Summary
Ce protocole démontre l’isolement guidé par microscopie et la coloration par immunofluorescence des veines pulmonaires murines. Nous préparons des échantillons de tissus contenant l’oreillette gauche, les veines pulmonaires et les poumons correspondants et les colorons pour la troponine T cardiaque et la connexine 43.
Abstract
Les veines pulmonaires (PV) sont la principale source de battements ectopiques dans les arythmies auriculaires et jouent un rôle crucial dans le développement et la progression de la fibrillation auriculaire (FA). Les PV contiennent des manchons myocardiques (MS) composés de cardiomyocytes. Les SEP sont impliquées dans l’initiation et le maintien de la FA, car elles préservent les similitudes avec le myocarde cardiaque, y compris la capacité de générer des impulsions électriques ectopiques. Les rongeurs sont largement utilisés et peuvent représenter d’excellents modèles animaux pour étudier le myocarde de la veine pulmonaire puisque les cardiomyocytes sont largement présents sur toute la paroi des vaisseaux. Cependant, la microdissection et la préparation précises des PV murins sont difficiles en raison de la petite taille des organes et de l’anatomie complexe.
Nous démontrons un protocole de microdissection guidée par microscopie pour isoler l’oreillette gauche (LA) murine avec les PVs. Une coloration par immunofluorescence à l’aide d’anticorps cardiaques à base de troponine-T (cTNT) et de connexine 43 (Cx43) est réalisée pour visualiser le LA et les PV dans leur intégralité. L’imagerie à des grossissements de 10x et 40x fournit une vue complète de la structure PV ainsi que des informations détaillées sur l’architecture myocardique, mettant en évidence en particulier la présence de connexine 43 dans la SEP.
Introduction
La fibrillation auriculaire (FA) est l’arythmie soutenue la plus fréquente1. La prévalence de la fibrillation auriculaire augmente encore avec un nombre attendu de ~17,9 millions de patients en Europe en 20601. La fibrillation auriculaire est cliniquement très importante car elle constitue un facteur de risque essentiel pour le développement d’un infarctus du myocarde, d’une insuffisance cardiaque ou d’un accident vasculaire cérébral, entraînant un énorme fardeau individuel, social et socio-économique1. Même si la fibrillation auriculaire est connue depuis des décennies, la physiopathologie de la fibrillation auriculaire n’est pas encore entièrement comprise2.
Déjà à la fin des années 1990, des études ont démontré le grand impact des veines pulmonaires (PV) dans l’initiation et le maintien de la FA, car elles sont la principale source de battements ectopiques déclenchant la FA3. Il a été démontré que les PV diffèrent structurellement des autres vaisseaux sanguins. Alors que les vaisseaux sanguins typiques contiennent des cellules musculaires lisses, la tunique moyenne des PV contient également des cardiomyocytes4. Chez les rongeurs, cette musculature cardiaque est omniprésente dans l’ensemble des PV, y compris les parties intra- et extrapulmonaires, ainsi que dans la région de l’orifice5. Chez l’homme, les PV contiennent également des cardiomyocytes, qui peuvent être observés dans les extensions du myocarde auriculaire gauche (LA), appelées manchons myocardiques (SEP)6,7.
Les SEP présentent des similitudes morphologiques avec le myocarde auriculaire8. La forme et la taille des cardiomyocytes auriculaires et PV ne varient pas significativement entre eux et présentent des propriétés électrophysiologiques comparables8. Des enregistrements électrophysiologiques à l’intérieur du PV ont prouvé l’activité électrique de la SEP, et l’imagerie angiographique a révélé des contractions synchronisées avec le rythme cardiaque 9,10.
Les jonctions lacunaires sont des complexes protéiques formant des pores composés de six sous-unités de connexine, qui permettent le passage d’ions et de petites molécules11. Des jonctions lacunaires existent dans les appositions de cellule à cellule, interconnectent les cardiomyocytes voisins et permettent un couplage électrique intercellulaire entre les cardiomyocytes12,13. Plusieurs isoformes de connexine sont exprimées dans le cœur, la connexine 43 (Cx43) étant l’isoforme la plus courante exprimée dans toutes les régions du cœur14. Des études antérieures ont mis en évidence l’expression de Cx43 dans les cardiomyocytes des PVs15,16.
Il reste difficile d’étudier la SEP dans les PV intacts en raison de leur structure délicate, en particulier dans les modèles de petits animaux. Ici, nous montrons comment identifier et isoler les PV avec les LA et les lobes pulmonaires chez la souris à l’aide de la microdissection guidée par microscopie. De plus, nous démontrons la coloration par immunofluorescence (FI) des PV pour visualiser les cardiomyocytes et leurs interconnexions au sein des PV.
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Protocol
Les soins aux animaux et toutes les procédures expérimentales ont été menés conformément aux directives du Comité de protection et d’éthique des animaux de l’Université Ludwig-Maximilians de Munich, et toutes les procédures utilisant des souris ont été approuvées par la Regierung von Oberbayern (ROB 55.2-2532. Vet_02-20-215, ROB 55.2-2532. Vet_02-18-46, ROB 55.2-2532. Vet_02-19-86, ROB 55.2-2532. Vet_02-21-178, ROB 55.2-2532. Vet_02-22-170). Des souris C57BL6/N ont été obtenues dans le commerce.
1. Préparation
- Préparez un gel d’agarose à 3 % en mélangeant 3 mg d’agarose et 100 mL de solution saline tamponnée 1x Tris dans un erlenmeyer de 500 mL. Chauffer la solution au micro-ondes à 600 W pendant 2-3 min jusqu’à ce que le gel devienne homogène.
- Préparez la boîte de dissection en versant délicatement le gel dans une boîte de Pétri de 100 mm de diamètre. Remplissez la moitié de la boîte de Pétri de gel. Éliminez les bulles du gel pour assurer une consistance homogène. Laissez refroidir la boîte de dissection jusqu’à ce que le gel devienne solide.
- Préparez tous les tampons et solutions nécessaires, y compris la solution de fixation, la solution de perméabilisation, le tampon de blocage et le tampon de lavage selon les recettes fournies dans le tableau 1.
2. Prélèvement d’organes et préparation des tissus
REMARQUE : Un protocole détaillé détaillant la procédure d’anesthésie de la souris et le prélèvement du cœur a déjà été publié 17,18. Nous ne présentons donc qu’une brève description de cette partie. Des expériences ont été réalisées sur des souris C57BL6 âgées de 12 à 16 semaines (six mâles, quatre femelles). Le poids corporel du mâle est passé de 26 g à 28 g et celui de la femelle de 19 g à 22 g. Les étapes suivantes ont été réalisées sans injection systémique préalable d’héparine.
- Anesthésier la souris avec de l’isoflurane (5 %, oxygène à 95 %, débit : 1 L/min) et s’assurer d’une profondeur d’anesthésie suffisante.
- Transférez la souris sur le pupitre d’opération en la positionnant en position couchée. Maintenir la narcose par inhalation d’isoflurane (2%, oxygène à 98%, débit : 1 L / min) à travers un masque d’anesthésie et fixer la souris avec du ruban adhésif à ses extrémités. Injecter du fentanyl pour l’analgésie (0,1 mg/25 g de poids corporel i.p.).
- Soulevez la fourrure au niveau de l’apophyse xiphoïdale et effectuez une coupe transversale de 2 mm. Déconnectez la fourrure du fascia sous-cutané à l’aide d’une dissection contondante (dos des ciseaux) et prolongez la coupe crânienne et latérale pour exposer le thorax.
- Ouvrez délicatement la caudale de l’abdomen à l’arcade costale. Soulevez légèrement le processus xiphoïdal pour inciser le diaphragme de la caudale et faire s’effondrer les poumons. Ensuite, coupez le diaphragme de gauche à droite sans blesser aucun organe et ouvrez le thorax bilatéralement pour exposer le cœur.
- Coupez la veine cave inférieure (IVC) pendant que le cœur bat encore pour exsanguiner la souris et procédez à la perfusion du cœur en pénétrant dans le ventricule gauche avec une aiguille de 27 G et en injectant 10 mL de solution saline glacée 1x tamponnée au phosphate (PBS).
- Après avoir éliminé le sang du cœur de la souris, localisez l’arc aortique, la veine cave supérieure (SVC) et la trachée. Coupez-les à ~3 mm au-dessus de la base du cœur et récoltez le cœur avec les poumons connectés.
- Immerger les organes prélevés dans un tube conique de 10 mL contenant 2 mL de solution stérilisée à 30 % de saccharose. Laisser les échantillons se déshydrater pendant 24 h à 4 °C.
3. Préparation guidée par microscopie des LA et des PV
- Placez le cœur et les poumons déshydratés dans une boîte de dissection contenant 40 à 50 ml de 1x PBS. Placez-le sous un microscope à fond clair avec un grossissement de 10x et réglez l’éclairage. Placez le cœur avec sa surface dorsale sur le plat de dissection. Identifiez la transition entre la paroi ventriculaire et auriculaire et séparez soigneusement les ventricules des oreillettes à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
REMARQUE : Coupez environ 1 mm en dessous des oreillettes pour conserver un peu de tissu ventriculaire. Cela sera nécessaire plus tard pour épingler les oreillettes à la boîte de dissection sans endommager les structures à la base du cœur. Nous suggérons de conserver les ventricules car ils peuvent être utilisés comme échantillon témoin positif. Pour intégrer le tissu ventriculaire, suivez la même procédure que celle décrite pour l’enrobage des PV, comme décrit à la section 4. - Placez les oreillettes séparées avec la surface de coupe ventriculaire (étape 3.1) sur la boîte de dissection de manière à ce que la base du cœur soit orientée vers le haut. Orientez les oreillettes de manière à ce que les lobes pulmonaires soient postérieurs, que le LA et l’appendice auriculaire gauche (LAA) soient à droite, et que l’oreillette droite (PR) et l’appendice auriculaire droit (RAA) soient à gauche. Fixez la préparation en épinglant le tissu ventriculaire gauche restant sur la boîte de dissection. Étalez doucement les lobes pulmonaires sans appliquer de force excessive et épinglez-les sur la boîte de dissection (Figure 1A).
- Obtenez une vue d’ensemble des repères anatomiques à la base du cœur.
- Trouvez l’aorte avec l’arc aortique au centre de la base du cœur.
- Détectez le tronc pulmonaire (PT) directement à droite de l’aorte et suivez son parcours vers le postérieur pour distinguer les artères pulmonaires (AP). Vérifiez leur emplacement en suivant leur trajectoire jusqu’au lobe gauche et aux lobes supérieur/moyen droits pour trouver le hile pulmonaire (LH) correspondant.
- Déterminer la position de la trachée et/ou des bronches principales gauche et droite (L Br, R Br), situées en arrière de l’aorte, et vérifier leur emplacement en suivant leur trajectoire vers la LH (Figure 1A).
- Trouvez le SVC à gauche de l’aorte et vérifiez en suivant son parcours dans le RA à côté du RAA.
- Retirez le tissu conjonctif et adipeux autour de la base du cœur tout en préservant tous les points de repère identifiés mentionnés ci-dessus. De plus, retirez l’arc aortique et la trachée pour avoir une vue libre de la base du cœur (Figure 1B).
- Séparez délicatement les AP de la surface supérieure de l’oreillette par dissection émoussée à l’aide d’une pince fine. Ensuite, coupez-les à gauche et retournez-les sur le côté pour exposer la paroi libre auriculaire gauche (LAFW) et les PV dans leur pleine dimension. Coupez les bronches principales de la LH et retirez le tissu bronchique (Figure 1C).
REMARQUE : La LH sert à la fois de point d’entrée commun pour les AP et les voies respiratoires dans les poumons, ainsi que de point de sortie pour les PV. Il est important d’effectuer chaque procédure à la LH avec soin pour éviter tout dommage aux PV. - Pour séparer le LA/RA et les ventricules gauche et droit (VG, RV), effectuez une incision en partant de la partie antérieure du RV restant vers le haut à travers la valve tricuspide (TV) jusqu’à la face antérieure du SVC pour ouvrir le RA du côté frontal. Coupez la paroi postérieure libre de PR (RAFW) à côté du septum interauriculaire pour séparer la PR et la LA. Coupez la paroi ventriculaire postérieure droite à côté du septum interventriculaire pour sectionner complètement le VG et le RV.
NOTE : Un protocole détaillé décrivant en détail la procédure de préparation et d’isolement de l’oreillette droite a été publié précédemment19. La séparation de la PR est utile pour éliminer les tissus indésirables du complexe tissulaire LA-PV et pour collecter des tissus pour des expériences supplémentaires. - Réduisez la taille des lobes pulmonaires en coupant une partie du tissu pulmonaire basal afin qu’il reste environ 3 à 4 mm de tissu pulmonaire.
REMARQUE : Préserver les sommets des lobes pulmonaires car ils servent de flotteurs pendant les étapes d’enrobage suivantes et permettre l’enrobage horizontal des PV dans le composé O.C.T.
4. Enrobage tissulaire
- Transférez la préparation, y compris les LA et les PV, dans un cryomoule, en veillant à ce que la base du cœur et l’apex du poumon soient orientés vers le haut. Disposez-les dans une configuration physiologique - assurez-vous que les PV ne sont pas tordus ou retournés.
- Remplissez le cryomoule avec du composé O.C.T et comprimez doucement les PV avec une pince fine pour éliminer tout air restant. Maintenir leur configuration physiologique inchangée tout au long du processus.
- Placez le cryomoule avec le tissu incrusté sur de la glace carbonique pour congeler le composé O.C.T. Conservez les échantillons à -80 °C pour une utilisation ultérieure.
REMARQUE : Il est essentiel de maintenir les PV en position horizontale pour s’assurer d’obtenir des sections contenant des PV sur toute leur longueur pour les procédures ultérieures.
5. Découpe et collecte de coupes de tissus congelés
REMARQUE : Pour couper les blocs de tissu, les réglages de la machine ont été réglés à une température d’éprouvette de -18 °C et à une température de lame de -25 °C.
- Installez un bloc de tissu sur le porte-échantillon en appliquant une couche de composé O.C.T. entre le bloc de tissu et le porte-échantillon. Congelez-les pendant 3-4 min.
- Bloquez la tête de l’échantillon et chargez le porte-échantillon avec le bloc de tissu sur la tête de l’échantillon en fermant le levier de dégagement du mandrin d’échantillon. Ajustez finement la position du bloc de mouchoirs à l’aide des boutons de réglage fin.
- Retirez le cryomoule de l’échantillon. Débloquez la tête de l’échantillon et le frein électrique du cryostat.
- Réglez le cryostat en mode de découpage avec une taille de découpage comprise entre 30 μm et 50 μm. Coupez l’échantillon de tissu jusqu’à ce que les PV deviennent visibles.
- Passez en mode de coupe de section fine et réglez l’épaisseur sur 10 μm. Commencez à prélever des sections, y compris les PV et les tissus pulmonaires et auriculaires connectés. Prélevez les sections à l’aide d’une plaque antiroulis ou en fixant l’extrémité libre de chaque section au porte-lame avec une fine brosse froide et étalez-les.
- Placez une lame (conservée à température ambiante) adjacente à la section. Dégagez délicatement la section de la brosse, en lui permettant d’adhérer naturellement à la lame, car la section gelée et le composé O.C.T. fondent au contact de la surface plus chaude de la lame.
REMARQUE : Maintenez un état stable et doux pendant le processus de sectionnement pour éviter toute rupture ou pli dans les sections. Remplacez la lame par une lame neuve si nécessaire. - Rassemblez jusqu’à trois sections sur chaque diapositive. Étiquetez les lames et conservez-les à -20 °C.
REMARQUE : Nous vous recommandons de collecter au moins cinq sections (l’équivalent de deux diapositives) pour chaque VP.
6. Coloration par immunofluorescence des cryosections des PV
- Disposez les lames congelées sur un système de coloration et laissez les sections décongeler pendant environ 20 minutes à température ambiante.
REMARQUE : Remplissez le système de coloration avec de l’eau pour garder les échantillons humidifiés. Le séchage des tissus peut endommager les antigènes, provoquant une liaison non spécifique aux anticorps et des artefacts de surcoloration pendant les procédures de coloration. - Après 20 min de décongélation, recouvrez les sections de quelques gouttes de solution de fixation (paraformaldéhyde à 4 % [PFA], tableau 1) pour fixer le tissu sur les lames pendant 10 min à température ambiante.
- Après la fixation, transférez les lames sur le support de lames vertical et plongez-les dans un récipient rempli de 1x PBS. Placez le récipient sur un shaker à basse vitesse et lavez les lames pendant 5 min. Répétez ce cycle de lavage deux fois de plus, en utilisant 1x PBS frais à chaque fois.
- Après le lavage, encerclez chaque section individuelle de chaque lame avec un stylo bloqueur de liquide contenant du xylol. Réarranger les lames sur le système de coloration et appliquer 1 ou 2 gouttes de solution de perméabilisation (Triton X-100 à 0,1 %, tableau 1) sur chaque échantillon à l’aide d’une pipette Pasteur. Laisser les sections incuber à température ambiante pendant 10 min pour perméabiliser la cellule et les membranes des organites cellulaires.
- Après perméabilisation, retirez la solution de Triton X-100 à 0,1 % en lavant les lames pendant 3 x 5 min dans 1x PBS, en suivant la même procédure que celle décrite à l’étape 6.3.
- Après le lavage, réorganisez les lames sur le système de coloration et appliquez 1 ou 2 gouttes du tampon de blocage (tableau 1) sur chaque section, en vous assurant qu’elles sont entièrement recouvertes de tampon de blocage. Laisser incuber les lames pendant 1 h à température ambiante.
- Préparer 1 mL du mélange d’anticorps primaires en pipetant 5 μL d’un anticorps anti-TNTc de souris (dilué 1 :200) et 1 μL d’un anticorps anti-Cx43 de lapin (dilué 1 :1 000) dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL rempli de 994 μL de tampon de blocage. Pipeter le mélange de haut en bas pour assurer un mélange complet.
REMARQUE : Ajustez la quantité de mélange d’anticorps appliquée en fonction de la taille de la section. Assurez-vous que les sections sont entièrement recouvertes par le mélange d’anticorps. La concentration, le temps d’incubation et la température d’incubation optimale des anticorps peuvent varier en fonction de facteurs tels que le type d’anticorps, les clones d’anticorps et les caractéristiques des tissus. Nous recommandons de tester et d’optimiser les conditions de coloration individuellement pour chaque anticorps. - Après l’étape de blocage (étape 6.6), retirez le tampon de blocage restant et appliquez directement 2 ou 3 gouttes du mélange d’anticorps primaires sur chaque section. Laissez les lames incuber toute la nuit à 4 °C.
- Après l’incubation primaire de l’anticorps, laver les lames pendant 3 x 5 min avec le tampon de lavage en agitant doucement (tableau 1).
- Préparer 1 mL du mélange d’anticorps secondaires en pipetant 1 μL d’un anticorps secondaire anti-souris conjugué à la chèvre AF488 (dilué 1 :1 000) et 1 μL d’un anticorps secondaire anti-lapin conjugué à la chèvre AF568 (dilué à 1 :1 000) dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL rempli de 998 μL de tampon de lavage. Pipeter le mélange de haut en bas pour bien mélanger.
- Après l’étape de lavage (étape 6.9), réorganisez les lames dans le système de coloration et appliquez 2 ou 3 gouttes du mélange d’anticorps secondaires sur chaque section à l’aide d’une pipette. Laisser les anticorps incuber pendant 45 min à température ambiante tout en protégeant les échantillons de la lumière pour éviter l’extinction des fluorophores. Après l’incubation secondaire de l’anticorps, laver les lames pendant 3 x 5 min avec le tampon de lavage en agitant doucement (tableau 1).
- Réorganisez les lames sur le système de coloration. Contre-colorer les sections avec Hoechst-33342 (dans une dilution de 1 :1 000 dans 1x PBS) en appliquant 2 à 3 gouttes de la solution Hoechst-33342 sur chaque section. Laisser incuber les lames pendant 10 min à température ambiante.
- Après l’incubation, lavez les lames 3 x 5 min avec le tampon de lavage en secouant doucement (tableau 1). Montez les lames en appliquant 1 ou 2 gouttes de médium de montage fluorescent sur chaque lame. Recouvrez les diapositives avec des lamelles.
REMARQUE : Assurez-vous que la lamelle est plate lorsque vous la placez. S’il y a des bulles d’air, appliquez doucement une pression sur le côté de la bulle pour les éliminer. - Rangez les lames montées dans un économiseur de diapositives à 4 °C.
REMARQUE : Il est recommandé d’imager les diapositives le plus tôt possible. Ce protocole n’est pas exclusivement valable pour les anticorps mentionnés. Les antigènes et les anticorps cibles peuvent être remplacés ou modifiés en fonction des exigences de l’expérience individuelle ou d’autres stratégies de détection des antigènes.
7. Imagerie des tranches de coloration par immunofluorescence
- Installez le microscope.
- Démarrez le microscope avec la source de lumière laser, l’ordinateur connecté et le logiciel d’accompagnement en suivant le manuel du fabricant.
- Entrez dans le menu Configuration . Cliquez pour sélectionner le type de caméra approprié pour l’imagerie par fluorescence (par exemple, DFC365FX caméra monochrome).
- Entrez dans le menu Acquérir et créez trois canaux.
- Sélectionnez le canal FCr1 pour la détection de Hoechst-33342, étiquetez-le et sélectionnez le cube de filtre DAP dans la section de sélection. Réglez le temps d’exposition sur 200 ms, le gain électronique sur 2 et l’intensité lumineuse sur 17 %.
- Sélectionnez le canal FCr2 pour la détection du cTNT (coloré avec un anticorps conjugué AF488), étiquetez-le et sélectionnez le cube de filtre L5 dans la section de sélection. Réglez le temps d’exposition sur 200-300 ms, le gain électronique sur 1,8 et l’intensité lumineuse sur 100 %.
- Sélectionnez le canal FCr3 pour la détection de Cx43 (coloré avec un anticorps conjugué AF568), étiquetez-le et sélectionnez le cube de filtre TXR dans la section de sélection. Réglez le temps d’exposition sur 150 ms, le gain électronique sur 2 et l’intensité lumineuse sur 100 %.
REMARQUE : Les caractéristiques spectrales des cubes filtrants sont énumérées dans le tableau 2.
- Chargez la lame sur la platine du microscope.
- Effectuez une imagerie de vue d’ensemble à un grossissement de 10x :
- Sélectionnez l’objectif 10x et ouvrez l’obturateur laser en cliquant sur En direct. Une fois le canal FCr1 sélectionné, utilisez la fonction de navigation pour naviguer dans la diapositive jusqu’à ce qu’un signal soit détecté. Focaliser grossièrement l’échantillon jusqu’à ce que les noyaux cellulaires soient distinguables.
- Lancez le mode de balayage en spirale pour capturer un aperçu complet de l’échantillon. Désactivez le signal en direct en cliquant à nouveau sur le bouton pour protéger l’échantillon. Identifiez l’AL, les PV et le tissu pulmonaire.
- Définissez la zone d’intérêt pour l’analyse ultérieure des tuiles ; Sélectionnez plusieurs points AF dans la zone d’intérêt. Cliquez sur En direct dans le canal FCr1 et ajustez la mise au point pour chaque point AF. Enregistrez les positions Z correspondantes, qui représentent la position exacte de mise au point pour chaque point AF. Lancez le balayage des mosaïques à un grossissement de 10x pour capturer une image d’ensemble complète de l’échantillon.
- Une fois l’analyse terminée, ouvrez l’analyse en mosaïque et fusionnez les images individuelles. Pour améliorer la luminosité et le contraste des canaux individuels, sélectionnez-les dans la barre d’objets et ajustez leur plage de signal à l’aide des curseurs comme vous le souhaitez.
- Obtenez des images agrandies à un grossissement de 40x :
- Sélectionnez l’objectif 40x. Ajustez les paramètres de temps d’exposition et de gain pour chaque canal comme suit : FCr1 : cube de filtre DAP : temps d’exposition : 50 ms, gain : 1,5 ; FCr2 : cube de filtre L5 : temps d’exposition : 80 ms, gain : 1,8 ; FCr3 : cube de filtre TXR : temps d’exposition : 20 ms, gain : 2.
- Utilisez l’image d’ensemble de l’étape 7.3 pour localiser l’orifice PV (PVO), ainsi que les régions PV extrapulmonaires et intrapulmonaires (PVex, PVin). Définissez cette zone à analyser.
- Ouvrez le sous-menu Image et cliquez sur z pour activer Z-Stack.
- Sélectionnez le canal FCr1 et ouvrez l’obturateur laser pour obtenir un aperçu en direct .
- Allez dans le sous-menu Z-Stack et déterminez les points de départ et d’arrivée de Z-Stack en tournant lebouton de réglage fin du champ dans le sens des aiguilles d’une montre et dans le sens inverse des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que le signal global commence à perdre le focus.
- Après avoir configuré la plage de mise au point, sélectionnez le mode Z-Stack optimisé pour le système et activez l’option Calculer les images de profondeur de champ étendue (EDF). Selon la planéité du tissu, attendez-vous à environ 20 couches avec un intervalle d’environ 0,5 μm.
- Lancez l’analyse des vignettes. Après la numérisation, ouvrez le scan des tuiles et fusionnez uniquement l’image EDF. Pour améliorer la luminosité et le contraste des canaux individuels, sélectionnez-les dans la barre d’objets et ajustez leur plage de signal à l’aide des curseurs comme vous le souhaitez (voir l’étape 7.3.4).
- Après avoir généré les images, enregistrez le projet et exportez à la fois la version fusionnée et les canaux bruts de chaque image sous forme de fichier TIFF.
REMARQUE : L’enregistrement des fichiers au format TIFF lisible par ImageJ permet à ImageJ d’importer la taille de la mosaïque d’origine en μm au lieu de pixels. Fermez toujours l’obturateur laser chaque fois qu’un signal laser n’est pas nécessaire pour éviter le photoblanchiment des anticorps secondaires.
8. Retouche d’image avec ImageJ
- Chargez les fichiers de canal brut correspondants dans ImageJ. Cliquez sur l’image | Couleur | Fusionnez et choisissez la couleur souhaitée pour chaque canal.
- Créez une barre d’échelle en sélectionnant Analyser | Outils | Barre d’échelle et collez-la dans le coin inférieur droit. Procéder à un traitement et à une analyse ultérieurs en fonction des exigences de l’image. Enregistrez les images fusionnées lorsque vous avez terminé.
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Representative Results
Nous avons effectué la microdissection, la coloration et l’imagerie des PV chez 10 souris âgées de 12 à 16 semaines. En suivant le protocole, nous avons réussi à microdisséquer les PV avec le LA chez toutes les souris expérimentales et avons obtenu des coupes avec une vue complète des PV chez huit souris. Des images d’ensemble ont été prises à un grossissement de 10x pour identifier la région de l’orifice PV (PVO) à la jonction LA-PV, les PV extrapulmonaires (PV ex) (PVentre le hile pulmonaire et la jonction LA-PV) et les PV intrapulmonaires (PVin) (PV entourés de tissu pulmonaire) (Figure 2). Des images agrandies des régions mentionnées ont été obtenues avec un objectif de grossissement de 40x (Figure 3).
Nous avons trouvé des signaux cTNT spécifiques avec une striation musculaire typique dans le PVO, le PVex et le PVin (Figure 3). Cx43 a été trouvé dans les trois régions PV et a été principalement projeté entre cardiomyocytes voisins (Figure 3 et Figure 4A). Des signaux liés à Cx43 ont été observés à la fois du côté polaire (Figure 3, flèches jaunes) et du côté latéral des cardiomyocytes dans la SEP (Figure 3, flèches rouges).
Figure 1 : Identification des veines pulmonaires murines au microscope. Microscopie à fond clair (grossissement 10x). Le cœur est épinglé à la boîte de dissection avec quatre broches à l’oreillette, au lobe pulmonaire gauche, au lobe pulmonaire moyen droit et au lobe pulmonaire inférieur droit. (A) Vue d’ensemble de la base du cœur après avoir séparé le tissu ventriculaire de l’oreillette avec l’arc aortique au milieu. L’atrium est situé en bas ; Les lobes pulmonaires sont répartis dans la moitié supérieure de l’image. Les PV sont dissimulés par l’AA, les bronches principales et les PA. (B) Image de dessus de la base du cœur après l’ablation de la trachée, de parties des bronches principales, de l’arc aortique, ainsi que du tissu conjonctif et adipeux. Les AP au milieu de l’image montrent leur parcours complet du PT au LH et couvrent les PV. (C) Image de dessus des PV après avoir coupé les PA des lobes pulmonaires et enlevé le tissu bronchique extrapulmonaire. Barres d’échelle = 5 mm. Abréviations : AA = arc aortique ; AscA = aorte ascendante ; IVC = veine cave inférieure ; L Br = bronche principale gauche ; L PV = veine pulmonaire gauche ; LA-PV J = jonction oreillette-veine pulmonaire gauche ; LAA = appendice auriculaire gauche ; LAFW = paroi auriculaire gauche libre ; LH = hile pulmonaire ; L. LL = lobe gauche du poumon ; AP = artères pulmonaires ; PT = tronc pulmonaire ; R Br = bronche principale droite ; R PV = veine pulmonaire droite ; R-A PV = veine pulmonaire ascendante droite ; RAA = appendice auriculaire droit ; R. selon LL = lobe pulmonaire accessoire droit ; R. inf. LL = lobe pulmonaire inférieur droit ; R. mid. LL = lobe pulmonaire moyen droit ; R. sup. LL = lobe pulmonaire supérieur droit ; SVC = veine cave supérieure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Vue d’ensemble des veines pulmonaires de souris adultes et de l’oreillette gauche dans une image en coupe transversale par microscopie d’immunofluorescence. Les noyaux cellulaires ont été colorés avec Hoechst-33342 (bleu) ; les cardiomyocytes ont été marqués avec des anticorps anti-cTNT (blancs) ; et les jonctions lacunaires ont été détectées à l’aide d’anticorps anti-Cx43 (vert). Les rectangles blancs mettent en évidence les régions suivantes : a, orifice PV (PVO) ; b, PV extrapulmonaire (PVex) ; et c, PV intrapulmonaire (PVin). Barre d’échelle = 500 μm. Abréviations : L PV = veine pulmonaire gauche ; LAA = appendice auriculaire gauche ; LAFW = paroi auriculaire gauche libre ; LV-EP = ventricule gauche - voie d’éjection ; R PV = veine pulmonaire droite ; R-A PV = veine pulmonaire ascendante droite ; RV = Ventricule droit. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Vue agrandie du myocarde PV droit à l’aide de la microscopie à immunofluorescence. Les noyaux cellulaires ont été colorés avec Hoechst-33342 (bleu) ; les cardiomyocytes ont été marqués avec des anticorps anti-cTNT (blancs) ; et les jonctions lacunaires Cx43+ ont été détectées par l’anticorps anti-Cx43 (vert). (A) Scans de tuiles EDF montrant une coupe longitudinale à travers le PV extrapulmonaire droit. L’orifice LA et PV ne sont pas représentés sur l’image et seraient situés à gauche, tandis que le PV intrapulmonaire et le parenchyme pulmonaire correspondant (également non représenté) seraient situés à droite. (B,C) Scans d’une seule tuile EDF de la PV extrapulmonaire droite. Les flèches mettent en évidence les jonctions lacunaires Cx43+ aux frontières cellulaires des cardiomyocytes. Les flèches jaunes indiquent les jonctions lacunaires sur les côtés polaires des cardiomyocytes, colocalisées avec des disques intercalés, tandis que les flèches rouges indiquent les jonctions lacunaires sur le côté latéral des cardiomyocytes. Barres d’échelle = 50 μm (A), 20 μm (B,C). Abréviations : PV = veine pulmonaire ; EDF = profondeur de champ étendue ; LA = oreillette gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Coloration par immunofluorescence du tissu témoin. (A) Coloration de contrôle positif du VG murin. Les noyaux cellulaires ont été colorés avec Hoechst 33342 (bleu) ; les cardiomyocytes ont été marqués avec des anticorps anti-cTNT (blancs) ; et des jonctions lacunaires Cx43+ ont été détectées avec des anticorps anti-Cx43 (vert). (B) Coloration de contrôle négative de la PV extrapulmonaire droite en utilisant uniquement des anticorps secondaires. Les noyaux cellulaires sont colorés avec Hoechst 33342 (bleu). Barres d’échelle = 20 μm (A), 50 μm (B). Abréviations : LV = ventricule gauche ; PV = veine pulmonaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Filtre-Cube | Filtre d’excitation | Filtre d’émission |
| DAP | 350 / 50 | 460 / 50 |
| L5 | 480 / 40 | 527 / 30 |
| TXR (en anglais seulement) | 560 / 40 | 630 / 75 |
Tableau 1 : Caractéristiques des filtres d’excitation et d’émission des cubes filtrants Leica DM6 B.
| Composé | Concentration finale | g ou mL / 100 mL requis |
| Solution de fixation | ||
| Paraformaldéhyde (PFA) 16% | 4% | 25 ml |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x concentré | 75 ml | |
| Solution de perméabilisation | ||
| Triton X-100 | 0.1% | 0,1 mL |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x concentré | 99,9 ml | |
| Tampon de blocage | ||
| Sérum Normal goes (NGS) | 10% | 10 ml |
| Albumine sérique bovine (BSA) | 0.5% | 0,5 mg |
| Entre 20 ans | 0.1% | 0,1 mL |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x concentré | 89,9 ml | |
| Tampon de lavage | ||
| Albumine sérique bovine (BSA) | 0.5% | 0,5 mg |
| Entre 20 ans | 0,1 mL | |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x concentré | 99,9 ml | |
Tableau 2 : Recettes tampons.
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Discussion
Avec ce protocole, nous partageons une méthode permettant de distinguer et d’isoler les PV du cœur de souris et d’effectuer une coloration par immunofluorescence sur ceux-ci. Après le prélèvement d’organes, le cœur et les poumons ont été déshydratés dans une solution de saccharose stérilisée, puis séparés les ventricules de l’oreillette et des lobes pulmonaires sous guidage microscopique. Ensuite, la base du cœur a été préparée pour visualiser les PV, puis les a coupées des poumons au niveau du hile. La coloration par immunofluorescence subséquente a été réalisée à l’aide d’une cryotechnique en incorporant le tissu dans un composé O.C.T., en le coupant avec un cryotome et en effectuant une coloration par immunofluorescence pour le cTNT et le Cx43.
L’isolement des PV peut être utile pour étudier leur rôle dans l’arythmogenèse de la FA. Cependant, l’isolation PV chez la souris est difficile. En plus de leur petite taille, les PV sont cachés derrière les bronches principales et les vaisseaux proéminents à la base du cœur, ce qui complique considérablement leur détection. Ce protocole offre un moyen simple et transparent d’étudier les PV murins et permet une approche économique pour étudier en détail leurs caractéristiques morphologiques. L’approche de prélèvement et de préparation proposée préserve les relations anatomiques entre les PV, les lobes pulmonaires correspondants et l’AL, ce qui facilite l’investigation de l’ensemble du complexe tissulaire LA-PV.
Les SEP ont une disposition hétérogène. Une variabilité significative de la continuité et de l’orientation des fibres a été décrite chez plusieurs espèces, y compris les rats et les humains, et se trouve principalement autour des orifices PV 4,20. Ces diversités se traduisent par une conduction électrique anisotrope et peuvent induire l’initiation d’excitations de rentrée et d’activité autonome dans les PV21. De plus, l’interconnexion électrique entre la MS et le myocarde auriculaire au niveau de la jonction LA-PV peut conduire à la transition d’impulsions électriques désynchronisées des PV vers l’oreillette gauche, ce qui entraîne une AF2. La préservation des proportions morphologiques à la jonction LA-PV est donc cruciale pour l’étude de l’interaction entre le myocarde auriculaire et les PVs. Pour y parvenir, l’identification précise des bronches principales et des AP est essentielle. Nous avons identifié les points de repère en fonction de leurs positions anatomiques et de leurs relations à l’aide d’un microscope à grossissement 10x et en suivant systématiquement leur parcours de la base du cœur à la LH.
Les approches de coloration basées sur des colorants immunoréactifs sont largement établies chez différentes espèces et permettent la détection directe des antigènes cibles, offrant un contraste visuel de haute qualité en microscopie. Cette approche permet une caractérisation qualitative et quantitative de coupes de tissus intacts au niveau des protéines. Nous utilisons l’isotype cardiaque du TNT pour faire la distinction entre le myocarde et la musculature non cardiaque. La présence de cardiomyocytes dans les PV, ainsi que dans les CVS et IVC a été décrite précédemment7. Cependant, d’autres structures tubulaires des poumons, y compris les PA, les bronches et les vaisseaux pulmonaires privés, ne contiennent pas de cellules du muscle cardiaque, ce qui les rend faciles à distinguer par coloration IF7. En marquant des protéines de structure telles que le cTNT, les cardiomyocytes présentent leur striation transversale caractéristique en fonction de leur orientation vers le trajet du faisceau. La direction de la striation peut être cartographiée dans ImageJ avec des plugins tels que OrientationJ ou Directionality Plugin. Cela aide à quantifier et à caractériser la directionnalité des cardiomyocytes et pourrait être utile pour identifier les régions à conduction électrique anisotrope. De plus, cette étude confirme les résultats antérieurs concernant la présence abondante de Cx43 dans le myocarde PV murin, qui est organisé de la même manière que dans le VG (Figure 4A)15,16. De manière remarquable, nous avons observé des jonctions lacunaires au niveau de la membrane latérale des cardiomyocytes chez les PV murins. Cette condition, connue sous le nom de latéralisation, a été démontrée comme un mécanisme physiopathologique dans la FA, en particulier chez les souris mâles22. Ainsi, ce protocole met en évidence le potentiel d’études similaires dans les cardiomyocytes de la SEP chez la souris.
L’isolement PV est une technique importante pour la recherche sur l’arythmie car elle permet un certain nombre d’investigations, notamment la coloration IF, la cytométrie en flux, le tri cellulaire activé par fluorescence, la cartographie optique et le patch clamp. Cependant, depuis que le protocole actuel a été établi pour l’imagerie FI des tissus fixés et incrustés, il manque actuellement la preuve directe que les cardiomyocytes peuvent être isolés des préparations PV avec une qualité suffisante pour permettre des expériences telles que le patch clamp. Le succès de la microdissection dépend de l’expérience du chercheur en raison de la petite taille et de la fragilité du tissu cardiaque murin. La qualité de l’imagerie FI dépend également en grande partie de l’étape d’intégration. Les arrangements horizontaux sont difficiles à réaliser, l’intégrité des tissus des sections peut en souffrir et les PV peuvent se rompre s’ils ne sont pas remplis de composé O.C.T. De plus, la validité du protocole est limitée à l’imagerie 2D, car la méthode ne permet pas la reconstruction 3D des PV.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par le Centre allemand de recherche cardiovasculaire (DZHK ; 81X3600221to H.V., 81X2600255 to S.C.), le China Scholarship Council (CSC201808130158 to R.X.), la Fondation allemande pour la recherche (DFG ; Programme de clinicien-chercheur en médecine vasculaire (PRIME), MA 2186/14-1 à P. T.), et la Fondation Corona (S199/10079/2019 à S. C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
References
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