Summary
यह प्रोटोकॉल माइक्रोस्कोपी-निर्देशित अलगाव और म्यूरिन फुफ्फुसीय नसों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला को प्रदर्शित करता है। हम बाएं एट्रियम, फुफ्फुसीय नसों और संबंधित फेफड़ों वाले ऊतक के नमूने तैयार करते हैं और उन्हें कार्डियक ट्रोपोनिन टी और कॉन्नेक्सिन 43 के लिए दाग देते हैं।
Abstract
पल्मोनरी नसें (पीवी) अलिंद अतालता में एक्टोपिक बीट्स का प्रमुख स्रोत हैं और एट्रियल फाइब्रिलेशन (एएफ) के विकास और प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। पीवी में कार्डियोमायोसाइट्स से बना मायोकार्डियल स्लीव्स (एमएस) होता है। एमएस को वायुसेना की दीक्षा और रखरखाव में फंसाया जाता है, क्योंकि वे कार्डियक वर्किंग मायोकार्डियम के लिए समानताएं संरक्षित करते हैं, जिसमें एक्टोपिक विद्युत आवेग उत्पन्न करने की क्षमता भी शामिल है। कृन्तकों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है और फुफ्फुसीय शिरा मायोकार्डियम का अध्ययन करने के लिए उत्कृष्ट पशु मॉडल का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं क्योंकि कार्डियोमायोसाइट्स व्यापक रूप से पोत की दीवार पर मौजूद हैं। हालांकि, छोटे अंग के आकार और जटिल शरीर रचना विज्ञान के कारण सटीक माइक्रोडिसेक्शन और म्यूरिन पीवी की तैयारी चुनौतीपूर्ण है।
हम पीवी के साथ एक साथ murine छोड़ दिया आलिंद अलग करने के लिए एक माइक्रोस्कोपी-निर्देशित microdissection प्रोटोकॉल का प्रदर्शन. कार्डियक ट्रोपोनिन-टी (cTNT) और connexin 43 (Cx43) एंटीबॉडी का उपयोग कर immunofluorescence धुंधला पूर्ण लंबाई में ला और पीवी कल्पना करने के लिए किया जाता है. 10x और 40x आवर्धन पर इमेजिंग पीवी संरचना के व्यापक दृष्टिकोण के साथ-साथ मायोकार्डियल आर्किटेक्चर में विस्तृत अंतर्दृष्टि प्रदान करती है, विशेष रूप से एमएस के भीतर connexin 43 की उपस्थिति को उजागर करती है।
Introduction
आलिंद फिब्रिलेशन (एएफ) सबसे आम निरंतर अतालता1 है। वायुसेना का प्रसार 2060 में यूरोप में ~ 17.9 मिलियन रोगियों की अपेक्षित संख्या के साथ और भी बढ़ रहाहै। वायुसेना चिकित्सकीय रूप से अत्यधिक महत्वपूर्ण है क्योंकि यह मायोकार्डियल रोधगलन, दिल की विफलता, या स्ट्रोक के विकास के लिए एक आवश्यक जोखिम कारक है, जिसके परिणामस्वरूप एक विशाल व्यक्तिगत, सामाजिक और सामाजिक आर्थिक बोझहोता है। भले ही वायुसेना दशकों से जानी जाती है, वायुसेना के पैथोफिज़ियोलॉजी को अभी भी पूरी तरह से समझा नहीं गया है2.
पहले से ही 1990 के दशक के उत्तरार्ध में, अध्ययनों ने वायुसेना को शुरू करने और बनाए रखने में फुफ्फुसीय नसों (पीवी) के महान प्रभाव का प्रदर्शन किया, क्योंकि वे एएफ-ट्रिगरिंग एक्टोपिक बीट्स3 का मुख्य स्रोत हैं। यह प्रदर्शित किया गया है कि पीवी संरचनात्मक रूप से अन्य रक्त वाहिकाओं से भिन्न होते हैं। जबकि विशिष्ट रक्त वाहिकाओं में चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाएं होती हैं, पीवी के ट्यूनिका मीडिया में कार्डियोमायोसाइट्सभी होते हैं। कृन्तकों में, यह हृदय की मांसलता पूरे पीवी में सर्वव्यापी रूप से मौजूद है, जिसमें इंट्रा- और एक्स्ट्रापल्मोनरी पार्ट्स, साथ ही छिद्र क्षेत्र5 शामिल हैं। मनुष्यों में, पीवी में कार्डियोमायोसाइट्स भी होते हैं, जिन्हें बाएं आलिंद (एलए) मायोकार्डियम-तथाकथित मायोकार्डियल स्लीव्स (एमएस)6,7के विस्तार के भीतर देखा जा सकता है।
एमएस में एट्रियल मायोकार्डियम8 के लिए रूपात्मक समानताएं हैं। आलिंद और पीवी कार्डियोमायोसाइट्स का आकार और आकार एक दूसरे के बीच काफी भिन्न नहीं होता है और तुलनीय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुण दिखाता है8. पीवी के भीतर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग ने एमएस की विद्युत गतिविधि को साबित कर दिया है, और एंजियोग्राफिक इमेजिंग ने दिल की धड़कन 9,10 के साथ सिंक्रनाइज़ संकुचन का खुलासा किया है।
गैप जंक्शन छह connexin subunits, जो आयनों और छोटे अणुओं11 के पारित होने की अनुमति देते हैं से बना ताकना बनाने प्रोटीन परिसरों हैं. गैप जंक्शन सेल-टू-सेल अपोजिशन में मौजूद हैं, पड़ोसी कार्डियोमायोसाइट्स को आपस में जोड़ते हैं, और कार्डियोमायोसाइट्स 12,13के बीच एक अंतरकोशिकीय विद्युत युग्मन को सक्षम करते हैं। कई connexin isoforms connexin के साथ दिल में व्यक्त कर रहे हैं 43 (Cx43) सबसे आम isoform दिल14 के सभी क्षेत्रों में व्यक्त किया जा रहा है. पिछले अध्ययन पीवी15,16 के कार्डियोमायोसाइट्स में सीएक्स 43 की अभिव्यक्ति के लिए सबूत प्रदान करते हैं।
यह बरकरार पीवी के भीतर एमएस की जांच करने के लिए चुनौतीपूर्ण बनी हुई है क्योंकि उनकी नाजुक संरचना, विशेष रूप से छोटे पशु मॉडल में। यहां, हम प्रदर्शित करते हैं कि माइक्रोस्कोपी-निर्देशित माइक्रोडिसेक्शन का उपयोग करके चूहों में एलए और फेफड़ों के लोब के साथ पीवी को कैसे पहचानें और अलग करें। इसके अतिरिक्त, हम पीवी के भीतर कार्डियोमायोसाइट्स और उनके अंतर्संबंधों की कल्पना करने के लिए पीवी के इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) धुंधला प्रदर्शित करते हैं।
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Protocol
पशु देखभाल और सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को म्यूनिख के लुडविग-मैक्सिमिलियन्स-विश्वविद्यालय की पशु देखभाल और नैतिकता समिति के दिशानिर्देशों का पालन करते हुए आयोजित किया गया था, और चूहों का उपयोग करने वाली सभी प्रक्रियाओं को रेजिएरुंग वॉन ओबरबेयर्न (आरओबी 55.2-2532) द्वारा अनुमोदित किया गया था। Vet_02-20-215, आरओबी 55.2-2532। Vet_02-18-46, आरओबी 55.2-2532। Vet_02-19-86, आरओबी 55.2-2532। Vet_02-21-178, आरओबी 55.2-2532। Vet_02-22-170)। C57BL6/N चूहों को व्यावसायिक रूप से प्राप्त किया गया था।
1. तैयारी
- एक 500 एमएल Erlenmeyer फ्लास्क में 3 मिलीग्राम agarose और 1x Tris-बफर खारा के 100 एमएल मिश्रण करके एक 3% agarose जेल तैयार करें. जेल सजातीय हो जाता है जब तक 2-3 मिनट के लिए 600 डब्ल्यू पर एक माइक्रोवेव में समाधान गर्मी.
- धीरे एक 100 मिमी व्यास पेट्री डिश में जेल डालने का कार्य द्वारा विच्छेदन पकवान तैयार करें. पेट्री डिश को जेल से आधा भरें। एक सजातीय स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए जेल से स्पष्ट बुलबुले। विच्छेदन पकवान को ठंडा होने तक छोड़ दें जब तक कि जेल ठोस न हो जाए।
- तालिका 1 में प्रदान किए गए व्यंजनों के अनुसार समाधान को ठीक करने, पारगम्यता समाधान, बफर को अवरुद्ध करने और बफर धोने सहित आवश्यक सभी बफ़र्स और समाधान तैयार करें।
2. अंग फसल और ऊतक की तैयारी
नोट: माउस संज्ञाहरण की प्रक्रिया का विवरण और दिल की कटाई पहले17,18 प्रकाशित किया गया है. इस प्रकार, हम उस भाग का केवल एक संक्षिप्त विवरण प्रस्तुत करते हैं। प्रयोग 12 से 16 सप्ताह पुराने C57BL6 चूहों (छह पुरुष, चार महिला) पर किए गए थे। पुरुष के शरीर का वजन 26 ग्राम से 28 ग्राम और महिला के शरीर का वजन 19 ग्राम से 22 ग्राम तक बढ़ गया। निम्नलिखित चरणों को पूर्व प्रणालीगत हेपरिन इंजेक्शन के बिना किया गया था।
- isoflurane (5%, 95% ऑक्सीजन, प्रवाह: 1 एल / मिनट) के साथ माउस संवेदनाहारी और पर्याप्त संज्ञाहरण गहराई सुनिश्चित करते हैं.
- माउस को ऑपरेशन डेस्क पर स्थानांतरित करें, इसे लापरवाह स्थिति में रखें। एक संज्ञाहरण मुखौटा के माध्यम से isoflurane साँस लेना (2%, 98% ऑक्सीजन, प्रवाह: 1 एल / मिनट) के साथ narcosis बनाए रखें और अपने extremities पर टेप के साथ माउस को ठीक. एनाल्जेसिया के लिए फेंटेनाइल इंजेक्ट करें (0.1 मिलीग्राम / 25 ग्राम शरीर का वजन आईपी)।
- xiphoidal प्रक्रिया पर फर लिफ्ट और एक transversal 2 मिमी कटौती सेट. कुंद विच्छेदन (कैंची के पीछे) का उपयोग करके चमड़े के नीचे के प्रावरणी से फर को डिस्कनेक्ट करें और वक्ष को उजागर करने के लिए कट को क्रैनियल और पार्श्व रूप से बढ़ाएं।
- पेट की दुम को कॉस्टल आर्क में सावधानी से खोलें। दुम से डायाफ्राम को चीरने और फेफड़ों के पतन के लिए xiphoidal प्रक्रिया को थोड़ा ऊपर उठाएं। फिर, किसी भी अंग को घायल किए बिना बाएं से दाएं डायाफ्राम को काटें और हृदय को उजागर करने के लिए छाती को द्विपक्षीय रूप से खोलें।
- अवर वेना कावा (आईवीसी) में कटौती, जबकि दिल अभी भी माउस exsanguinate और एक 27 जी सुई के साथ छोड़ वेंट्रिकल घुसना और बर्फ ठंड 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 10 एमएल इंजेक्शन द्वारा दिल perfuse करने के लिए आगे बढ़ना.
- माउस दिल से रक्त समाशोधन के बाद, महाधमनी चाप, बेहतर वेना कावा (एसवीसी), और श्वासनली का पता लगाने. उन्हें दिल के आधार से ~ 3 मिमी ऊपर काटें और जुड़े फेफड़ों के साथ दिल की कटाई करें।
- एक 10 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में काटा अंगों जलमग्न निष्फल 30% सुक्रोज समाधान के 2 एमएल युक्त. नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए निर्जलीकरण करने की अनुमति दें।
3. एलए और पीवी की माइक्रोस्कोपी-निर्देशित तैयारी
- निर्जलित दिल और फेफड़ों को 1x पीबीएस के 40-50 एमएल युक्त विच्छेदन डिश में रखें। इसे 10x आवर्धन के साथ एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के नीचे रखें और प्रकाश व्यवस्था स्थापित करें। विच्छेदन पकवान पर अपनी पृष्ठीय सतह के साथ दिल रखें. वेंट्रिकुलर और अलिंद दीवार के बीच संक्रमण को पहचानें, और सर्जिकल कैंची का उपयोग करके एट्रिया से निलय को सावधानीपूर्वक अलग करें।
नोट: कुछ वेंट्रिकुलर ऊतक रखने के लिए अटरिया से लगभग 1 मिमी अवर काटें। यह दिल के आधार पर संरचनाओं को नुकसान पहुँचाए बिना विच्छेदन पकवान के लिए अटरिया पिन के लिए बाद में की जरूरत होगी. हम निलय रखने का सुझाव देते हैं क्योंकि उन्हें सकारात्मक नियंत्रण नमूने के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। वेंट्रिकुलर ऊतक को एम्बेड करने के लिए, पीवी के एम्बेडिंग के लिए उल्लिखित उसी प्रक्रिया का पालन करें, जैसा कि धारा 4 में वर्णित है। - विच्छेदन पकवान पर वेंट्रिकुलर काटने की सतह (चरण 3.1) के साथ अलग अटरिया रखें ताकि दिल का आधार ऊपर का सामना करना पड़ रहा है। अटरिया को उन्मुख करें ताकि फेफड़े के लोब पीछे हों, एलए और बाएं अलिंद उपांग (एलएए) दाईं ओर हैं, और दाएं आलिंद (आरए) और दाएं आलिंद उपांग (आरएए) बाईं ओर हैं। विच्छेदन पकवान के लिए शेष छोड़ दिया निलय ऊतक पिन करके तैयारी को ठीक करें. धीरे अत्यधिक बल लागू करने के बिना फेफड़ों के लोब बाहर फैल और विच्छेदन पक(चित्रा 1 ए) के लिए उन्हें पिन.
- दिल के आधार पर शारीरिक स्थलों का अवलोकन प्राप्त करें।
- दिल के आधार के केंद्र में महाधमनी चाप के साथ महाधमनी का पता लगाएं।
- महाधमनी के दाईं ओर सीधे फुफ्फुसीय ट्रंक (पीटी) का पता लगाएं और फुफ्फुसीय धमनियों (पीए) को अलग करने के लिए पीछे की ओर अपने पाठ्यक्रम का पालन करें। संबंधित फेफड़े के हिलम (एलएच) को खोजने के लिए बाएं लोब और दाएं श्रेष्ठ/मध्य लोब तक उनके पाठ्यक्रम का पालन करके उनके स्थान को सत्यापित करें।
- श्वासनली और/या बाएं और दाएं मुख्य ब्रांकाई (एल बीआर, आर बीआर) की स्थिति निर्धारित करें, जो महाधमनी के पीछे स्थित हैं, और एलएच(चित्रा 1ए)की ओर उनके पाठ्यक्रम का पालन करके उनके स्थान को सत्यापित करें।
- महाधमनी के बाईं ओर एसवीसी का पता लगाएं और आरएए के बगल में आरए में अपने पाठ्यक्रम का पालन करके सत्यापित करें।
- ऊपर वर्णित सभी पहचाने गए स्थलों को संरक्षित करते हुए हृदय के आधार के आसपास संयोजी और वसा ऊतक निकालें। इसके अतिरिक्त, महाधमनी चाप और श्वासनली को हटा दें ताकि दिल के आधार (चित्रा 1 बी) का एक मुफ्त दृश्य हो सके।
- धीरे ठीक संदंश का उपयोग कुंद विच्छेदन द्वारा आलिंद की ऊपरी सतह से पीए अलग. बाद में, उन्हें एलएच पर काट लें और बाएं आलिंद मुक्त दीवार (एलएएफडब्ल्यू) और पीवी को उनके पूर्ण आयाम में उजागर करने के लिए उन्हें किनारे पर फ्लिप करें। एलएच से मुख्य ब्रांकाई को काटें और ब्रोन्कियल ऊतक (चित्रा 1 सी) को हटा दें।
नोट: एलएच पीए और फेफड़ों में वायुमार्ग के लिए सामान्य प्रवेश बिंदु के साथ-साथ पीवी के लिए निकास बिंदु दोनों के रूप में कार्य करता है। पीवी को किसी भी नुकसान से बचने के लिए एलएच में हर प्रक्रिया को सावधानीपूर्वक करना महत्वपूर्ण है। - एलए/आरए और बाएं और दाएं वेंट्रिकल (एलवी, आरवी) को अलग करने के लिए, आरए को खोलने के लिए एसवीसी के पूर्वकाल पक्ष तक ट्राइकसपिड वाल्व (टीवी) के माध्यम से शेष आरवी के पूर्वकाल भाग से ऊपर की ओर एक कट करें। आरए और एलए को अलग करने के लिए इंटरएट्रियल सेप्टम के बगल में पीछे आरए मुक्त दीवार (आरएएफडब्ल्यू) को काटें। एलवी और आरवी को पूरी तरह से अलग करने के लिए इंटरवेंट्रिकुलर सेप्टम के बगल में पीछे के दाएं वेंट्रिकुलर दीवार को काटें।
नोट: विस्तार से सही आलिंद की तैयारी और अलगाव की प्रक्रिया का वर्णन करने वाला एक व्यापक प्रोटोकॉल पहले19 प्रकाशित किया गया है। आरए की जुदाई ला पीवी ऊतक परिसर से अवांछित ऊतक को हटाने के लिए और अतिरिक्त प्रयोगों के लिए ऊतक इकट्ठा करने के लिए उपयोगी है. - कुछ बेसल फेफड़े के ऊतकों को काटकर फेफड़े के लोब के आकार को कम करें ताकि लगभग 3-4 मिमी फेफड़े के ऊतक बचे रहें।
नोट: फेफड़े के लोब के एपिक्स को संरक्षित करें क्योंकि वे बाद के एम्बेडिंग चरणों के दौरान फ्लोट के रूप में काम करते हैं और ओसीटी यौगिक में क्षैतिज रूप से पीवी के एम्बेडिंग की अनुमति देते हैं।
4. ऊतक एम्बेडिंग
- एलए और पीवी सहित तैयारी को क्रायोमोल्ड में स्थानांतरित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि हृदय आधार और फेफड़े के शीर्ष ऊपर की ओर हैं। उन्हें एक शारीरिक विन्यास में व्यवस्थित करें-सुनिश्चित करें कि पीवी मुड़ या फ़्लिप नहीं हैं।
- क्रायोमोल्ड को O.C.T यौगिक से भरें और किसी भी शेष हवा को हटाने के लिए ठीक संदंश के साथ पीवी को धीरे से संपीड़ित करें। पूरी प्रक्रिया के दौरान उनके शारीरिक विन्यास को अपरिवर्तित बनाए रखें।
- ओसीटी यौगिक को फ्रीज करने के लिए सूखी बर्फ पर एम्बेडेड ऊतक के साथ क्रायोमोल्ड डालें। भविष्य में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करें।
नोट: बाद की प्रक्रियाओं के लिए पूरी लंबाई में पीवी वाले वर्गों को प्राप्त करना सुनिश्चित करने के लिए पीवी को क्षैतिज स्थिति में रखना महत्वपूर्ण है।
5. जमे हुए ऊतक वर्गों को काटना और संग्रह करना
नोट: ऊतक ब्लॉकों को काटने के लिए, मशीन सेटिंग्स को -18 डिग्री सेल्सियस के नमूना तापमान और -25 डिग्री सेल्सियस के ब्लेड तापमान में समायोजित किया गया था।
- ऊतक ब्लॉक और नमूना धारक के बीच ओसीटी यौगिक की एक परत लागू करके नमूना धारक पर एक ऊतक ब्लॉक स्थापित करें। उन्हें 3-4 मिनट के लिए फ्रीज करें।
- नमूना सिर ब्लॉक और नमूना चक रिलीज लीवर बंद करके नमूना सिर पर ऊतक ब्लॉक के साथ नमूना धारक लोड. ठीक समायोजन knobs का उपयोग ऊतक ब्लॉक की स्थिति को बारीक रूप से समायोजित करें।
- नमूने से क्रायोमोल्ड निकालें। नमूना सिर और क्रायोस्टैट के विद्युत ब्रेक को अनब्लॉक करें।
- क्रायोस्टेट को 30 माइक्रोन और 50 माइक्रोन के बीच ट्रिम आकार के साथ ट्रिम मोड पर सेट करें। ऊतक के नमूने को तब तक ट्रिम करें जब तक कि पीवी दिखाई न दें।
- ठीक अनुभाग काटने मोड के लिए स्विच और 10 माइक्रोन के लिए मोटाई सेट. पीवी और जुड़े फेफड़े और आलिंद ऊतक सहित वर्गों को इकट्ठा करना शुरू करें। एक विरोधी रोल प्लेट का उपयोग कर वर्गों लीजिए या एक ठीक ठंड ब्रश के साथ ब्लेड धारक के लिए प्रत्येक अनुभाग के मुक्त अंत फिक्सिंग और उन्हें बाहर फैल गया.
- अनुभाग के निकट एक स्लाइड (कमरे के तापमान पर रखा गया) की स्थिति बनाएं। ब्रश से अनुभाग को सावधानीपूर्वक छोड़ दें, जिससे अनुभाग स्वाभाविक रूप से स्लाइड का पालन कर सके, क्योंकि जमे हुए अनुभाग और ओसीटी यौगिक गर्म स्लाइड सतह को छूने पर पिघल जाते हैं।
नोट: वर्गों में किसी भी टूटना या सिलवटों को रोकने के लिए सेक्शनिंग प्रक्रिया के दौरान एक स्थिर और कोमल स्थिति बनाए रखें। यदि आवश्यक हो तो ब्लेड को एक नए ब्लेड से बदलें। - प्रत्येक स्लाइड पर तीन वर्गों तक ले लीजिए. स्लाइड्स लेबल और -20 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें दुकान.
नोट: हम प्रत्येक पीवी के लिए कम से कम पांच वर्गों (दो स्लाइड के बराबर) एकत्र करने की सलाह देते हैं।
6. पीवी से क्रायोसेक्शन का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना
- एक धुंधला प्रणाली पर जमे हुए स्लाइड व्यवस्थित और वर्गों कमरे के तापमान पर लगभग 20 मिनट के लिए पिघलना करने के लिए अनुमति देते हैं.
नोट: नमूनों को नम रखने के लिए पानी के साथ धुंधला प्रणाली भरें। ऊतक के सूखने से एंटीजन को नुकसान हो सकता है, जिससे धुंधला प्रक्रियाओं के दौरान गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी बाध्यकारी और अतिरंजित कलाकृतियों का कारण बनता है। - विगलन के 20 मिनट के बाद, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए स्लाइड पर ऊतक को ठीक करने के लिए समाधान (4% पैराफॉर्मलाडेहाइड [पीएफए], तालिका 1) को ठीक करने की कुछ बूंदों के साथ वर्गों को कवर करें।
- निर्धारण के बाद, ऊर्ध्वाधर स्लाइड रैक के लिए स्लाइड हस्तांतरण और 1x पीबीएस से भरा एक कंटेनर में उन्हें विसर्जित कर दिया. कंटेनर को कम गति से एक प्रकार के बरतन पर रखें और स्लाइड्स को 5 मिनट के लिए धो लें। इस धोने चक्र को दो बार दोहराएं, हर बार ताजा 1x पीबीएस का उपयोग करें।
- धोने के बाद, प्रत्येक स्लाइड पर प्रत्येक व्यक्तिगत अनुभाग को जाइलोल युक्त तरल अवरोधक पेन से सर्कल करें। धुंधला प्रणाली पर स्लाइड को पुनर्व्यवस्थित करें और एक पाश्चर विंदुक के साथ प्रत्येक नमूने पर पारगम्यता समाधान (0.1% ट्राइटन एक्स-100, तालिका 1) की 1 या 2 बूंदें लागू करें। सेल और सेल organelle झिल्ली permeabilize करने के लिए 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते वर्गों की अनुमति दें.
- पारगम्यता के बाद, चरण 6.3 में वर्णित समान प्रक्रिया का पालन करते हुए, 1x पीबीएस में 3 x 5 मिनट के लिए स्लाइड को धोकर 0.1% ट्राइटन एक्स-100 समाधान को हटा दें।
- धोने के बाद, धुंधला प्रणाली पर स्लाइड को पुनर्व्यवस्थित करें और प्रत्येक अनुभाग में ब्लॉकिंग बफर (तालिका 1) की 1 या 2 बूंदें लागू करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि वे पूरी तरह से अवरुद्ध बफर के साथ कवर किए गए हैं। स्लाइड्स कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
- एक माउस एंटी-सीटीएनटी एंटीबॉडी (पतला 1:200) के 5 माइक्रोन और खरगोश एंटी-सीएक्स 43 एंटीबॉडी (पतला 1: 1,000) के 1 माइक्रोन को 994 माइक्रोन से भरे 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पाइपिंग करके प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण के 1 एमएल तैयार करें। पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए मिश्रण को ऊपर और नीचे पिपेट करें।
नोट: अनुभाग के आकार के अनुसार लागू एंटीबॉडी मिश्रण की मात्रा को समायोजित करें। सुनिश्चित करें कि अनुभाग पूरी तरह से एंटीबॉडी मिश्रण द्वारा कवर किए गए हैं। एंटीबॉडी की एकाग्रता, इनक्यूबेशन समय और इष्टतम इनक्यूबेशन तापमान एंटीबॉडी प्रकार, एंटीबॉडी क्लोन और ऊतक विशेषताओं जैसे कारकों के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। हम प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए व्यक्तिगत रूप से धुंधला होने की स्थिति का परीक्षण और अनुकूलन करने की सलाह देते हैं। - अवरुद्ध कदम (6.6 कदम) के बाद, शेष अवरुद्ध बफर को हटा दें और सीधे प्रत्येक अनुभाग पर प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण के 2 या 3 बूंदों को लागू करें। स्लाइड्स 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं.
- प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के बाद, कोमल मिलाते हुए (तालिका 1) के तहत धोने बफर के साथ 3 एक्स 5 मिनट के लिए स्लाइड धो लें.
- एक AF488-संयुग्मित बकरी एंटीमाउस माध्यमिक एंटीबॉडी (पतला 1: 1,000) के 1 माइक्रोन और AF568-संयुग्मित बकरी एंटीरैबिट माध्यमिक एंटीबॉडी (पतला 1: 1,000) के 1 माइक्रोन को पाइपिंग करके माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण के 1 एमएल को 998 माइक्रोन से भरे 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में तैयार करें। अच्छी तरह मिश्रण मिश्रण ऊपर और नीचे पिपेट अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए.
- धोने कदम (6.9 कदम) के बाद, धुंधला प्रणाली में स्लाइड को पुनर्व्यवस्थित और एक विंदुक के साथ प्रत्येक अनुभाग पर माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण के 2 या 3 बूँदें लागू होते हैं. फ्लोरोफोरे शमन को रोकने के लिए प्रकाश से नमूनों की रक्षा करते हुए एंटीबॉडी को कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें। माध्यमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के बाद, कोमल मिलाते हुए (तालिका 1) के तहत धोने बफर के साथ 3 एक्स 5 मिनट के लिए स्लाइड धो लें.
- धुंधला सिस्टम पर स्लाइड्स को पुनर्व्यवस्थित करें। प्रत्येक अनुभाग पर Hoechst-33342 समाधान की 2 से 3 बूंदों को लागू करके Hoechst-33342 (1x PBS में 1:1,000 के कमजोर पड़ने में) के साथ अनुभागों का प्रतिवाद करें। स्लाइड्स कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं.
- इनक्यूबेशन के बाद, कोमल मिलाते हुए (तालिका 1) के तहत धोने बफर के साथ स्लाइड 3 x 5 मिनट धो लें. प्रत्येक स्लाइड पर फ्लोरोसेंट बढ़ते माध्यम के 1 या 2 बूँदें लागू करके स्लाइड माउंट. स्लाइड्स को कवरस्लिप के साथ कवर करें।
नोट: सुनिश्चित करें कि कवरस्लिप सपाट है जब इसे रखकर। यदि कोई हवाई बुलबुले मौजूद हैं, तो उन्हें हटाने के लिए बुलबुले के किनारे पर धीरे से दबाव डालें। - घुड़सवार स्लाइड्स को स्लाइड सेवर में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: जितनी जल्दी हो सके स्लाइड्स की छवि बनाने की अनुशंसा की जाती है। यह प्रोटोकॉल उल्लिखित एंटीबॉडी के लिए विशेष रूप से मान्य नहीं है। लक्ष्य एंटीजन और एंटीबॉडी को व्यक्तिगत प्रयोग आवश्यकताओं या वैकल्पिक एंटीजन डिटेक्शन रणनीतियों के अनुसार बदला या संशोधित किया जा सकता है।
7. immunofluorescence धुंधला स्लाइस की इमेजिंग
- माइक्रोस्कोप सेट करें।
- लेजर प्रकाश स्रोत, जुड़े कंप्यूटर, और निर्माता के मैनुअल के बाद सॉफ्टवेयर के साथ माइक्रोस्कोप शुरू करें।
- कॉन्फ़िगरेशन मेनू दर्ज करें । प्रतिदीप्ति इमेजिंग (जैसे, DFC365FX मोनोक्रोम कैमरा) के लिए उपयुक्त कैमरा प्रकार का चयन करने के लिए क्लिक करें.
- अधिग्रहण मेनू दर्ज करें और तीन चैनल बनाएं।
- Hoechst-1 को पत्ता लगाउन च्यानल FCr33342 चयन गर्नुहोस्, यसलाई लेबल गर्नुहोस्, र चयन खण्डमा DAP फिल्टर घन चयन गर्नुहोस्। एक्सपोज़र का समय 200 एमएस, इलेक्ट्रॉनिक लाभ 2 और प्रकाश की तीव्रता को 17% पर सेट करें।
- cTNT (AF488-संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ दाग) का पता लगाने के लिए चैनल FCr2 का चयन करें, इसे लेबल करें, और चयन अनुभाग में L5 फ़िल्टर क्यूब का चयन करें। एक्सपोज़र का समय 200-300 एमएस, इलेक्ट्रॉनिक लाभ 1.8 और प्रकाश की तीव्रता को 100% पर सेट करें।
- Cx3 (AF43-संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ दाग) का पता लगाने के लिए चैनल FCr568 का चयन करें, इसे लेबल करें, और चयन अनुभाग में TXR फ़िल्टर क्यूब का चयन करें। एक्सपोज़र का समय 150 एमएस, इलेक्ट्रॉनिक लाभ को 2 और प्रकाश की तीव्रता को 100% पर सेट करें।
नोट: फिल्टर क्यूब्स की वर्णक्रमीय विशेषताओं को तालिका 2में सूचीबद्ध किया गया है।
- माइक्रोस्कोप चरण पर स्लाइड लोड करें।
- 10x आवर्धन पर एक सिंहावलोकन इमेजिंग करें:
- 10x उद्देश्य का चयन करें और लाइव क्लिक करके लेजर शटर खोलें। चयनित FCr1 चैनल के साथ, सिग्नल का पता चलने तक स्लाइड के माध्यम से नेविगेट करने के लिए नेविगेटर फ़ंक्शन का उपयोग करें। मोटे तौर पर नमूना ध्यान केंद्रित जब तक सेल नाभिक अलग कर रहे हैं.
- नमूने का एक पूरा पूर्वावलोकन पर कब्जा करने के लिए सर्पिल स्कैनिंग मोड आरंभ करें. नमूने की सुरक्षा के लिए फिर से बटन पर क्लिक करके लाइव निष्क्रिय करें। एलए, पीवी और फेफड़ों के ऊतकों की पहचान करें।
- बाद के टाइल स्कैन के लिए ब्याज के क्षेत्र को परिभाषित करें; रुचि के क्षेत्र में कई फोकस बिंदुओं का चयन करें। FCr1 चैनल में लाइव पर क्लिक करें और प्रत्येक फ़ोकस बिंदु के लिए फ़ोकस समायोजित करें. संबंधित Z-स्थितियों को सहेजें, जो प्रत्येक फ़ोकस बिंदु के लिए सटीक फ़ोकस स्थिति का प्रतिनिधित्व करते हैं। नमूने की एक पूर्ण अवलोकन छवि पर कब्जा करने के लिए 10x बढ़ाई पर टाइल स्कैन शुरू करें।
- स्कैन पूरा होने के बाद, टाइल स्कैन खोलें और अलग-अलग छवियों को मर्ज करें। एकल चैनलों की चमक और कंट्रास्ट बढ़ाने के लिए, उन्हें ऑब्जेक्ट बार में चुनें और इच्छानुसार स्लाइडर्स के साथ उनकी सिग्नल रेंज समायोजित करें।
- 40x आवर्धन पर ज़ूम-इन चित्र प्राप्त करें:
- 40x उद्देश्य का चयन करें. प्रत्येक चैनल के लिए एक्सपोज़र समय और लाभ सेटिंग्स को निम्नानुसार समायोजित करें: FCr1: DAP फ़िल्टर क्यूब: एक्सपोज़र समय: 50 ms, लाभ: 1.5; FCr2: L5 फ़िल्टर क्यूब: एक्सपोज़र समय: 80 ms, लाभ: 1.8; FCr3: TXR फ़िल्टर क्यूब: एक्सपोज़र समय: 20 ms, लाभ: 2.
- PV छिद्र (PVO), साथ ही एक्स्ट्रापल्मोनरी और इंट्रापल्मोनरी PV (PVex, PVin) क्षेत्रों का पता लगाने के लिए चरण 7.3 की अवलोकन छवि का उपयोग करें। स्कैन किए जाने वाले इस क्षेत्र को परिभाषित करें।
- सबमेनू छवि खोलें और Z-स्टैक को सक्रिय करने के लिए z पर क्लिक करें।
- FCr1 चैनल का चयन करें और लाइव पूर्वावलोकन प्राप्त करने के लिए लेजर शटर खोलें।
- जेड-स्टैक सबमेनू पर जाएं और एफओकस फाइन एडजस्टमेंट नॉब को दक्षिणावर्त और वामावर्त घुमाकर जेड-स्टैक स्टार्टिंग और एंड पॉइंट निर्धारित करें जब तक कि समग्र सिग्नल फोकस खोना शुरू न कर दे।
- फ़ोकस श्रेणी सेट करने के बाद, सिस्टम अनुकूलित Z-स्टैक मोड का चयन करें, और फ़ील्ड छवियों (EDF) विकल्प की विस्तारित गहराई की गणना करें को सक्रिय करें। ऊतक कितना सपाट है इस पर निर्भर करता है, लगभग 0.5 माइक्रोन के एक कदम अंतराल के साथ लगभग 20 परतों की अपेक्षा करें।
- टाइल स्कैन शुरू करें। स्कैन करने के बाद, टाइल स्कैन खोलें और केवल ईडीएफ छवि को मर्ज करें। एकल चैनलों की चमक और कंट्रास्ट बढ़ाने के लिए, उन्हें ऑब्जेक्ट बार में चुनें और स्लाइडर्स के साथ उनकी सिग्नल रेंज को इच्छानुसार समायोजित करें (चरण 7.3.4 देखें)।
- छवियों को उत्पन्न करने के बाद, प्रोजेक्ट को सहेजें और दोनों को निर्यात करें, मर्ज किए गए संस्करण और प्रत्येक छवि के कच्चे चैनल TIFF फ़ाइल के रूप में।
नोट: फ़ाइलों को ImageJ-पठनीय TIFF के रूप में सहेजना ImageJ को पिक्सेल के बजाय μm में मूल टाइल आकार आयात करने की अनुमति देता है। हमेशा लेजर शटर बंद जब भी एक लेजर संकेत माध्यमिक एंटीबॉडी के photobleaching को रोकने के लिए की जरूरत नहीं है.
8. इमेजजे के साथ छवि संपादन
- ImageJ में संबंधित कच्चे चैनल फ़ाइलों को लोड करें। छवि पर क्लिक करें | रंग | मर्ज करें और प्रत्येक चैनल के लिए वांछित रंग चुनें।
- विश्लेषण करें | उपकरण | स्केल बार और इसे निचले दाएं कोने में पेस्ट करें। छवि आवश्यकताओं के अनुसार आगे की प्रक्रिया और विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें। समाप्त होने पर मर्ज की गई छवियों को सहेजें।
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Representative Results
हम microdissection, धुंधला हो जाना है, और 10 12-16 सप्ताह पुराने चूहों में पीवी की इमेजिंग प्रदर्शन किया. प्रोटोकॉल के बाद, हम सफलतापूर्वक सभी प्रयोगात्मक चूहों में ला के साथ एक साथ microdissected और आठ चूहों में PVs का एक व्यापक दृश्य के साथ वर्गों प्राप्त. अवलोकन छवियों को एलए-पीवी जंक्शन पर पीवी छिद्र (पीवीओ) क्षेत्र, एक्स्ट्रापल्मोनरी पीवी (पीवीपूर्व) (फेफड़े के हिलम और एलए-पीवी जंक्शन के बीच पीवी), और इंट्रापल्मोनरी पीवी (पीवीइन) (फेफड़े के ऊतकों से घिरे पीवी) (चित्रा 2) की पहचान करने के लिए 10x आवर्धन पर लिया गया था। उल्लिखित क्षेत्रों की ज़ूम-इन छवियों को 40x आवर्धन उद्देश्य (चित्रा 3) पर प्राप्त किया गया था।
हमें पीवीओ, पीवीपूर्व और पीवीमें एक विशिष्ट पेशी पट्टी के साथ विशिष्ट सीटीएनटी संकेत मिले (चित्र 3)। Cx43 सभी तीन पीवी क्षेत्रों में पाया गया था और ज्यादातर पड़ोसी cardiomyocytes (चित्रा 3 और चित्रा 4 ए) के बीच अनुमान लगाया गया था. Cx43 से संबंधित संकेतों दोनों ध्रुवीय पक्ष (चित्रा 3, पीले तीर) और एमएस (चित्रा 3, लाल तीर) में cardiomyocytes के पार्श्व पक्ष पर मनाया गया.
चित्रा 1: माइक्रोस्कोप के तहत murine फुफ्फुसीय नसों की पहचान। ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी (10x आवर्धन)। दिल को एट्रियम, बाएं फेफड़े की पालि, दाएं मध्य फेफड़े के लोब और दाएं अवर फेफड़े के लोब में चार पिन के साथ विच्छेदन पकवान पर पिन किया जाता है। (ए) बीच में महाधमनी चाप के साथ आलिंद से वेंट्रिकुलर ऊतक को अलग करने के बाद दिल के आधार का अवलोकन। एट्रियम तल पर स्थित है; फेफड़े के लोब तस्वीर के ऊपरी आधे हिस्से में फैले हुए हैं। पीवी को एए, मुख्य ब्रांकाई और पीए द्वारा छुपाया जाता है। (बी) श्वासनली, मुख्य ब्रांकाई के कुछ हिस्सों, महाधमनी चाप, साथ ही संयोजी और वसा ऊतक को हटाने के बाद दिल के आधार की शीर्ष दृश्य छवि। छवि के बीच में पीए पीटी से एलएच तक अपना पूरा कोर्स दिखाते हैं और पीवी को कवर करते हैं। (सी) फेफड़ों के लोब से पीए को काटने और एक्स्ट्रापल्मोनरी ब्रोन्कियल ऊतक को हटाने के बाद पीवी की शीर्ष दृश्य छवि। स्केल बार = 5 मिमी। संक्षिप्ताक्षर: AA = महाधमनी चाप; AscA = आरोही महाधमनी; IVC = अवर वेना कावा; एल बीआर = बाएं मुख्य ब्रोन्कस; एल पीवी = बाएं फुफ्फुसीय शिरा; एलए-पीवी जे = बाएं एट्रियम-फुफ्फुसीय शिरा जंक्शन; LAA = बाएं आलिंद उपांग; LAFW = बाईं अलिंद मुक्त दीवार; एलएच = फेफड़े का हिलम; एल एलएल = बाएं फेफड़े का लोब; पीए = फुफ्फुसीय धमनियां; पीटी = फुफ्फुसीय ट्रंक; आर बीआर = सही मुख्य ब्रोन्कस; आर पीवी = सही फुफ्फुसीय नस; आर-ए पीवी = सही आरोही फुफ्फुसीय नस; RAA = सही आलिंद उपांग; एलएल = सही सहायक फेफड़े का पालि; एलएल = सही अवर फेफड़े की पाली; R. mid. एलएल = दाएं मध्य फेफड़े का पालि; एलएल = सही बेहतर फेफड़े की पाली; SVC = सुपीरियर वेना कावा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा एक ट्रांसवर्सल सेक्शन छवि में वयस्क माउस फुफ्फुसीय नसों और बाएं आलिंद का अवलोकन। सेल नाभिक को होचस्ट -33342 (नीला) के साथ दाग दिया गया था; कार्डियोमायोसाइट्स को एंटी-सीटीएनटी एंटीबॉडी (सफेद) के साथ लेबल किया गया था; और गैप जंक्शनों को एंटी-सीएक्स 43 एंटीबॉडी (हरा) का उपयोग करके पता लगाया गया था। सफेद आयत निम्नलिखित क्षेत्रों को उजागर करते हैं: ए, पीवी छिद्र (पीवीओ); बी, एक्स्ट्रापल्मोनरी पीवी (पीवीपूर्व); और सी, इंट्रापल्मोनरी पीवी (पीवीइन)। स्केल बार = 500 माइक्रोन। संक्षिप्ताक्षर: एल पीवी = बाएं फुफ्फुसीय नस; LAA = बाएं आलिंद उपांग; LAFW = बाईं अलिंद मुक्त दीवार; एलवी-ईपी = बाएं वेंट्रिकल - इजेक्शन पथ; आर पीवी = सही फुफ्फुसीय नस; आर-ए पीवी = सही आरोही फुफ्फुसीय नस; RV = दायां वेंट्रिकल। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सही पीवी मायोकार्डियम के ज़ूम-इन दृश्य। सेल नाभिक को होचस्ट -33342 (नीला) के साथ दाग दिया गया था; कार्डियोमायोसाइट्स को एंटी-सीटीएनटी एंटीबॉडी (सफेद) के साथ लेबल किया गया था; और Cx43+ गैप जंक्शनों का पता एंटी-Cx43 एंटीबॉडी (हरा) द्वारा लगाया गया था। (ए) ईडीएफ टाइल स्कैन सही एक्स्ट्रापल्मोनरी पीवी के माध्यम से एक अनुदैर्ध्य खंड दिखा रहा है। एलए और पीवी छिद्र छवि में नहीं दिखाए गए हैं और बाईं ओर स्थित होंगे, जबकि इंट्रापल्मोनरी पीवी और संबंधित फेफड़े के पैरेन्काइमा (भी नहीं दिखाए गए) दाईं ओर स्थित होंगे। (बी, सी) सही एक्स्ट्रापल्मोनरी पीवी के ईडीएफ एकल टाइल स्कैन। तीर कार्डियोमायोसाइट्स की सेलुलर सीमाओं पर Cx43+ गैप जंक्शनों को उजागर करते हैं। पीले तीर कार्डियोमायोसाइट्स के ध्रुवीय पक्षों पर अंतराल जंक्शनों को इंगित करते हैं, इंटरकलेटेड डिस्क के साथ सहस्थानीयकृत, जबकि लाल तीर कार्डियोमायोसाइट्स के पार्श्व पक्ष में अंतराल जंक्शनों को इंगित करते हैं। स्केल बार = 50 माइक्रोन (ए), 20 माइक्रोन (बी, सी)। संक्षिप्ताक्षर: पीवी = फुफ्फुसीय नस; EDF = क्षेत्र की विस्तारित गहराई; ला = बायां आलिंद कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: नियंत्रण ऊतक के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना। (ए) murine LV के सकारात्मक नियंत्रण धुंधला हो जाना. सेल नाभिक Hoechst 33342 (नीला) के साथ दाग रहे थे; कार्डियोमायोसाइट्स को एंटी-सीटीएनटी एंटीबॉडी (सफेद) के साथ लेबल किया गया था; और Cx43+ गैप जंक्शनों को एंटी-Cx43 एंटीबॉडी (हरा) के साथ पाया गया। (बी) केवल माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके सही एक्स्ट्रापल्मोनरी पीवी का नकारात्मक नियंत्रण धुंधलापन। सेल नाभिक Hoechst 33342 (नीला) के साथ दाग रहे हैं. स्केल बार = 20 माइक्रोन (ए), 50 माइक्रोन (बी)। संक्षिप्ताक्षर: LV = बाएं वेंट्रिकल; पीवी = फुफ्फुसीय शिरा। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| फ़िल्टर-क्यूब | उत्तेजना फ़िल्टर | उत्सर्जन फ़िल्टर |
| डीएपी | 350 / 50 | 460 / 50 |
| एल5 | 480 / 40 | 527 / 30 |
| टीएक्सआर | 560 / 40 | 630 / 75 |
तालिका 1: Leica DM6 B फ़िल्टर क्यूब्स की उत्तेजना और उत्सर्जन फ़िल्टर विशेषताएँ।
| यौगिक | अंतिम एकाग्रता | जी या एमएल / 100 एमएल आवश्यक है |
| समाधान फिक्सिंग | ||
| पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) 16% | 4% | 25 एमएल |
| फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) 1x केंद्रित | 75 एमएल | |
| Permeabilization समाधान | ||
| ट्राइटन एक्स-100 | 0.1% | 0.1 एमएल |
| फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) 1x केंद्रित | 99.9 एमएल | |
| ब्लॉकिंग बफर | ||
| सामान्य सीरम जाता है (एनजीएस) | 10% | 10 एमएल |
| बोवाइन सीरम एल्बुमिन (बीएसए) | 0.5% | 0.5 मिलीग्राम |
| ट्वीन 20 | 0.1% | 0.1 एमएल |
| फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) 1x केंद्रित | 89.9 एमएल | |
| वॉशिंग बफर | ||
| बोवाइन सीरम एल्बुमिन (बीएसए) | 0.5% | 0.5 मिलीग्राम |
| ट्वीन 20 | 0.1 एमएल | |
| फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) 1x केंद्रित | 99.9 एमएल | |
तालिका 2: बफर व्यंजनों।
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Discussion
इस प्रोटोकॉल के साथ, हम माउस दिल के पीवी को अलग करने और अलग करने और उन पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला करने के लिए एक विधि साझा करते हैं। अंग की फसल के बाद, हृदय और फेफड़ों को निष्फल सुक्रोज समाधान में निर्जलित किया गया था, इसके बाद सूक्ष्म मार्गदर्शन के तहत एट्रियम और फेफड़े के लोब से निलय को अलग किया गया था। बाद में, हृदय आधार को पीवी की कल्पना करने के लिए तैयार किया गया था, इसके बाद उन्हें हिलम में फेफड़ों से काट दिया गया था। बाद में इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना ओसीटी यौगिक में ऊतक को एम्बेड करके, इसे क्रायोटोम के साथ काटकर, और सीटीएनटी और सीएक्स 43 के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रदर्शन करके क्रायोटेक्निक का उपयोग करके किया गया था।
पीवी को अलग करना वायुसेना के अतालता में उनकी भूमिका का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो सकता है। हालांकि, चूहों में पीवी अलगाव चुनौतीपूर्ण है। अपने छोटे आकार के अलावा, पीवी मुख्य ब्रांकाई और दिल के आधार पर प्रमुख जहाजों के पीछे छिपे हुए हैं, जो बड़े पैमाने पर उनकी पहचान को जटिल बनाते हैं। यह प्रोटोकॉल murine पीवी की जांच करने के लिए एक सरल और पारदर्शी तरीका प्रदान करता है और विस्तार से उनके रूपात्मक विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए एक आर्थिक दृष्टिकोण की अनुमति देता है। प्रस्तावित कटाई और तैयारी दृष्टिकोण पीवी, संबंधित फेफड़े के लोब और एलए के बीच शारीरिक संबंधों को संरक्षित करता है, जिससे पूरे एलए-पीवी ऊतक परिसर की जांच की सुविधा मिलती है।
एमएस के पास एक विषम व्यवस्था है। निरंतरता और फाइबर अभिविन्यास में महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता चूहों और मनुष्यों सहित कई प्रजातियों में वर्णित किया गया है, और ज्यादातर पीवी छिद्रों 4,20 के आसपास पाए जाते हैं. उन विविधताओं के परिणामस्वरूप अनिसोट्रोपिक विद्युत चालन होता है और पीवी21 में पुन: प्रवेश उत्तेजना और स्वायत्त गतिविधि की दीक्षा को प्रेरित कर सकता है। इसके अलावा, एलए-पीवी जंक्शन पर एमएस और एट्रियल मायोकार्डियम के बीच विद्युत इंटरकनेक्शन पीवी से बाएं आलिंद में डीसिंक्रोनाइज्ड विद्युत आवेगों के संक्रमण का कारण बन सकता है, जिसके परिणामस्वरूप एएफ2 होता है। इसलिए, एलए-पीवी जंक्शन पर रूपात्मक अनुपात को संरक्षित करना एट्रियल मायोकार्डियम और पीवी के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसे प्राप्त करने के लिए, मुख्य ब्रांकाई और पीए की सटीक पहचान आवश्यक है। हमने 10x आवर्धन के साथ माइक्रोस्कोप का उपयोग करके और हृदय आधार से एलएच तक उनके पाठ्यक्रम का व्यवस्थित रूप से पालन करके उनकी शारीरिक स्थिति और संबंधों के अनुसार स्थलों की पहचान की।
हमने murine PVs के IF धुंधला होने का प्रदर्शन किया। immunoreactive रंगों पर आधारित धुंधला दृष्टिकोण व्यापक रूप से विभिन्न प्रजातियों में स्थापित कर रहे हैं और लक्ष्य प्रतिजनों के प्रत्यक्ष पता लगाने की अनुमति, माइक्रोस्कोपी में उच्च गुणवत्ता वाले दृश्य विपरीत प्रदान करते हैं. यह दृष्टिकोण प्रोटीन स्तर पर बरकरार ऊतक स्लाइस के गुणात्मक और मात्रात्मक लक्षण वर्णन दोनों को सक्षम बनाता है। हम मायोकार्डियम और गैर-कार्डियक मांसलता के बीच अंतर करने के लिए टीएनटी के कार्डियक आइसोटाइप का उपयोग करते हैं। पीवी में कार्डियोमायोसाइट्स की उपस्थिति, साथ ही एसवीसी और आईवीसीको पहले 7 वर्णित किया गया है। हालांकि, पीए, ब्रांकाई और निजी फेफड़ों के जहाजों सहित फेफड़ों की अन्य ट्यूबलर संरचनाओं में हृदय की मांसपेशियों की कोशिकाएं नहीं होती हैं, जिससे उन्हें आईएफ धुंधला7 द्वारा भेद करना आसान हो जाता है। सीटीएनटी जैसे संरचना प्रोटीन को लेबल करके, कार्डियोमायोसाइट्स बीम पथ की ओर उनके उन्मुखीकरण के आधार पर उनकी विशेषता क्रॉस स्ट्राइशन दिखाते हैं। स्ट्राइएशन की दिशा को ImageJ में OrientationJ या दिशात्मकता प्लगइन जैसे प्लगइन्स के साथ मैप किया जा सकता है। यह कार्डियोमायोसाइट्स की दिशात्मकता को निर्धारित करने और चिह्नित करने में सहायता करता है और अनिसोट्रोपिक विद्युत चालन वाले क्षेत्रों की पहचान करने के लिए उपयोगी हो सकता है। इसके अलावा, यह अध्ययन मुराइन पीवी मायोकार्डियम में सीएक्स 43 की प्रचुर मात्रा में उपस्थिति के बारे में पिछले निष्कर्षों का समर्थन करता है, जो एलवी (चित्रा 4ए)15,16में समान तरीके से आयोजित किया जाता है। उल्लेखनीय रूप से, हमने म्यूरिन पीवी में कार्डियोमायोसाइट्स के पार्श्व झिल्ली पर अंतराल जंक्शनों को देखा। इस स्थिति, पार्श्वीकरण के रूप में जाना जाता है, वायुसेना में एक pathophysiologic तंत्र के रूप में प्रदर्शन किया गया है, विशेष रूप से पुरुष चूहों22 में. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल माउस एमएस cardiomyocytes में इसी तरह के अध्ययन के लिए क्षमता पर प्रकाश डाला गया.
पीवी अलगाव अतालता अनुसंधान के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है क्योंकि यह आईएफ-धुंधला हो जाना, प्रवाह साइटोमेट्री, प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई, ऑप्टिकल मैपिंग और पैच क्लैंप सहित कई जांच की अनुमति देता है। हालांकि, चूंकि वर्तमान प्रोटोकॉल निश्चित और एम्बेडेड ऊतक की आईएफ इमेजिंग के लिए स्थापित किया गया था, इसलिए प्रत्यक्ष प्रमाण है कि कार्डियोमायोसाइट्स को पीवी तैयारी से पर्याप्त गुणवत्ता में अलग किया जा सकता है ताकि पैच क्लैंप जैसे प्रयोगों की अनुमति मिल सके, वर्तमान में गायब है। माइक्रोडिसेक्शन की सफलता म्यूरिन कार्डियक ऊतक के छोटे आकार और नाजुकता के कारण शोधकर्ता के अनुभव पर निर्भर करती है। आईएफ इमेजिंग की गुणवत्ता भी काफी हद तक एम्बेडिंग चरण पर निर्भर है। क्षैतिज व्यवस्था को प्राप्त करना मुश्किल है, वर्गों की ऊतक अखंडता पीड़ित हो सकती है, और पीवी टूट सकते हैं यदि वे ओसीटी यौगिक से भरे नहीं हैं। इसके अलावा, प्रोटोकॉल की वैधता 2 डी इमेजिंग तक सीमित है, क्योंकि विधि पीवी के 3 डी पुनर्निर्माण की अनुमति नहीं देती है।
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Disclosures
लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस काम कार्डियोवास्कुलर रिसर्च के लिए जर्मन केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था (DZHK; 81X3600221to एचवी, 81X2600255 एससी के लिए), चीन छात्रवृत्ति परिषद (CSC201808130158 आरएक्स के लिए), जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (DFG; संवहनी चिकित्सा में क्लिनिशियन साइंटिस्ट प्रोग्राम (PRIME), MA 2186/14-1 से P. T.), और कोरोना फाउंडेशन (S199/10079/2019 से S. C.)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
References
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- Wijesurendra, R. S., Casadei, B.
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- Mueller-Hoecker, J., et al. Of rodents and humans: a light microscopic and ultrastructural study on cardiomyocytes in pulmonary veins. International Journal of Medical Sciences. 5 (3), 152-158 (2008).
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- Nathan, H., Gloobe, H. Myocardial atrio-venous junctions and extensions (sleeves) over the pulmonary and caval veins: Anatomical observations in various mammals. Thorax. 25 (3), 317-324 (1970).
- Bond, R. C., Choisy, S. C., Bryant, S. M., Hancox, J. C., James, A. F. Ion currents, action potentials, and noradrenergic responses in rat pulmonary vein and left atrial cardiomyocytes. Physiological Reports. 8 (9), 14432 (2020).
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