Summary
이 프로토콜은 쥐 폐 정맥의 현미경 유도 분리 및 면역형광 염색을 보여줍니다. 좌심방, 폐정맥 및 해당 폐가 포함된 조직 샘플을 준비하고 심장 Troponin T 및 Connexin 43에 대해 염색합니다.
Abstract
폐정맥(PV)은 심방 부정맥에서 이소성 박동의 주요 원인이며 심방세동(AF)의 발생과 진행에 중요한 역할을 합니다. PV에는 심근세포로 구성된 심근 슬리브(MS)가 포함되어 있습니다. 다발성경화증은 이소성 전기 충격을 생성하는 능력을 포함하여 심장 작동 심근과의 유사성을 보존하기 때문에 심방세동의 시작 및 유지와 관련이 있습니다. 설치류는 널리 사용되며 심근세포가 혈관 벽 전체에 널리 존재하기 때문에 폐 정맥 심근을 연구하는 데 우수한 동물 모델을 나타낼 수 있습니다. 그러나 쥐 PV의 정확한 미세해부 및 준비는 작은 장기 크기와 복잡한 해부학적 구조로 인해 어렵습니다.
PV와 함께 쥐 좌심방(LA)을 분리하기 위한 현미경 유도 현세해부 프로토콜을 시연합니다. 심장 Troponin-T(cTNT) 및 connexin 43(Cx43) 항체를 사용한 면역형광 염색을 수행하여 LA 및 PV를 전체 길이로 시각화합니다. 10x 및 40x 배율의 이미징은 PV 구조에 대한 포괄적인 보기와 심근 구조에 대한 자세한 통찰력을 제공하며, 특히 MS 내에서 connexin 43의 존재를 강조합니다.
Introduction
심방세동(AF)은 가장 흔한 지속 부정맥이다1. 심방세동 유병률은 더욱 증가하여 2060년에는 유럽에서 ~1,790만 명의 환자가 발생할 것으로 예상됩니다1. 심방세동은 심근경색, 심부전 또는 뇌졸중의 발병에 필수적인 위험 요소이기 때문에 임상적으로 매우 중요하며, 이는 엄청난 개인적, 사회적, 사회경제적 부담을 초래한다1. 심방세동은 수십 년 동안 알려져 왔지만, 심방세동의 병태생리학은 아직 완전히 이해되지 않았다2.
이미 1990년대 후반에 여러 연구에서 폐정맥(PV)이 심방세동을 유발하는 이소성 박동(ectopic beats)의 주요 원인이기 때문에 심방세동을 시작하고 유지하는 데 큰 영향을 미친다는 사실이 입증되었습니다3. PV는 구조적으로 다른 혈관과 다르다는 것이 입증되었습니다. 일반적인 혈관에는 평활근 세포가 포함되어 있지만, PV의 튜니카 배지에는 심근세포도 포함되어 있다4. 설치류에서, 이 심장 근육계는 폐내 및 폐외 부분뿐만 아니라 오리피스 영역(5)을 포함한 전체 PV에 걸쳐 어디에나 존재한다. 인간의 경우 PV에는 좌심방(LA) 심근 슬리브(MS)6,7라고 하는 심근의 확장 내에서 관찰할 수 있는 심근세포도 포함되어 있습니다.
다발성경화증은 심방심근(atrial myocardium8)과 형태학적 유사성을 가지고 있다. 심방과 PV 심근세포의 모양과 크기는 서로 크게 다르지 않으며 유사한 전기생리학적 특성을 나타낸다8. PV 내의 전기 생리학적 기록은 다발성경화증의 전기적 활성을 입증했으며, 혈관 조영술은 심장 박동 9,10과 동기화된 수축을 밝혀냈다.
간극연접(gap junction)은 6개의 커넥신 소단위체(connexin subunit)로 구성된 기공 형성 단백질 복합체로, 이온과 소분자(11)의 통과를 허용한다. 간극연접(gap junction)은 세포-세포 접합부(cell-to-cell appositions)에 존재하고, 이웃한 심근세포를 상호 연결하며, 심근세포(cardiomyocyte) 사이의 세포간 전기적 결합을 가능하게 한다(12,13). 여러 개의 커넥신 동형이 심장에서 발현되며, 커넥신 43(Cx43)은 심장의 모든 영역에서 발현되는 가장 흔한 동형이다14. 이전 연구는 PVs15,16의 심근세포에서 Cx43의 발현에 대한 증거를 제공합니다.
온전한 PV의 섬세한 구조로 인해, 특히 작은 동물 모델에서 MS를 조사하는 것은 여전히 어렵습니다. 여기에서는 현미경 유도 미세해부를 사용하여 마우스에서 LA 및 폐엽과 함께 PV를 식별하고 분리하는 방법을 보여줍니다. 또한 PV의 면역형광(IF) 염색을 시연하여 심근세포와 PV 내 상호 연결을 시각화합니다.
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Protocol
동물 관리 및 모든 실험 절차는 뮌헨 루트비히-막시밀리안-대학의 동물 관리 및 윤리 위원회의 지침에 따라 수행되었으며, 마우스를 사용한 모든 절차는 Regierung von Oberbayern(ROB 55.2-2532)의 승인을 받았습니다. Vet_02-20-215, ROB 55.2-2532. Vet_02-18-46, ROB 55.2-2532 참조. Vet_02-19-86, ROB 55.2-2532. Vet_02-21-178, ROB 55.2-2532. Vet_02-22-170). C57BL6/N 마우스를 상업적으로 획득하였다.
1. 준비
- 3 mg의 아가로스와 100 mL의 1x 트리스 완충 식염수를 500 mL 삼각 플라스크에 혼합하여 500 % 아가로스 겔을 준비합니다. 용액을 600W의 전자레인지에서 겔이 균질해질 때까지 2-3분 동안 가열합니다.
- 직경 100mm의 페트리 접시에 젤을 부드럽게 부어 해부 접시를 준비합니다. 페트리 접시 반을 젤로 채웁니다. 균일한 일관성을 보장하기 위해 젤에서 거품을 제거합니다. 젤이 굳을 때까지 해부 접시를 식히십시오.
- 표 1에 제공된 레시피에 따라 고정 용액, 투과화 용액, 차단 완충액 및 세척 완충액을 포함하여 필요한 모든 완충액과 용액을 준비합니다.
2. 장기 적출 및 조직 준비
참고: 마우스 마취 및 심장 적출 절차를 자세히 설명하는 광범위한 프로토콜이 이전에 발표되었습니다17,18. 따라서 해당 부분에 대한 간략한 설명만 제시합니다. 실험은 12주 내지 16주령의 C57BL6 마우스(수컷 6마리, 암컷 4마리)를 대상으로 실시하였다. 남성의 체중은 26g에서 28g으로, 여성의 체중은 19g에서 22g으로 늘어났습니다. 다음 단계는 사전 전신 헤파린 주사 없이 수행되었습니다.
- 마우스를 이소플루란(5%, 95% 산소, 유량: 1L/min)으로 마취하고 충분한 마취 깊이를 보장합니다.
- 마우스를 수술대로 옮겨 누운 자세로 놓습니다. 마취 마스크를 통해 이소플루란 흡입(2%, 산소 98%, 유량: 1L/min)으로 마취를 유지하고 말단에 테이프로 쥐를 고정합니다. 진통을 위해 펜타닐을 주사합니다(0.1mg/체중 i.p.25g).
- xiphoidal process에서 모피를 들어 올리고 가로 2mm 컷을 설정합니다. 뭉툭한 해부(가위 뒷면)를 사용하여 피하 근막에서 털을 분리하고 절단면을 두개골과 측면으로 확장하여 흉부를 노출시킵니다.
- 복부 꼬리에서 늑골궁까지 조심스럽게 엽니다. 시포이드 돌기를 약간 들어 올려 꼬리에서 횡격막을 절개하고 폐를 무너뜨립니다. 그런 다음 장기를 손상시키지 않고 횡격막을 왼쪽에서 오른쪽으로 자르고 흉부를 양측으로 열어 심장을 노출시킵니다.
- 심장이 아직 뛰고 있는 동안 하대정맥(IVC)을 절단하여 쥐를 제거하고 27G 바늘로 좌심실을 관통하고 얼음처럼 차가운 1x 인산염 완충 식염수(PBS) 10mL를 주입하여 심장에 관류를 진행합니다.
- 쥐 심장에서 혈액을 제거한 후 대동맥궁, 대정맥(SVC) 및 기관을 찾습니다. 심장 기저부 위 ~ 3mm를 자르고 연결된 폐와 함께 심장을 채취합니다.
- 적출된 장기를 멸균된 30% 슈크로스 용액 2mL가 들어 있는 10mL 원뿔형 튜브에 담그십시오. 샘플을 4°C에서 24시간 동안 탈수합니다.
3. LA 및 PV의 현미경 유도 준비
- 탈수된 심장과 폐를 40-50mL의 1x PBS가 들어 있는 해부 접시에 넣습니다. 10배 배율의 명시야 현미경 아래에 놓고 조명을 설정합니다. 등쪽 표면이 있는 심장을 해부 접시에 놓습니다. 심실벽과 심방벽 사이의 전이를 확인하고 수술용 가위를 사용하여 심실과 심방을 조심스럽게 분리합니다.
알림: 심방 조직을 유지하기 위해 심방에서 약 1mm 아래쪽을 자릅니다. 이것은 나중에 심장 기저부의 구조를 손상시키지 않고 심방을 해부 접시에 고정하는 데 필요합니다. 심실은 양성 대조군 검체로 사용할 수 있으므로 보관하는 것이 좋습니다. 심실 조직을 삽입하려면 섹션 4에 설명된 대로 PV 삽입에 대해 설명된 것과 동일한 절차를 따르십시오. - 심실 절단면(3.1단계)이 있는 분리된 심방을 박리 접시에 놓아 심장 기저부가 위를 향하도록 합니다. 심방의 방향을 정하여 폐엽이 후방에 있고, LA와 좌심방 부속기(LAA)가 오른쪽에 있고, 우심방(RA)과 우심방 부속기(RAA)가 왼쪽에 있도록 합니다. 남아 있는 좌심실 조직을 해부 접시에 고정하여 준비를 고정합니다. 과도한 힘을 가하지 않고 폐 엽을 부드럽게 벌리고 해부 접시에 고정합니다(그림 1A).
- 심장 기저부의 해부학 적 랜드 마크에 대한 개요를 얻으십시오.
- 심장 기저부 중앙에 대동맥궁이 있는 대동맥을 찾습니다.
- 대동맥 오른쪽에 있는 폐동맥(PT)을 직접 감지하고 폐동맥(PA)을 구별하기 위해 후방으로 향하는 경로를 따라갑니다. 좌엽과 우측 상엽/중엽까지의 경로를 따라 해당 폐 힐럼(LH)을 찾아 위치를 확인합니다.
- 대동맥 뒤쪽에 위치한 기관 및/또는 좌우 기관지(L Br, R Br)의 위치를 결정하고 LH를 향한 경로를 따라 위치를 확인합니다(그림 1A).
- 대동맥 왼쪽에서 SVC를 찾아 RAA 옆에 있는 RA로 가는 과정을 따라 확인합니다.
- 심장 기저 주변의 결합 조직과 지방 조직을 제거하면서 위에서 언급한 모든 랜드마크를 보존합니다. 또한 대동맥궁과 기관을 제거하여 심장 기저부를 자유롭게 볼 수 있습니다(그림 1B).
- 미세한 집게를 사용하여 뭉툭한 해부로 아트리움의 상부 표면에서 PA를 부드럽게 분리합니다. 그런 다음 LH에서 잘라내고 옆으로 뒤집어 좌심방자유벽(LAFW)과 PV를 전체 치수로 노출시킵니다. LH에서 주요 기관지를 잘라내고 기관지 조직을 제거합니다(그림 1C).
알림: LH는 PA의 일반적인 진입점과 폐로 들어가는 기도의 공통 진입점이자 PV의 출구 역할을 합니다. PV가 손상되지 않도록 LH에서 모든 절차를 신중하게 수행하는 것이 중요합니다. - LA/RA와 좌심실 및 우심실(LV, RV)을 분리하려면 나머지 RV의 앞쪽에서 시작하여 삼첨판막(TV)을 통해 SVC의 앞쪽까지 위쪽으로 절개하여 전방에서 RA를 엽니다. 심방 중격 옆에 있는 후방 RA 자유 벽(RAFW)을 절단하여 RA와 LA를 분리합니다. 심실 중격 옆의 후방 우심실 벽을 절단하여 LV와 RV를 완전히 절단합니다.
참고: 우심방의 준비 및 격리 절차를 자세히 설명하는 광범위한 프로토콜이 이전에19번 발표되었습니다. RA의 분리는 LA-PV 조직 복합체에서 원치 않는 조직을 제거하고 추가 실험을 위해 조직을 수집하는 데 유용합니다. - 약 3-4mm의 폐 조직이 남도록 기저 폐 조직의 일부를 잘라내어 폐엽의 크기를 줄입니다.
알림: 폐엽의 정점은 후속 임베딩 단계에서 부유물 역할을 하므로 보존하고 PV를 O.C.T 화합물에 수평으로 매립할 수 있습니다.
4. 조직 임베딩
- LA 및 PV를 포함한 제제를 극저온 주형으로 옮겨 심장 기저부와 폐 정점이 위쪽을 향하도록 합니다. PV가 비틀리거나 뒤집히지 않도록 생리학적 구성으로 배열하십시오.
- 극저온 몰드에 O.C.T 화합물을 채우고 PV를 미세한 집게로 부드럽게 압축하여 남아 있는 공기를 제거합니다. 과정 전반에 걸쳐 생리적 구성을 변경하지 않고 유지합니다.
- 조직이 내장된 냉동 매뉴드를 드라이아이스에 올려 O.C.T. 화합물을 얼립니다. 나중에 사용할 수 있도록 샘플을 -80°C에 보관하십시오.
알림: 후속 절차를 위해 전체 길이의 PV가 포함된 섹션을 얻을 수 있도록 PV를 수평 위치에 유지하는 것이 중요합니다.
5. 냉동 조직 절편의 절단 및 수집
알림: 조직 블록을 절단하기 위해 기계 설정을 표본 온도 -18°C, 블레이드 온도 -25°C로 조정했습니다.
- 조직 블록과 검체 홀더 사이에 O.C.T. 화합물 층을 적용하여 검체 홀더에 조직 블록을 설치합니다. 3-4분 동안 얼립니다.
- 시편 헤드를 차단하고 시편 척 해제 레버를 닫아 시편 헤드에 조직 블록이 있는 시편 홀더를 장착합니다. 미세 조정 손잡이를 사용하여 티슈 블록의 위치를 미세하게 조정합니다.
- 표본에서 냉동 몰드를 제거합니다. 시편 헤드와 저온 유지 장치의 전기 브레이크를 풉니다.
- 저온 유지 장치를 30μm에서 50μm 사이의 트림 크기로 트림 모드로 설정합니다. PV가 보일 때까지 조직 표본을 다듬습니다.
- 미세 단면 절단 모드로 전환하고 두께를 10μm로 설정합니다. PV와 연결된 폐 및 심방 조직을 포함한 절편 수집을 시작합니다. 안티롤 플레이트를 사용하거나 미세한 콜드 브러시로 각 섹션의 자유 끝을 블레이드 홀더에 고정하여 섹션을 모으고 펼칩니다.
- 섹션에 인접한 슬라이드(실온에서 보관)를 배치합니다. 브러시에서 섹션을 조심스럽게 풀어 따뜻한 슬라이드 표면을 만지면 얼어붙은 부분과 OCT 화합물이 녹기 때문에 섹션이 슬라이드에 자연스럽게 부착되도록 합니다.
알림: 단면이 파열되거나 접히는 것을 방지하기 위해 절편 과정에서 안정적이고 부드러운 상태를 유지하십시오. 필요한 경우 블레이드를 새 블레이드로 교체하십시오. - 각 슬라이드에서 최대 3개의 섹션을 수집합니다. 슬라이드에 라벨을 붙이고 -20 °C에서 보관합니다.
알림: 각 PV에 대해 최소 5개의 섹션(2개의 슬라이드에 해당)을 수집하는 것이 좋습니다.
6. PV에서 동결 절편된 면역형광 염색
- 냉동 슬라이드를 염색 시스템에 배치하고 섹션을 실온에서 약 20분 동안 해동합니다.
알림: s를 유지하기 위해 염색 시스템에 물을 채우십시오.amp가습. 조직을 건조시키면 항원이 손상되어 염색 과정에서 비특이적 항체 결합 및 과염색 아티팩트가 발생할 수 있습니다. - 20분 해동 후 고정 용액(4% 파라포름알데히드[PFA], 표 1) 몇 방울로 섹션을 덮어 실온에서 10분 동안 슬라이드에 조직을 고정합니다.
- 고정 후 슬라이드를 수직 슬라이드 랙으로 옮기고 1x PBS로 채워진 용기에 담그십시오. 용기를 저속으로 셰이커에 놓고 슬라이드를 5분 동안 세척합니다. 매번 새로운 1x PBS를 사용하여 이 세탁 과정을 두 번 더 반복합니다.
- 세척 후 자일롤이 함유된 액체 차단 펜으로 각 슬라이드의 모든 개별 섹션에 동그라미를 칩니다. 염색 시스템에서 슬라이드를 재배열하고 파스퇴르 피펫을 사용하여 각 샘플에 투과화 용액(0.1% Triton X-100, 표 1) 1-2방울을 도포합니다. 절편을 실온에서 10분 동안 배양하여 세포와 세포 소기관막을 투과시킵니다.
- 투과화 후 0.1 단계 6.3에 설명된 것과 동일한 절차에 따라 1x PBS에서 3 x 5분 동안 슬라이드를 세척하여 6.3% Triton X-100 용액을 제거합니다.
- 세척 후 염색 시스템의 슬라이드를 재배열하고 차단 완충액(표 1)을 각 섹션에 1-2방울 떨어뜨려 차단 완충액으로 완전히 덮이도록 합니다. 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
- 마우스 항-cTNT 항체 5μL(1:200 희석)와 토끼 항-Cx43 항체 1μL(1:1,000 희석)를 994μL의 차단 완충액으로 채워진 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 피펫팅하여 1차 항체 혼합물 1mL를 준비합니다. 혼합물이 완전히 섞이도록 혼합물을 위아래로 피펫팅합니다.
NOTE: 절편의 크기에 따라 적용되는 항체 혼합물의 양을 조절하십시오. 섹션이 항체 혼합물로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. 항체의 농도, 배양 시간 및 최적 배양 온도는 항체 유형, 항체 클론 및 조직 특성과 같은 요인에 따라 달라질 수 있습니다. 각 항체에 대해 개별적으로 염색 조건을 테스트하고 최적화하는 것이 좋습니다. - 차단 단계(단계 6.6) 후 남아 있는 차단 완충액을 제거하고 1차 항체 혼합물 2-3방울을 각 절편에 직접 도포합니다. 슬라이드를 4°C에서 밤새 배양합니다.
- 1차 항체 배양 후 세척 버퍼를 사용하여 부드럽게 흔들면서 슬라이드를 3 x 5분 동안 세척합니다(표 1).
- 998μL의 세척 완충액으로 채워진 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 AF488 복합 염소 항마우스 2차 항체(1:1,000 희석)와 AF568 접합 염소 항토끼 2차 항체(1:1,000 희석) 1μL를 피펫팅하여 2차 항체 혼합물 1mL를 준비합니다. 혼합물을 위아래로 피펫팅하여 잘 섞습니다.
- 세척 단계(단계 6.9) 후 염색 시스템에서 슬라이드를 재배열하고 피펫으로 각 섹션에 2차 항체 혼합물 2-3방울을 도포합니다. 항체를 실온에서 45분 동안 배양하고 형광단 소멸을 방지하기 위해 샘플을 빛으로부터 보호합니다. 2차 항체 배양 후 Washing Buffer를 사용하여 부드럽게 흔들어 3 x 5분 동안 슬라이드를 세척합니다(표 1).
- 염색 시스템에서 슬라이드를 재정렬합니다. 각 절편에 Hoechst-33342 용액 2-3방울을 떨어뜨려 Hoechst-33342(1x PBS에서 1:1,000 희석)로 절편을 대조염색합니다. 슬라이드를 실온에서 10분 동안 배양합니다.
- 배양 후 부드럽게 흔들면서 세척 버퍼로 슬라이드를 3 x 5분 동안 세척합니다(표 1). 각 슬라이드에 형광 장착 매체 1 또는 2방울을 도포하여 슬라이드를 장착합니다. 커버슬립으로 슬라이드를 덮습니다.
알림: 커버슬립을 놓을 때 평평한지 확인하십시오. 기포가 있는 경우 기포 측면에 압력을 가하여 기포를 제거합니다. - 장착된 슬라이드를 4°C의 슬라이드 세이버에 보관합니다.
참고: 가능한 한 빨리 슬라이드를 이미지화하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 언급된 항체에 대해서만 유효하지 않습니다. 표적 항원 및 항체는 개별 실험 요건 또는 대체 항원 검출 전략에 따라 대체하거나 수정할 수 있습니다.
7. 면역형광 염색 절편의 이미징
- 현미경을 설정합니다.
- 레이저 광원, 연결된 컴퓨터 및 제조업체 설명서에 따라 함께 제공되는 소프트웨어로 현미경을 시작합니다.
- Configuration 메뉴로 들어갑니다. 형광 이미징에 적합한 카메라 유형(예: 흑백 카메라DFC365FX 클릭하여 선택합니다.
- 획득 메뉴로 들어가 세 개의 채널을 만듭니다.
- Hoechst-33342 감지를 위해 채널 FCr1을 선택하고 레이블을 지정한 다음 선택 섹션에서 DAP 필터 큐브를 선택합니다. 노출 시간을 200ms로, 전자 게인을 2로, 광도를 17%로 설정합니다.
- cTNT(AF488 접합 항체로 염색됨)를 검출하기 위해 채널 FCr2를 선택하고 라벨을 지정한 다음 선택 섹션에서 L5 필터 큐브를 선택합니다. 노출 시간을 200-300ms로, 전자 게인을 1.8로, 광도를 100%로 설정합니다.
- Cx43(AF568 접합 항체로 염색됨)을 검출하기 위해 채널 FCr3를 선택하고 레이블을 지정한 다음 선택 섹션에서 TXR 필터 큐브를 선택합니다. 노출 시간을 150ms로, 전자 게인을 2로, 광도를 100%로 설정합니다.
알림: 필터 큐브의 스펙트럼 특성은 표 2에 나열되어 있습니다.
- 현미경 s에 슬라이드를 로드합니다.tag이자형.
- 10x 배율에서 전체 이미징 수행:
- 10x 대물렌즈를 선택하고 라이브를 클릭하여 레이저 셔터를 엽니다. FCr1 채널을 선택한 상태에서 네비게이터 기능을 사용하여 신호가 감지될 때까지 슬라이드를 탐색합니다. 세포핵을 구별할 수 있을 때까지 샘플에 대략적으로 초점을 맞춥니다.
- 나선형 스캐닝 모드를 시작하여 샘플의 전체 미리보기를 캡처합니다. 시편을 보호하기 위해 버튼을 다시 클릭하여 라이브를 비활성화합니다. LA, PV 및 폐 조직을 식별합니다.
- 후속 타일 스캔에 대한 관심 영역을 정의합니다. 관심 영역 내에서 여러 초점 포인트를 선택합니다. FCr1 채널에서 라이브를 클릭하고 각 초점 포인트의 초점을 조정합니다. 각 초점 포인트의 정확한 초점 위치를 나타내는 해당 Z 위치를 저장합니다. 10x 배율로 타일 스캔을 시작하여 샘플의 전체 개요 이미지를 캡처합니다.
- 스캔이 완료되면 타일 스캔을 열고 개별 이미지를 병합합니다. 단일 채널의 밝기와 대비를 향상시키려면 개체 표시줄 에서 해당 채널을 선택하고 슬라이더로 신호 범위를 원하는 대로 조정합니다.
- 40x 배율로 확대된 이미지 얻기:
- 40x 대물렌즈를 선택합니다. 다음과 같이 각 채널의 노출 시간 및 게인 설정을 조정합니다. FCr1: DAP 필터 큐브: 노출 시간: 50ms, 게인: 1.5; FCr2: L5 필터 큐브: 노출 시간: 80ms, 게인: 1.8; FCr3: TXR 필터 큐브: 노출 시간: 20ms, 게인: 2.
- 7.3단계의 이상view 이미지를 사용하여 PV 오리피스(PVO)와 폐외 및 폐내 PV(PVex, PVin) 영역을 찾습니다. 스캔할 이 영역을 정의합니다.
- 하위 메뉴 이미지를 열고 z를 클릭하여 Z-Stack을 활성화합니다.
- FCr1 채널을 선택하고 레이저 셔터를 열어 실시간 미리보기를 얻습니다.
- Z-Stack 하위 메뉴로 이동하여 전체 신호가 초점을 잃기 시작할 때까지f ocus 미세 조정 노브를 시계 방향과 시계 반대 방향으로 돌려 Z-Stack 시작 및 종료 지점을 결정합니다.
- 초점 범위를 설정한 후 시스템 최적화 Z-스택 모드를 선택하고 확장된 피사계 심도 이미지 (EDF) 계산 옵션을 활성화합니다. 조직이 얼마나 평평한지에 따라 약 0.5μm의 단계 간격으로 약 20개의 층이 예상됩니다.
- 타일 스캔을 시작합니다. 스캔 후 타일 스캔을 열고 EDF 이미지만 병합합니다. 단일 채널의 밝기와 대비를 향상시키려면 개체 표시줄 에서 해당 채널을 선택하고 슬라이더로 신호 범위를 원하는 대로 조정합니다(7.3.4단계 참조).
- 이미지를 생성한 후 프로젝트를 저장하고 병합된 버전과 각 이미지의 Raw 채널을 모두 TIFF 파일로 내보냅니다.
참고: 파일을 ImageJ가 읽을 수 있는 TIFF로 저장하면 ImageJ에서 원래 타일 크기를 픽셀 대신 μm 단위로 가져올 수 있습니다. 2차 항체의 광표백을 방지하기 위해 레이저 신호가 필요하지 않을 때는 항상 레이저 셔터를 닫으십시오.
8. ImageJ를 사용한 이미지 편집
- ImageJ에서 해당 원시 채널 파일을 로드합니다. 이미지 | 색상 | 병합 하고 각 채널에 대해 원하는 색상을 선택합니다.
- 분석(Analyze) | 툴 | Scale Bar를 선택하고 오른쪽 하단 모서리에 붙여넣습니다. 이미지 요구 사항에 따라 추가 처리 및 분석을 진행합니다. 완료되면 병합된 이미지를 저장합니다.
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Representative Results
우리는 12-16주 된 쥐 10마리에서 PV의 미세 해부, 염색 및 이미징을 수행했습니다. 프로토콜에 따라 모든 실험용 마우스에서 LA와 함께 PV를 성공적으로 미세 해부하고 8개 마우스에서 PV를 포괄적으로 볼 수 있는 섹션을 얻었습니다. 개요 이미지는 LA-PV 접합부의 PV 오리피스(PVO) 영역, 폐 외 PV(PVex)(폐 힐럼과 LA-PV 접합부 사이의 PV) 및 폐 내 PV(PVin)(폐 조직으로 둘러싸인 PV)를 식별하기 위해 10배 배율로 촬영되었습니다(그림 2). 언급된 영역의 확대 이미지는 40x 배율 대물렌즈에서 획득되었습니다(그림 3).
PVO, PVex 및 PVin 에서 전형적인 근육 줄무늬가 있는 특정 cTNT 신호를 발견했습니다(그림 3). Cx43은 세 개의 PV 영역 모두에서 발견되었으며 대부분 인접한 심근세포 사이에 투영되었습니다(그림 3 및 그림 4A). Cx43 관련 신호는 MS의 심근세포의 극측(그림 3, 노란색 화살표)과 측면(그림 3, 빨간색 화살표) 모두에서 관찰되었습니다.
그림 1: 현미경으로 본 쥐 폐정맥 식별. 명시야 현미경 검사(10배 확대). 심장은 심방, 좌측 폐엽, 우측 중간 폐엽, 우측 하엽에 4개의 핀이 있는 해부 접시에 고정되어 있습니다. (A) 중간에 대동맥궁이 있는 심방에서 심실 조직을 분리한 후 심장 기저부의 개요. 아트리움은 바닥에 있습니다. 폐엽은 그림의 위쪽 절반에 펼쳐져 있습니다. PV는 AA, 주 기관지 및 PA에 의해 숨겨집니다. (B) 기관, 주요 기관지의 일부, 대동맥궁, 결합 및 지방 조직을 제거한 후 심장 기저부의 평면도 이미지. 이미지 중간에 있는 PA는 PT에서 LH까지의 전체 과정을 보여주고 PV를 덮습니다. (C) 폐엽에서 PA를 절단하고 폐외 기관지 조직을 제거한 후 PV의 평면도 이미지. 축척 막대 = 5mm. 약어: AA = 대동맥궁; AscA = 상행 대동맥; IVC = 하대정맥; L Br = 좌측 주요 기관지; L PV = 좌측 폐정맥; LA-PV J = 좌심방-폐정맥 접합부; LAA = 좌심방 부속기; LAFW = 왼쪽 심방 자유 벽; LH = 폐 hilum; L. LL = 좌측 폐엽; PA = 폐동맥; PT = 폐 몸통; R Br = 오른쪽 주 기관지; R PV = 우측 폐정맥; R-A PV = 우측 상행 폐정맥; RAA = 우심방 부속기; R. acc. LL = 우측 부속 폐엽; R. inf. LL = 우측 하부 폐엽; R. mid. LL = 우측 중간 폐엽; R. sup. LL = 우측 상부 폐엽; SVC = superior vena cava(상대정맥). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 면역형광 현미경으로 촬영한 횡단 단면 이미지의 성체 쥐 폐정맥과 좌심방의 개요. 세포핵은 Hoechst-33342(청색)로 염색하였다; 심근세포는 항-cTNT 항체(흰색)로 표지하였다; 간극연접은 anti-Cx43 항체(녹색)를 사용하여 검출하였다. 흰색 직사각형은 다음 영역을 강조 표시합니다: a, PV 오리피스(PVO); b, 폐외 PV (PV ex); 및 c, 폐내 PV(PVin). 눈금 막대 = 500μm. 약어: L PV = 좌측 폐정맥; LAA = 좌심방 부속기; LAFW = 왼쪽 심방 자유 벽; LV-EP = 좌심실 - 박출 경로; R PV = 우측 폐정맥; R-A PV = 우측 상행 폐정맥; RV = 우심실. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 면역형광 현미경을 사용한 오른쪽 PV 심근의 확대 보기. 세포핵은 Hoechst-33342(청색)로 염색하였다; 심근세포는 항-cTNT 항체(흰색)로 표지하였다; 및 Cx43+ 간극연접은 항-Cx43 항체(녹색)에 의해 검출되었습니다. (A) 우측 폐외 PV를 통해 세로 단면을 보여주는 EDF 타일 스캔. LA 및 PV 오리피스는 이미지에 표시되지 않고 왼쪽에 위치하는 반면, 폐내 PV 및 해당 폐 실질(표시되지 않음)은 오른쪽에 위치합니다. (나,씨) 오른쪽 폐외 PV의 EDF 단일 타일 스캔. 화살표는 심근세포의 세포 경계에 있는 Cx43+ 간극 연접을 강조 표시합니다. 노란색 화살표는 삽입된 디스크와 함께 국소화된 심근세포의 극측에 있는 간극 연접을 나타내고, 빨간색 화살표는 심근세포의 측면에 있는 간극 연접을 나타냅니다. 스케일 바 = 50 μm (A), 20 μm (B,C). 약어: PV = 폐정맥; EDF = 확장된 피사계 심도; LA = 왼쪽 아트리움. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 대조 조직의 면역형광 염색. (A) 쥐 LV의 양성 대조군 염색. 세포핵은 Hoechst 33342(청색)로 염색하였다; 심근세포는 항-cTNT 항체(흰색)로 표지하였다; 및 항-Cx43 항체(녹색)로 Cx43+ 간극연접이 검출되었습니다. (B) 2차 항체만 사용하여 우측 폐외 PV의 음성 대조군 염색. 세포핵은 Hoechst 33342(파란색)로 염색됩니다. 스케일 바 = 20μm(A), 50μm(B). 약어: LV = 좌심실; PV = 폐 정맥. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 필터-큐브 | 여기 필터(Excitation Filter) | 방출 필터 |
| DAP (댁) | 350 / 50 | 460 / 50 |
| 패5 | 480 / 40 | 527 / 30 |
| 증권 시세 표시기 | 560 / 40 | 630 / 75 |
표 1: Leica DM6 B 필터 큐브의 여기 및 방출 필터 특성.
| 화합물 | 최종 농도 | g 또는 mL / 100 mL 필요 |
| 담합 해결책 | ||
| 파라포름알데히드(PFA) 16% | 4% | 25 mL |
| 인산염 완충 식염수(PBS) 1배 농축 | 75 mL | |
| 투과화 솔루션 | ||
| 트리톤 X-100 | 0.1% | 0.1 mL |
| 인산염 완충 식염수(PBS) 1배 농축 | 99.9 mL | |
| 블로킹 버퍼 | ||
| 노멀 고 세럼(NGS) | 10% | 10mL |
| 소 혈청 알부민(BSA) | 0.5% | 0.5의 mg의 |
| 트윈 20 | 0.1% | 0.1 mL |
| 인산염 완충 식염수(PBS) 1배 농축 | 89.9 mL | |
| 세척 버퍼 | ||
| 소 혈청 알부민(BSA) | 0.5% | 0.5의 mg의 |
| 트윈 20 | 0.1 mL | |
| 인산염 완충 식염수(PBS) 1배 농축 | 99.9 mL | |
표 2: 버퍼 레시피.
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Discussion
이 프로토콜을 통해 쥐 심장의 PV를 구별 및 분리하고 면역형광 염색을 수행하는 방법을 공유합니다. 장기 적출 후, 심장과 폐를 멸균된 자당 용액에서 탈수한 후, 현미경 유도 하에 심방과 폐엽에서 심실을 분리하였다. 그 후, 심장 베이스는 PV를 시각화하기 위해 준비되었으며, 그 후 hilum에서 폐에서 PV를 절단했습니다. 후속 면역형광 염색은 조직을 O.C.T. 화합물에 매립하고, 빙정체로 절단하고, cTNT 및 Cx43에 대한 면역형광 염색을 수행함으로써 냉동 기법을 사용하여 수행되었습니다.
PV를 분리하는 것은 심방세동 부정맥 발생에서 PV의 역할을 연구하는 데 유용할 수 있습니다. 그러나 마우스의 PV 분리는 까다롭습니다. PV는 크기가 작을 뿐만 아니라 주요 기관지와 심장 기저부의 눈에 띄는 혈관 뒤에 숨겨져 있어 검출이 매우 복잡합니다. 이 프로토콜은 쥐 PV를 조사할 수 있는 간단하고 투명한 방법을 제공하며 형태학적 특성을 자세히 연구할 수 있는 경제적 접근 방식을 허용합니다. 제안된 수확 및 준비 접근법은 PV, 해당 폐엽 및 LA 간의 해부학적 관계를 보존하여 전체 LA-PV 조직 복합체의 조사를 용이하게 합니다.
MS는 이질적인 배열을 가지고 있습니다. 연속성 및 섬유 배향의 상당한 가변성은 쥐와 인간을 포함한 여러 종에서 설명되었으며 대부분 PV 오리피스 주변에서 발견됩니다 4,20. 이러한 다양성은 이방성 전기 전도를 초래하고 PV21에서 재진입 여기 및 자율 신경 활성의 시작을 유도할 수 있습니다. 또한, LA-PV 접합부에서 MS와 심방 심근 사이의 전기적 상호 연결은 PV에서 좌심방으로 비동기화된 전기 임펄스를 전이하여 AF2를 유발할 수 있습니다. 따라서 LA-PV 접합부에서 형태학적 비율을 보존하는 것은 심방 심근과 PV 간의 상호 작용을 연구하는 데 매우 중요합니다. 이를 위해서는 주요 기관지와 PA를 정확하게 식별하는 것이 필수적입니다. 우리는 10배 배율의 현미경을 사용하여 해부학적 위치와 관계에 따라 랜드마크를 식별하고 심장 기저부에서 LH까지의 경로를 체계적으로 추적했습니다.
쥐 PV의 IF 염색을 수행했습니다. 면역반응성 염료를 기반으로 한 염색 접근법은 다양한 종에서 널리 확립되어 있으며 표적 항원을 직접 검출할 수 있어 현미경 검사에서 고품질 시각적 대비를 제공합니다. 이 접근법은 단백질 수준에서 온전한 조직 절편의 정성적 및 정량적 특성 분석을 가능하게 합니다. TNT의 심장 동형을 사용하여 심근과 비심장 근육을 구별합니다. PV와 SVC 및 IVC에서 심근세포의 존재는 이전에 설명되었습니다7. 그러나 PA, 기관지 및 개인 폐 혈관을 포함한 폐의 다른 관 구조에는 심장 근육 세포가 포함되어 있지 않으므로 IF 염색으로 쉽게 구별할 수 있다7. cTNT와 같은 구조 단백질을 표지함으로써 심근세포는 빔 경로를 향한 방향에 따라 특징적인 교차 줄무늬를 보여줍니다. 줄무늬의 방향은 ImageJ에서 OrientationJ 또는 Directionality Plugin과 같은 플러그인을 사용하여 매핑할 수 있습니다. 이는 심근세포의 방향성을 정량화하고 특성화하는 데 도움이 되며 이방성 전기 전도가 있는 영역을 식별하는 데 유용할 수 있습니다. 또한, 이 연구는 좌심모전과 유사한 방식으로 조직된 쥐 PV 심근에서 Cx43의 풍부한 존재에 관한 이전 발견을 뒷받침합니다(그림 4A)15,16. 놀랍게도, 우리는 쥐 PV에서 심근세포의 외막에서 간극 연접을 관찰했습니다. 측방화(lateralization)로 알려진 이 상태는 심방세동, 특히 수컷 마우스에서 병태생리학적 기전으로 입증되었다22. 따라서 이 프로토콜은 마우스 MS 심근세포에 대한 유사한 연구의 가능성을 강조합니다.
PV 분리는 부정맥 연구에 중요한 기술로, IF 염색, 유세포 분석, 형광 활성화 세포 분류, 광학 매핑 및 패치 클램프를 포함한 다양한 조사가 가능하기 때문입니다. 그러나 현재 프로토콜은 고정 및 내장 조직의 IF 이미징을 위해 확립되었기 때문에 패치 클램프와 같은 실험이 가능할 만큼 충분한 품질로 PV 제제에서 심근세포를 분리할 수 있다는 직접적인 증거는 현재 없습니다. 미세 해부의 성공 여부는 쥐 심장 조직의 작은 크기와 취약성으로 인한 연구자의 경험에 달려 있습니다. IF 이미징의 품질도 임베딩 단계에 따라 크게 달라집니다. 수평 배열은 달성하기 어렵고, 섹션의 조직 무결성이 저하될 수 있으며, PV는 O.C.T. 화합물로 채워지지 않으면 파열될 수 있습니다. 또한, 프로토콜의 유효성은 PV의 3D 재구성을 허용하지 않기 때문에 2D 이미징으로 제한됩니다.
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Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 독일 심혈관 연구 센터(DZHK; 81X3600221to H.V., 81X2600255 to S.C.), 중국 장학위원회(CSC201808130158 to R.X.), 독일 연구 재단(DFG; 혈관 의학 임상 과학자 프로그램(PRIME), MA 2186/14-1 to P. T.), Corona Foundation(S199/10079/2019 to SC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
References
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