm i stedet for pixel. Luk altid laserlukkeren, når et lasersignal ikke er nødvendigt for at forhindre fotoblegning af de sekundære antistoffer.
8. Billedredigering med ImageJ
- Indlæs de tilsvarende rå kanalfiler i ImageJ. Klik på Billede | Farve | Flet og vælg den ønskede farve for hver kanal.
- Opret en skalalinje ved at vælge Analysér | Værktøjer | Skalabjælke og indsæt den i nederste højre hjørne. Fortsæt med yderligere behandling og analyse i henhold til billedkravene. Gem de flettede billeder, når du er færdig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi udførte mikrodissektion, farvning og billeddannelse af PV'erne i 10 12-16 uger gamle mus. Efter protokollen mikrodissekerede vi med succes PV'er sammen med LA i alle eksperimentelle mus og opnåede sektioner med et omfattende overblik over PV'erne i otte mus. Oversigtsbilleder blev taget ved 10x forstørrelse for at identificere PV-åbningsområdet (PVO) ved LA-PV-krydset, de ekstrapulmonale PV'er (PVex) (PV'er mellem lungehilum og LA-PV-krydset) og de intrapulmonale PV'er (PVin) (PV'er omgivet af lungevæv) (figur 2). Zoomede billeder af de nævnte regioner blev opnået med et 40x forstørrelsesmål (figur 3).
Vi fandt specifikke cTNT-signaler med en typisk muskelstriation i PVO, PVex og PVi (figur 3). Cx43 blev fundet i alle tre PV-regioner og blev for det meste projiceret mellem nærliggende kardiomyocytter (figur 3 og figur 4A). Cx43-relaterede signaler blev observeret på både den polære side (figur 3, gule pile) og den laterale side af kardiomyocytterne i MS (figur 3, røde pile).
Figur 1: Identifikation af murin lungevener under mikroskopet. Brightfield mikroskopi (10x forstørrelse). Hjertet er fastgjort til dissektionsskålen med fire stifter ved atriumet, venstre lungelap, højre midterste lungelap og højre ringere lungelap. (A) Oversigt over hjertebasen efter adskillelse af ventrikelvævet fra atriummet med aortabuen i midten. Atriet er placeret i bunden; Lungelapperne er spredt ud i den øverste halvdel af billedet. PV'er er skjult af AA, de vigtigste bronchi og PA'erne. (B) Topbillede af hjertebasen efter fjernelse af luftrør, dele af hovedbronkierne, aortabuen samt bindevæv og fedtvæv. PA'erne i midten af billedet viser deres fulde forløb fra PT til LH og dækker PV'erne. (C) Topbillede af PV'erne efter at have skåret PA'erne fra lungelapperne og fjernet det ekstrapulmonale bronchiale væv. Skalastænger = 5 mm. Forkortelser: AA = aortabuen; AscA = stigende aorta; IVC = ringere vena cava; L Br = venstre hovedbronchus; L PV = venstre lungevene; LA-PV J = venstre atrium-lungevene kryds; LAA = venstre atriale vedhæng; LAFW = venstre atriel fri væg; LH = lungehilum; L. LL = venstre lungelap; PA'er = lungearterier; PT = lungestamme; R Br = højre hovedbronchus; R PV = højre lungevene; R-A PV = højre stigende lungevene; RAA = højre atriale vedhæng; R. acc. LL = højre tilbehør lungelap; R. inf. LL = højre ringere lungelap; R. mid. LL = højre midterste lungelap; R. sup. LL = højre overlegen lungelap; SVC = overlegen vena cava. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Oversigt over de voksne muselungevener og venstre atrium i et tværgående snitbillede ved immunofluorescensmikroskopi. Cellekerner blev farvet med Hoechst-33342 (blå); kardiomyocytter blev mærket med anti-cTNT-antistof (hvidt); og mellemrumskryds blev detekteret ved hjælp af anti-Cx43-antistof (grøn). De hvide rektangler fremhæver følgende regioner: a, PV-åbning (PVO); b, ekstrapulmonal PV (PV ex); og c, intrapulmonal PV (PVi). Skalastang = 500 μm. Forkortelser: L PV = venstre lungevene; LAA = venstre atriale vedhæng; LAFW = venstre atriel fri væg; LV-EP = venstre ventrikel - udstødningsvej; R PV = højre lungevene; R-A PV = højre stigende lungevene; RV = Højre ventrikel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Zoomet ind af det højre PV myokardium ved hjælp af immunofluorescensmikroskopi. Cellekerner blev farvet med Hoechst-33342 (blå); kardiomyocytter blev mærket med anti-cTNT-antistof (hvidt); og Cx43+ mellemrumskryds blev detekteret af anti-Cx43-antistof (grøn). (A) EDF-flisescanninger, der viser et langsgående snit gennem højre ekstrapulmonale PV. LA- og PV-åbningen er ikke vist på billedet og ville være placeret til venstre, mens intrapulmonal PV og tilsvarende lungeparenchyma (heller ikke vist) ville være placeret til højre. (B,C) EDF enkelt flise scanninger af højre ekstrapulmonale PV. Pile fremhæver Cx43+ mellemrumskryds ved kardiomyocytternes cellulære grænser. De gule pile angiver mellemrumskryds på de polære sider af kardiomyocytter, colokaliseret med interkalerede diske, mens de røde pile angiver mellemrumskryds på den laterale side af kardiomyocytter. Skalastænger = 50 μm (A), 20 μm (B,C). Forkortelser: PV = lungevene; EUF = udvidet dybdeskarphed LA = venstre atrium. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Immunofluorescensfarvning af kontrolvæv. (A) Positiv kontrolfarvning af murine LV. Cellekernerne blev farvet med Hoechst 33342 (blå); kardiomyocytter blev mærket med anti-cTNT-antistof (hvidt); og Cx43+ mellemrumskryds blev detekteret med anti-Cx43-antistof (grøn). (B) Negativ kontrolfarvning af højre ekstrapulmonale PV udelukkende ved anvendelse af sekundære antistoffer. Cellekernerne farves med Hoechst 33342 (blå). Skalastænger = 20 μm (A), 50 μm (B). Forkortelser: LV = venstre ventrikel; PV = lungevene. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Filter-terning | Excitation Filter | Emissionsfilter |
| DAP | 350 / 50 | 460 / 50 |
| L5 | 480 / 40 | 527 / 30 |
| TXR | 560 / 40 | 630 / 75 |
Tabel 1: Excitations- og emissionsfilteregenskaber for Leica DM6 B-filterkuberne.
| Forbindelse | Endelig koncentration | g eller ml / 100 ml kræves |
| Fastgørelse løsning | ||
| Paraformaldehyd (PFA) 16% | 4% | 25 ml |
| Fosfatbufret saltvand (PBS) 1x koncentreret | 75 ml | |
| Permeabiliseringsopløsning | ||
| Triton X-100 | 0.1% | 0,1 ml |
| Fosfatbufret saltvand (PBS) 1x koncentreret | 99,9 ml | |
| Blokering af buffer | ||
| Normal går serum (NGS) | 10% | 10 ml |
| Bovin serumalbumin (BSA) | 0.5% | 0,5 mg |
| Mellem 20 | 0.1% | 0,1 ml |
| Fosfatbufret saltvand (PBS) 1x koncentreret | 89,9 ml | |
| Vaskebuffer | ||
| Bovin serumalbumin (BSA) | 0.5% | 0,5 mg |
| Mellem 20 | 0,1 ml | |
| Fosfatbufret saltvand (PBS) 1x koncentreret | 99,9 ml | |
Tabel 2: Bufferopskrifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med denne protokol deler vi en metode til at skelne og isolere solcellerne i musehjertet og udføre immunfluorescensfarvning på dem. Efter organhøsten blev hjertet og lungerne dehydreret i steriliseret saccharoseopløsning, efterfulgt af adskillelse af ventriklerne fra atrium og lungelobes under mikroskopisk vejledning. Bagefter var hjertebasen parat til at visualisere PV'erne efterfulgt af at skære dem fra lungerne ved hilum. Den efterfølgende immunofluorescensfarvning blev udført ved hjælp af en kryoteknik ved at indlejre vævet i OCT-forbindelse, skære det med et kryotome og udføre immunofluorescensfarvning for cTNT og Cx43.
Isolering af PV'erne kan være nyttigt til at studere deres rolle i arytmogenesen af AF. Imidlertid er PV-isolering hos mus udfordrende. Ud over deres lille størrelse er PV'er skjult bag hovedbronkierne og de fremtrædende kar i hjertebasen, hvilket indvikler deres påvisning massivt. Denne protokol giver en enkel og gennemsigtig måde at undersøge murine PV'er og tillader en økonomisk tilgang til at studere deres morfologiske egenskaber i detaljer. Den foreslåede høst- og forberedelsesmetode bevarer de anatomiske relationer mellem PV'er, de tilsvarende lungelapper og LA, hvilket letter undersøgelser af hele LA-PV-vævskomplekset.
MS har et heterogent arrangement. Signifikant variation i kontinuitet og fiberorientering er blevet beskrevet i flere arter, herunder rotter og mennesker, og findes for det meste omkring PV-åbningerne 4,20. Disse forskelle resulterer i anisotrop elektrisk ledning og kan fremkalde initiering af reentry-excitationer og autonom aktivitet i PV'er21. Desuden kan den elektriske sammenkobling mellem MS og atriel myokardium ved LA-PV-krydset føre til overgangen af desynkroniserede elektriske impulser fra PV'erne til venstre atrium, hvilket resulterer iAF2. Bevarelse af de morfologiske proportioner ved LA-PV-krydset er derfor afgørende for at studere interaktionen mellem atriale myokardiet og PV'er. For at opnå dette er en nøjagtig identifikation af de vigtigste bronkier og PA'er afgørende. Vi identificerede landemærkerne i henhold til deres anatomiske positioner og relationer ved hjælp af et mikroskop med 10x forstørrelse og ved systematisk at følge deres forløb fra hjertebasen til LH.
Vi udførte IF-farvning af murine PV'er. Farvningsmetoder baseret på immunoreaktive farvestoffer er bredt etableret i forskellige arter og tillader direkte påvisning af målantigener, hvilket giver visuel kontrast af høj kvalitet i mikroskopi. Denne tilgang muliggør både kvalitativ og kvantitativ karakterisering af intakte vævsskiver på proteinniveau. Vi bruger hjerteisotypen TNT til at skelne mellem myokardium og ikke-hjertemuskulatur. Tilstedeværelsen af kardiomyocytter i PV'er såvel som SVC og IVC er blevet beskrevet tidligere7. Imidlertid indeholder andre rørformede strukturer i lungerne, herunder PA'er, bronchi og private lungekar, ikke hjertemuskelceller, hvilket gør dem lette at skelne ved IF-farvning7. Ved mærkning af strukturproteiner som cTNT viser kardiomyocytter deres karakteristiske tværstriation afhængigt af deres orientering mod strålebanen. Striationens retning kan kortlægges i ImageJ med plugins som OrientationJ eller Directionality Plugin. Dette hjælper med at kvantificere og karakterisere retningen af kardiomyocytter og kan være nyttigt til at identificere regioner med anisotrop elektrisk ledning. Desuden understøtter denne undersøgelse tidligere resultater vedrørende den rigelige tilstedeværelse af Cx43 i murine PV myokardiet, som er organiseret på samme måde som i LV (figur 4A)15,16. Bemærkelsesværdigt observerede vi mellemrumskryds ved kardiomyocytternes laterale membran i murinPV'er. Denne tilstand, kendt som lateralisering, er blevet påvist som en patofysiologisk mekanisme i AF, især hos hanmus22. Således fremhæver denne protokol potentialet for lignende undersøgelser i MS kardiomyocytter hos mus.
PV-isolering er en vigtig teknik til arytmiforskning, da det tillader en række undersøgelser, herunder IF-farvning, flowcytometri, fluorescensaktiveret cellesortering, optisk kortlægning og patchklemme. Men da den nuværende protokol blev etableret for IF-billeddannelse af fast og indlejret væv, mangler der i øjeblikket direkte bevis for, at kardiomyocytter kan isoleres fra PV-præparater i tilstrækkelig kvalitet til at muliggøre eksperimenter såsom patch clamp. Mikrodissektionens succes afhænger af forskerens erfaring på grund af den lille størrelse og skrøbelighed i murine hjertevæv. Kvaliteten af IF-billeddannelse afhænger også i høj grad af indlejringstrinnet. Horisontale arrangementer er vanskelige at opnå, sektionernes vævsintegritet kan lide, og PV'er kan briste, hvis de ikke er fyldt med OCT-forbindelse. Desuden er protokollens gyldighed begrænset til 2D-billeddannelse, da metoden ikke tillader 3D-rekonstruktion af PV'erne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af det tyske center for kardiovaskulær forskning (DZHK; 81X3600221til H.V., 81X2600255 til S.C.), China Scholarship Council (CSC201808130158 til R.X.), den tyske forskningsfond (DFG; Klinikerforskerprogram i vaskulær medicin (PRIME), MA 2186/14-1 til P. T.) og Corona Foundation (S199/10079/2019 til S. C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
References
- Lippi, G., Sanchis-Gomar, F., Cervellin, G. Global epidemiology of atrial fibrillation: An increasing epidemic and public health challenge. International Journal of Stroke. 16 (2), 217-221 (2021).
- Wijesurendra, R. S., Casadei, B.
- Haïssaguerre, M., et al. Spontaneous initiation of atrial fibrillation by ectopic beats originating in the pulmonary veins. The New England Journal of Medicine. 339 (10), 659-666 (1998).
- Mueller-Hoecker, J., et al. Of rodents and humans: a light microscopic and ultrastructural study on cardiomyocytes in pulmonary veins. International Journal of Medical Sciences. 5 (3), 152-158 (2008).
- Kramer, A. W., Marks, L. S. The occurrence of cardiac muscle in the pulmonary veins of Rodenita. Journal of Morphology. 117 (2), 135-149 (1965).
- Nathan, H., Eliakim, M. The junction between the left atrium and the pulmonary veins. Circulation. 34 (3), 412-422 (1966).
- Nathan, H., Gloobe, H. Myocardial atrio-venous junctions and extensions (sleeves) over the pulmonary and caval veins: Anatomical observations in various mammals. Thorax. 25 (3), 317-324 (1970).
- Bond, R. C., Choisy, S. C., Bryant, S. M., Hancox, J. C., James, A. F. Ion currents, action potentials, and noradrenergic responses in rat pulmonary vein and left atrial cardiomyocytes. Physiological Reports. 8 (9), 14432 (2020).
- Thiagalingam, A., et al. Pulmonary vein contraction: Characterization of dynamic changes in pulmonary vein morphology using multiphase multislice computed tomography scanning. Heart Rhythm. 5 (12), 1645-1650 (2008).
- Spach, M. S., Barr, R. C., Jewett, P. H. Spread of excitation from the atrium into thoracic veins in human beings and dogs. The American Journal of Cardiology. 30 (8), 844-854 (1972).
- Scott McNutt, N., Weinstein, R. S. Membrane ultrastructure at mammalian intercellular junctions. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 26, 45-101 (1973).
- Barr, L., Dewey, M. M., Berger, W. Propagation of action potentials and the structure of the nexus in cardiac muscle. Journal of General Physiology. 48 (5), 797-823 (1965).
- Kawamura, K., Konishi, T. Ultrastructure of the cell junction of heart muscle with special reference to its functional significance in excitation conduction and to the concept of "disease of intercalated disc". Japanese Circulation Journal. 31 (11), 1533-1543 (1967).
- Van Kempen, M. J., Fromaget, C., Gros, D., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Spatial distribution of connexin43, the major cardiac gap junction protein, in the developing and adult rat heart. Circulation Research. 68 (6), 1638-1651 (1991).
- Verheule, S. Tissue structure and connexin expression of canine pulmonary veins. Cardiovascular Research. 55 (4), 727-738 (2002).
- Xiao, Y., et al. Expression of connexin 43, ion channels and Ca2+-handling proteins in rat pulmonary vein cardiomyocytes. Experimental and Therapeutic Medicine. 12 (5), 3233-3241 (2016).
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), (2020).
- Tomsits, P., et al. Medetomidine/midazolam/fentanyl narcosis alters cardiac autonomic tone leading to conduction disorders and arrhythmias in mice. Lab Animal. 52 (4), 85-92 (2023).
- Xia, R., et al. Isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node. Journal of Visualized Experiments. (171), (2021).
- Bredeloux, P., Pasqualin, C., Bordy, R., Maupoil, V., Findlay, I. Automatic activity arising in cardiac muscle sleeves of the pulmonary vein. Biomolecules. 12 (1), 23 (2021).
- Chen, P. S., et al.
- Thibault, S., Ton, A. -T., Huynh, F., Fiset, C. Connexin lateralization contributes to male susceptibility to atrial fibrillation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (18), 10696 (2022).
