Summary
Denne protokollen viser mikroskopiveiledet isolasjon og immunfluorescensfarging av murine lungevener. Vi forbereder vevsprøver som inneholder venstre atrium, lungevener og tilhørende lunger og flekker dem for hjertetroponin T og Connexin 43.
Abstract
Lungevener (PV) er den viktigste kilden til ektopiske slag i atrielle arytmier og spiller en avgjørende rolle i utvikling og progresjon av atrieflimmer (AF). PV inneholder myokardhylser (MS) sammensatt av kardiomyocytter. MS er involvert i initiering og vedlikehold av AF, da de bevarer likheter med hjertets arbeidende myokard, inkludert evnen til å generere ektopiske elektriske impulser. Gnagere er mye brukt og kan representere gode dyremodeller for å studere lungevenemyokardiet siden kardiomyocytter er allment tilstede over hele karveggen. Imidlertid er presis mikrodisseksjon og fremstilling av murine PV utfordrende på grunn av liten organstørrelse og intrikat anatomi.
Vi demonstrerer en mikroskopiveiledet mikrodisseksjonsprotokoll for isolering av murine venstre atrium (LA) sammen med PVene. Immunfluorescensfarging ved bruk av hjerte Troponin-T (cTNT) og connexin 43 (Cx43) antistoffer utføres for å visualisere LA og PV i full lengde. Avbildning ved 10x og 40x forstørrelse gir en omfattende oversikt over PV-strukturen, samt detaljert innsikt i myokardarkitekturen, spesielt fremhever tilstedeværelsen av connexin 43 i MS.
Introduction
Atrieflimmer (AF) er den vanligste vedvarende arytmien1. Utbredelsen av atrieflimmer øker ytterligere med et forventet antall ~17,9 millioner pasienter i Europa i 20601. AF er klinisk svært viktig siden det er en viktig risikofaktor for utvikling av hjerteinfarkt, hjertesvikt eller hjerneslag, noe som resulterer i en enorm individuell, sosial og sosioøkonomisk byrde1. Selv om atrieflimmer har vært kjent i flere tiår, er patofysiologien ved atrieflimmer fortsatt ikke fullt ut forstått2.
Allerede på slutten av 1990-tallet viste studier den store effekten av lungevener (PV) i å initiere og opprettholde AF, da de er hovedkilden til AF-utløsende ektopiske slag3. Det har vist seg at PV strukturelt skiller seg fra andre blodkar. Mens typiske blodkar inneholder glatte muskelceller, inneholder tunikamediet til PV også kardiomyocytter4. Hos gnagere er denne hjertemuskulaturen allestedsnærværende i hele PV, inkludert intra- og ekstrapulmonale deler, samt åpningsregionen5. Hos mennesker inneholder PV også kardiomyocytter, som kan observeres i forlengelser av venstre atriell (LA) myokard - såkalte myokardhylser (MS) 6,7.
MS har morfologiske likheter med atriemyokard8. Formen og størrelsen på atrielle og PV kardiomyocytter varierer ikke signifikant mellom hverandre og viser sammenlignbare elektrofysiologiske egenskaper8. Elektrofysiologiske registreringer i PV har bevist den elektriske aktiviteten til MS, og angiografisk avbildning har avslørt sammentrekninger synkronisert med hjerteslag 9,10.
Gapkryss er poredannende proteinkomplekser sammensatt av seks connexin-underenheter, som tillater passasje av ioner og små molekyler11. Gap-kryss finnes i celle-til-celle-apposisjoner, forbinder nærliggende kardiomyocytter, og muliggjør en intercellulær elektrisk kobling mellom kardiomyocytter12,13. Flere connexinisoformer uttrykkes i hjertet med connexin 43 (Cx43) som den vanligste isoformen uttrykt i alle regioner i hjertet14. Tidligere studier gir holdepunkter for ekspresjon av Cx43 i kardiomyocytter av PV 15,16.
Det er fortsatt utfordrende å undersøke MS i intakte PV på grunn av deres delikate struktur, spesielt i små dyremodeller. Her demonstrerer vi hvordan man identifiserer og isolerer PV sammen med LA og lungelapper hos mus ved hjelp av mikroskopiveiledet mikrodisseksjon. I tillegg demonstrerer vi immunfluorescens (IF) farging av PV for å visualisere kardiomyocytter og deres sammenkoblinger i PVene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrepleie og alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i henhold til retningslinjene fra dyrepleie- og etikkomiteen ved Ludwig-Maximilians-Universitetet i München, og alle prosedyrene ved bruk av mus ble godkjent av Regierung von Oberbayern (ROB 55.2-2532. Vet_02-20-215, ROB 55.2-2532. Vet_02-18-46, ROB 55.2-2532. Vet_02-19-86, ROB 55.2-2532. Vet_02-21-178, ROB 55.2-2532. Vet_02-22-170). C57BL6/N-mus ble kommersielt innhentet.
1. Forberedelse
- Tilbered en 3% agarosegel ved å blande 3 mg agarose og 100 ml 1x Tris-bufret saltvann i en 500 ml Erlenmeyer-kolbe. Varm oppløsningen i en mikrobølgeovn ved 600 W i 2-3 minutter til gelen blir homogen.
- Forbered disseksjonsfatet ved å helle gelen forsiktig i en petriskål med diameter på 100 mm. Fyll petriskålen halvparten med gel. Fjern bobler fra gelen for å sikre en homogen konsistens. La disseksjonsfatet avkjøles til gelen blir fast.
- Forbered alle buffere og løsninger som trengs, inkludert festeløsning, permeabiliseringsløsning, blokkeringsbuffer og vaskebuffer i henhold til oppskriftene gitt i tabell 1.
2. Organhøsting og vevsforberedelse
MERK: En omfattende protokoll som beskriver prosedyren for musebedøvelse og høsting av hjertet har tidligere blitt publisert17,18. Dermed presenterer vi bare en kort beskrivelse av den delen. Eksperimenter ble utført på 12 til 16 uker gamle C57BL6-mus (seks hanner, fire kvinner). Mannens kroppsvekt utvidet fra 26 g til 28 g og kvinnens kroppsvekt fra 19 g til 22 g. Følgende trinn ble utført uten tidligere systemisk heparininjeksjon.
- Bedøv musen med isofluran (5%, 95% oksygen, mengde: 1 l / min) og sørg for tilstrekkelig anestesidybde.
- Overfør musen til skrivebordet, plasser den i liggende stilling. Oppretthold narkosen med isofluran inhalasjon (2%, 98% oksygen, Flow: 1 l / min) gjennom en anestesimaske og fest musen med tape på ekstremitetene. Injiser fentanyl ved analgesi (0,1 mg/25 g kroppsvekt i.p.).
- Løft pelsen ved xiphoidal prosessen og sett en tverrgående 2 mm kutt. Koble pelsen fra den subkutane fascia ved hjelp av stump disseksjon (baksiden av saks) og forleng kuttet kranialt og lateralt for å eksponere thoraxen.
- Åpne forsiktig magen caudal til kulebuen. Løft xiphoidal prosessen litt for å snitte membranen fra caudal og få lungene til å kollapse. Deretter kutter du membranen fra venstre til høyre uten å skade noen organer og åpner thorax bilateralt for å eksponere hjertet.
- Klipp den dårligere vena cava (IVC) mens hjertet fortsatt slår for å exsanguinate musen og fortsett å perfusere hjertet ved å trenge inn i venstre ventrikkel med en 27 G nål og injisere 10 ml iskald 1x fosfatbufret saltvann (PBS).
- Etter å ha fjernet blodet fra musehjertet, finn aortabuen, overlegen vena cava (SVC) og luftrøret. Klipp dem ~ 3 mm over hjertebasen og høst hjertet sammen med de tilkoblede lungene.
- Senk de høstede organene i et 10 ml konisk rør inneholdende 2 ml sterilisert 30% sukroseoppløsning. La prøvene dehydrere i 24 timer ved 4 °C.
3. Mikroskopiveiledet klargjøring av LA og PV
- Plasser det dehydrerte hjertet og lungene i en disseksjonsskål som inneholder 40-50 ml 1x PBS. Sett den under et lyst feltmikroskop med 10x forstørrelse og sett opp belysningen. Plasser hjertet med sin dorsale overflate på disseksjonsfatet. Identifiser overgangen mellom ventrikkel- og atrieveggen, og separer forsiktig ventriklene fra atriene ved hjelp av kirurgisk saks.
MERK: Skjær ca. 1 mm dårligere enn atriene for å holde noe ventrikkelvev. Dette vil være nødvendig senere for å feste atriene til disseksjonsskålen uten å skade strukturer i hjertebasen. Vi foreslår å beholde ventriklene siden de kan brukes som en positiv kontrollprøve. For å legge inn ventrikkelvevet, følg samme prosedyre som er beskrevet for innebygging av PVer, som beskrevet i avsnitt 4. - Plasser de separerte atriene med ventrikkelskjæreflaten (trinn 3.1) på disseksjonsfatet slik at hjertebasen vender oppover. Orienter atriene slik at lungelappene er bakre, LA og venstre atrievedheng (LAA) er til høyre, og høyre atrium (RA) og høyre atrievedheng (RAA) er til venstre. Fest preparatet ved å feste det gjenværende venstre ventrikulære vevet til disseksjonsfatet. Spre lungelappene forsiktig ut uten å bruke for mye kraft og fest dem til disseksjonsskålen (figur 1A).
- Få oversikt over de anatomiske landemerkene ved hjertebasen.
- Finn aorta med aortabuen i midten av hjertebasen.
- Oppdag pulmonalstammen (PT) direkte til høyre for aorta og følg kursen mot bakre for å skille lungearteriene (PA). Bekreft deres plassering ved å følge deres kurs opp til venstre flik og høyre superior / midtre lober for å finne tilsvarende lungehilum (LH).
- Bestem posisjonen til luftrøret og/eller venstre og høyre hovedbronkier (L Br, R Br), som ligger bakenfor aorta, og kontroller deres lokalisasjon ved å følge kursen mot LH (figur 1A).
- Finn SVC til venstre for aorta og verifiser ved å følge kursen inn i RA ved siden av RAA.
- Fjern bindevev og fettvev rundt hjertebasen mens du beholder alle de identifiserte landemerkene nevnt ovenfor. I tillegg må du fjerne aortabuen og luftrøret for å få fri oversikt over hjertebasen (figur 1B).
- Separer forsiktig PA fra den øvre overflaten av atriet ved stump disseksjon ved hjelp av fine tang. Etterpå kutter du dem av ved LH og vender dem til siden for å avsløre venstre atriefrie vegg (LAFW) og PV-ene i sin fulle dimensjon. Klipp av hovedbronkiene fra LH og fjern bronkialvevet (figur 1C).
MERK: LH fungerer både som felles inngangspunkt for PA og luftveier inn i lungene, samt utgangspunktet for PVene. Det er viktig å utføre hver prosedyre på LH nøye for å unngå skade på PVene. - For å skille LA / RA og venstre og høyre ventrikkel (LV, RV), utfør et kutt fra den fremre delen av den gjenværende RV oppover gjennom trikuspidalklaffen (TV) til den fremre siden av SVC for å åpne RA fra frontsiden. Klipp den bakre RA-frie veggen (RAFW) ved siden av den interatriale septum for å skille RA og LA. Klipp den bakre høyre ventrikkelveggen ved siden av interventrikulær septum for å fullstendig kutte LV og RV.
MERK: En omfattende protokoll som beskriver prosedyren for forberedelse og isolering av høyre atrium i detalj har blitt publisert tidligere19. Separasjonen av RA er nyttig for å fjerne uønsket vev fra LA-PV-vevskomplekset og å samle vev for ytterligere eksperimenter. - Reduser størrelsen på lungelappene ved å kutte av noe av det basale lungevevet slik at ca. 3-4 mm lungevev blir til overs.
MERK: Bevar apices av lungelappene som de tjener som flyter under de påfølgende innebyggingstrinnene og tillat innebygging av PVene horisontalt i O.C.T-forbindelsen.
4. Vev innebygging
- Overfør preparatet, inkludert LA og PV, til en cryomold, slik at hjertebasen og lungeapexet vender oppover. Ordne dem i en fysiologisk konfigurasjon - sørg for at PVene ikke er vridd eller vendt.
- Fyll kryomolen med O.C.T-forbindelse og komprimer PV-ene forsiktig med fin tang for å fjerne eventuell gjenværende luft. Oppretthold deres fysiologiske konfigurasjon uendret gjennom hele prosessen.
- Sett kryomolden med det innebygde vevet på tørris for å fryse O.C.T.-forbindelsen. Oppbevar prøvene ved -80 °C for fremtidig bruk.
MERK: Det er avgjørende å holde PV-ene i horisontal stilling for å sikre å skaffe seksjoner som inneholder PV-er i full lengde for påfølgende prosedyrer.
5. Skjæring og oppsamling av frosne vevssnitt
MERK: For å kutte vevblokkene ble maskininnstillingene justert til en prøvetemperatur på -18 °C og bladtemperatur på -25 °C.
- Monter en vevsblokk på prøveholderen ved å påføre et lag av O.C.T.-forbindelse mellom vevsblokken og prøveholderen. Frys dem i 3-4 min.
- Blokker prøvehodet og last prøveholderen med vevsblokken på prøvehodet ved å lukke prøvechuck-utløserspaken. Finjuster posisjonen til vevsblokken ved hjelp av finjusteringsknappene.
- Fjern kryomold fra prøven. Fjern blokkeringen av prøvehodet og den elektriske bremsen på kryostaten.
- Sett kryostat i trimmodus med en trimstørrelse mellom 30 μm og 50 μm. Trim vevsprøven til PVene blir synlige.
- Bytt til fin seksjonsskjæringsmodus og sett tykkelsen til 10 μm. Begynn å samle seksjoner, inkludert PV og tilkoblet lunge- og atrievev. Samle seksjoner ved hjelp av en anti-roll plate eller ved å feste den frie enden av hver seksjon til bladholderen med en fin kald børste og spre dem ut.
- Plasser et lysbilde (holdt ved romtemperatur) ved siden av seksjonen. Slipp seksjonen forsiktig fra børsten, slik at seksjonen naturlig fester seg til lysbildet, ettersom den frosne delen og O.C.T.-forbindelsen smelter når den berører den varmere glideflaten.
MERK: Oppretthold en stabil og skånsom tilstand under seksjoneringsprosessen for å forhindre brudd eller folder i seksjonene. Bytt om nødvendig ut kappskiven med et nytt blad. - Samle opptil tre deler på hvert lysbilde. Merk lysbildene og oppbevar dem ved -20 °C.
MERK: Vi anbefaler at du samler inn minst fem deler (tilsvarer to lysbilder) for hver PV.
6. Immunfluorescensfarging av kryoseksjoner fra PVene
- Ordne de frosne lysbildene på et fargesystem og la seksjonene tine i ca. 20 minutter ved romtemperatur.
MERK: Fyll fargesystemet med vann for å holde prøvene fuktige. Tørking av vevet kan skade antigener, forårsake ikke-spesifikk antistoffbinding og overfarging av artefakter under fargeprosedyrene. - Etter 20 min tining, dekk seksjonene med noen dråper fikseringsløsning (4% paraformaldehyd [PFA], tabell 1) for å fikse vevet på lysbildene i 10 minutter ved romtemperatur.
- Etter fiksering, overfør lysbildene til det vertikale skyvestativet og senk dem i en beholder fylt med 1x PBS. Plasser beholderen på en shaker på lav hastighet og vask lysbildene i 5 minutter. Gjenta denne vaskesyklusen to ganger til, med ferske 1x PBS hver gang.
- Etter vask, sirkle hver enkelt seksjon på hvert lysbilde med en xylolholdig flytende blokkeringspenn. Omorganiser lysbildene på fargesystemet og påfør 1 eller 2 dråper permeabiliseringsløsning (0,1% Triton X-100, tabell 1) på hver prøve med en Pasteur-pipette. La seksjonene inkubere ved romtemperatur i 10 minutter for å permeabilisere celle- og celleorganelle membraner.
- Etter permeabilisering, fjern 0,1% Triton X-100 oppløsningen ved å vaske lysbildene i 3 x 5 minutter i 1x PBS, etter samme prosedyre som beskrevet i trinn 6.3.
- Etter vask, omorganiser lysbildene på fargesystemet og påfør 1 eller 2 dråper blokkeringsbufferen (tabell 1) på hver seksjon, slik at de er helt dekket med blokkeringsbufferen. La lysbildene ruge i 1 time ved romtemperatur.
- Klargjør 1 ml av den primære antistoffblandingen ved å pipetere 5 μL av et museanti-cTNT-antistoff (fortynnet 1:200) og 1 μL av et kaninanti-Cx43-antistoff (fortynnet 1:1000) til et 1,5 ml mikrosentrifugerør fylt med 994 μL blokkeringsbuffer. Pipetter blandingen opp og ned for å sikre grundig blanding.
MERK: Juster mengden antistoffblanding som påføres i henhold til størrelsen på seksjonen. Forsikre deg om at seksjonene er fullt dekket av antistoffblandingen. Konsentrasjonen, inkubasjonstiden og den optimale inkubasjonstemperaturen til antistoffer kan variere avhengig av faktorer som antistofftype, antistoffkloner og vevsegenskaper. Vi anbefaler å teste og optimalisere fargeforholdene individuelt for hvert antistoff. - Etter blokkeringstrinnet (trinn 6.6), fjern den gjenværende blokkeringsbufferen og påfør direkte 2 eller 3 dråper av den primære antistoffblandingen på hver seksjon. La skliene ruges over natten ved 4 °C.
- Etter den primære antistoffinkubasjonen, vask lysbildene i 3 x 5 min med vaskebuffer under forsiktig risting (tabell 1).
- Klargjør 1 ml av den sekundære antistoffblandingen ved å pipetere 1 μL av et AF488-konjugert sekundært antistoff mot geitantimus (fortynnet 1:1 000) og 1 μL av et AF568-konjugert sekundært antistoff mot geitekanin (fortynnet 1:1 000) til et 1,5 ml mikrosentrifugerør fylt med 998 μL vaskebuffer. Pipett blandingen opp og ned for å blande godt.
- Etter vasketrinnet (trinn 6.9), omorganiser lysbildene i fargesystemet og påfør 2 eller 3 dråper av den sekundære antistoffblandingen på hver seksjon med en pipette. La antistoffene ruge i 45 minutter ved romtemperatur mens du beskytter prøvene mot lys for å forhindre fluoroforslukking. Etter sekundær antistoffinkubasjon, vask lysbildene i 3 x 5 min med vaskebuffer under forsiktig risting (tabell 1).
- Omorganiser lysbildene på fargesystemet. Motflekk seksjonene med Hoechst-33342 (i en fortynning på 1: 1,000 i 1x PBS) ved å påføre 2 til 3 dråper Hoechst-33342-løsningen på hver seksjon. La lysbildene ruge i 10 min ved romtemperatur.
- Etter inkubasjonen, vask lysbildene 3 x 5 min med vaskebuffer under forsiktig risting (tabell 1). Monter lysbildene ved å påføre 1 eller 2 dråper fluorescerende monteringsmedium på hvert lysbilde. Dekk lysbildene med coverslips.
MERK: Pass på at dekselet er flatt når du plasserer det. Hvis det er luftbobler, trykk forsiktig på siden av boblen for å fjerne dem. - Oppbevar de monterte lysbildene i en lysbildesparer ved 4 °C.
MERK: Det anbefales å avbilde lysbildene så tidlig som mulig. Denne protokollen er ikke utelukkende gyldig for de nevnte antistoffene. Målantigener og antistoffer kan erstattes eller modifiseres i henhold til de enkelte forsøkskravene eller alternative antigendeteksjonsstrategier.
7. Avbildning av immunfluorescensfargeskivene
- Sett opp mikroskopet.
- Start mikroskopet med laserlyskilden, den tilkoblede datamaskinen og den medfølgende programvaren i henhold til produsentens håndbok.
- Gå inn i konfigurasjonsmenyen . Klikk for å velge passende kameratype for fluorescensavbildning (f.eks. DFC365FX monokromkamera).
- Gå inn på Hent-menyen og opprett tre kanaler.
- Velg kanal FCr1 for påvisning av Hoechst-33342, merk den, og velg DAP-filterkuben i valgdelen . Sett eksponeringstiden til 200 ms, den elektroniske forsterkningen til 2 og lysintensiteten til 17 %.
- Velg kanal FCr2 for påvisning av cTNT (farget med AF488-konjugert antistoff), merk den, og velg L5-filterkuben i valgdelen . Sett eksponeringstiden til 200-300 ms, den elektroniske forsterkningen til 1,8 og lysintensiteten til 100%.
- Velg kanal FCr3 for påvisning av Cx43 (farget med AF568-konjugert antistoff), merk den, og velg TXR-filterkuben i valgdelen . Sett eksponeringstiden til 150 ms, den elektroniske forsterkningen til 2 og lysintensiteten til 100 %.
MERK: De spektrale egenskapene til filterkubene er oppført i tabell 2.
- Last lysbildet på mikroskopstadiet.
- Utfør en oversiktsavbildning ved 10x forstørrelse:
- Velg 10x-målet , og åpne laserlukkeren ved å klikke på Live. Når FCr1-kanalen er valgt, bruker du navigatorfunksjonen til å navigere gjennom lysbildet til et signal oppdages. Fokuser prøven grovt til cellekjernene kan skilles.
- Start spiralskanningsmodus for å fange en fullstendig forhåndsvisning av prøven. Deaktiver live ved å klikke på knappen igjen for å beskytte prøven. Identifiser LA, PV og lungevev.
- Definer interesseområdet for den påfølgende flisskanningen; Velg flere fokuspunkter innenfor interesseområdet. Klikk Live i FCr1-kanalen , og juster fokus for hvert fokuspunkt. Lagre de tilsvarende Z-posisjonene, som representerer den nøyaktige fokusposisjonen for hvert fokuspunkt. Start flisskanningen ved 10x forstørrelse for å ta et fullstendig oversiktsbilde av prøven.
- Etter at skanningen er fullført, åpner du flisskanningen og slår sammen de enkelte bildene. For å forbedre lysstyrken og kontrasten til enkeltkanaler, velg dem i objektlinjen og juster signalområdet med glidebryterne etter ønske.
- Få zoomede bilder ved 40x forstørrelse:
- Velg 40x-målet. Juster eksponeringstid og forsterkning innstillinger for hver kanal som følger: FCr1: DAP filter kube: eksponeringstid: 50 ms, forsterkning: 1,5; FCr2: L5 filterkube: eksponeringstid: 80 ms, forsterkning: 1,8; FCr3: TXR filterkube: eksponeringstid: 20 ms, forsterkning: 2.
- Bruk oversiktsbildet i trinn 7.3 for å finne PV-åpningen (PVO), samt ekstrapulmonale og intrapulmonale PV (PVex, PVi) regioner. Definer dette området som skal skannes.
- Åpne undermenyen Bilde og klikk på z for å aktivere Z-Stack.
- Velg FCr1-kanalen og åpne laserlukkeren for å få en direkte forhåndsvisning.
- Gå til undermenyen Z-Stack og bestem start- og sluttpunktene for Z-Stack ved å dreiefinjusteringsknappen for focus med klokken og mot klokken til det generelle signalet begynner å miste fokus.
- Etter å ha konfigurert fokusområdet, velg System optimalisert Z-Stack-modus, og aktiver alternativet beregne utvidet dybdeskarphetsbilder (EDF). Avhengig av hvor flatt vevet er, forvent ca. 20 lag med et trinnintervall på ca. 0,5 μm.
- Start flisskanningen. Etter skanning åpner du flisskanningen og slår bare sammen EDF-bildet. For å forbedre lysstyrken og kontrasten til enkeltkanaler, velg dem i objektlinjen og juster signalområdet med glidebryterne etter ønske (se trinn 7.3.4).
- Etter å ha generert bildene, lagre prosjektet og eksporter begge, den sammenslåtte versjonen og råkanalene til hvert bilde som en TIFF-fil.
MERK: Hvis du lagrer filene som ImageJ-lesbar TIFF, kan ImageJ importere den opprinnelige flisstørrelsen i μm i stedet for piksler. Lukk alltid laserlukkeren når et lasersignal ikke er nødvendig for å forhindre fotobleking av sekundære antistoffer.
8. Bilderedigering med ImageJ
- Last inn de tilsvarende råkanalfilene i ImageJ. Klikk på bildet | Farge | Slå sammen og velg ønsket farge for hver kanal.
- Opprett en skalalinje ved å velge Analyser | Verktøy | Scale Bar og lim den inn nederst i høyre hjørne. Fortsett med videre behandling og analyse i henhold til bildekravene. Lagre de sammenslåtte bildene når du er ferdig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi utførte mikrodisseksjon, farging og avbildning av PVene i 10 12-16 uker gamle mus. Etter protokollen mikrodissekerte vi vellykket PV sammen med LA i alle eksperimentelle mus og oppnådde seksjoner med en omfattende oversikt over PVene i åtte mus. Oversiktsbilder ble tatt ved 10x forstørrelse for å identifisere PV-åpningsregionen (PV) ved LA-PV-krysset, ekstrapulmonale PVer (PV ex) (PVmellom lungehilum og LA-PV-overgangen) og de intrapulmonale PVene (PV i) (PVomgitt av lungevev) (figur 2). Innzoomede bilder av de nevnte regionene ble tatt ved et 40x forstørrelsesmål (figur 3).
Vi fant spesifikke cTNT-signaler med typisk muskelstriasjon i PVO, PVex og PVi (figur 3). Cx43 ble funnet i alle tre PV-regioner og ble hovedsakelig projisert mellom nærliggende kardiomyocytter (figur 3 og figur 4A). Cx43-relaterte signaler ble observert både på polarsiden (figur 3, gule piler) og lateralsiden av kardiomyocyttene ved MS (figur 3, røde piler).
Figur 1 Identifisering av murine lungevener under mikroskop. Brightfield mikroskopi (10x forstørrelse). Hjertet er festet til disseksjonsskålen med fire pinner i atriumet, venstre lungelapp, høyre midtre lungelapp og høyre nedre lungelapp. (A) Oversikt over hjertebasen etter separering av ventrikkelvevet fra atriumet med aortabuen i midten. Atriet ligger nederst; Lungelappene er spredt ut i øvre halvdel av bildet. PV er skjult av AA, hovedbronkiene og PA-ene. (B) Toppbilde av hjertebasen etter fjerning av luftrøret, deler av hovedbronkiene, aortabuen, samt bindevev og fettvev. PA-ene i midten av bildet viser hele kurset fra PT til LH og dekker PV-ene. (C) Toppbilde av PV-ene etter å ha kuttet PAene fra lungelappene og fjernet det ekstrapulmonale bronkialvevet. Skalastenger = 5 mm. Forkortelser: AA = aortabue; AscA = stigende aorta; IVC = dårligere vena cava; L Br = venstre hovedbronkus; L PV = venstre lungevene; LA-PV J = venstre atrium-lungeveneovergang; LAA = venstre atrievedheng; LAFW = venstre atriefri vegg; LH = lungehilum; L. LL = venstre lungelapp; PA = lungearterier; PT = lungestammen; R Br = høyre hovedbronkus; R PV = høyre lungevene; R-A PV = høyre stigende lungevene; RAA = høyre atrievedheng; R. acc. LL = høyre tilbehør lungelapp; R. inf. LL = høyre nedre lungelapp; R. mid. LL = høyre midtre lungelapp; R. sup. LL = høyre øvre lungelapp; SVC = overlegen vena cava. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Oversikt over voksne lungevener hos mus og venstre atrium i et tverrsnittbilde ved immunfluorescensmikroskopi. Cellekjerner ble farget med Hoechst-33342 (blå); kardiomyocytter ble merket med anti-cTNT antistoff (hvit); og gap-junctions ble påvist ved bruk av anti-Cx43 antistoff (grønn). De hvite rektanglene markerer følgende regioner: a, PV-åpning (PVO); b, ekstrapulmonal PV (PVex); og c, intrapulmonal PV (PVi). Skala bar = 500 μm. Forkortelser: L PV = venstre lungevene; LAA = venstre atrievedheng; LAFW = venstre atriefri vegg; LV-EP = venstre ventrikel - utkastningsvei; R PV = høyre lungevene; R-A PV = høyre stigende lungevene; RV = Høyre ventrikkel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Zoomet inn av høyre PV-myokard med immunfluorescensmikroskopi. Cellekjerner ble farget med Hoechst-33342 (blå); kardiomyocytter ble merket med anti-cTNT antistoff (hvit); og Cx43+ gap junctions ble påvist av anti-Cx43 antistoff (grønn). (A) EDF-flisskanninger som viser et langsgående snitt gjennom høyre ekstrapulmonale PV. LA og PV-åpningen vises ikke på bildet og vil være plassert til venstre, mens intrapulmonal PV og tilsvarende lungeparenkym (heller ikke vist) vil være plassert til høyre. (B,C) EDF enkeltfliser skanner av høyre ekstrapulmonal PV. Pilene markerer Cx43+ gapkryss ved kardiomyocyttenes cellulære grenser. De gule pilene indikerer gap-junctions ved polarsidene av kardiomyocytter, kolokalisert med interkalerte skiver, mens de røde pilene indikerer gap-junctions på lateral side av kardiomyocytter. Skalastenger = 50 μm (A), 20 μm (B,C). Forkortelser: PV = lungevene; EDF = utvidet dybdeskarphet; LA = venstre atrium. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Immunfluorescensfarging av kontrollvev. (A) Positiv kontrollfarging av murine LV. Cellekjerner ble farget med Hoechst 33342 (blå); kardiomyocytter ble merket med anti-cTNT antistoff (hvit); og Cx43+ gap junctions ble påvist med anti-Cx43 antistoff (grønn). (B) Negativ kontrollfarging av høyre ekstrapulmonal PV ved bruk av sekundære antistoffer. Cellekjerner er farget med Hoechst 33342 (blå). Skalastenger = 20 μm (A), 50 μm (B). Forkortelser: LV = venstre ventrikkel; PV = lungevene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Filter-kube | Eksitasjon, filter | Emisjonsfilter |
| DAP | 350 / 50 | 460 / 50 |
| L5 | 480 / 40 | 527 / 30 |
| TXR | 560 / 40 | 630 / 75 |
Tabell 1: Eksitasjons- og emisjonsfilteregenskaper for filterkubene Leica DM6 B.
| Sammensatt | Endelig konsentrasjon | g eller ml / 100 ml kreves |
| Fiksering av løsning | ||
| Paraformaldehyd (PFA) 16% | 4% | 25 ml |
| Fosfatbufret saltvann (PBS) 1x konsentrert | 75 ml | |
| Permeabiliseringsløsning | ||
| Triton X-100 | 0.1% | 0,1 ml |
| Fosfatbufret saltvann (PBS) 1x konsentrert | 99,9 ml | |
| Blokkering av buffer | ||
| Normalt går serum (NGS) | 10% | 10 ml |
| Bovint serumalbumin (BSA) | 0.5% | 0,5 mg |
| Mellom 20 | 0.1% | 0,1 ml |
| Fosfatbufret saltvann (PBS) 1x konsentrert | 89,9 ml | |
| Vaske buffer | ||
| Bovint serumalbumin (BSA) | 0.5% | 0,5 mg |
| Mellom 20 | 0,1 ml | |
| Fosfatbufret saltvann (PBS) 1x konsentrert | 99,9 ml | |
Tabell 2: Bufferoppskrifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med denne protokollen deler vi en metode for å skille og isolere PVene i musehjertet og utføre immunfluorescensfarging på dem. Etter organhøstingen ble hjertet og lungene dehydrert i sterilisert sukroseløsning, etterfulgt av separering av ventriklene fra atrium og lungelapper under mikroskopisk veiledning. Etterpå ble hjertebasen forberedt på å visualisere PVene etterfulgt av å kutte dem fra lungene ved hilum. Den påfølgende immunfluorescensfargingen ble utført ved hjelp av en kryoteknikk ved å legge vevet inn i O.C.T.-forbindelsen, skjære det med et kryotom, og utføre immunfluorescensfarging for cTNT og Cx43.
Isolering av PVene kan være nyttig for å studere deres rolle i arytmogenesen av AF. Imidlertid er PV-isolasjon hos mus utfordrende. I tillegg til sin lille størrelse er PVer skjult bak hovedbronkiene og de fremtredende karene ved hjertebasen, og innvikler deres deteksjon massivt. Denne protokollen gir en enkel og gjennomsiktig måte å undersøke murin-PVene på, og tillater en økonomisk tilnærming til å studere deres morfologiske egenskaper i detalj. Den foreslåtte høstings- og forberedelsesmetoden bevarer de anatomiske forholdene mellom PV, de tilsvarende lungelappene og LA, noe som letter undersøkelsene av hele LA-PV-vevskomplekset.
MS har et heterogent arrangement. Signifikant variasjon i kontinuitet og fiberorientering er beskrevet hos flere arter, inkludert rotter og mennesker, og finnes for det meste rundt PV-åpningene 4,20. Disse forskjellene resulterer i anisotrop elektrisk ledning og kan indusere initiering av reentry excitasjoner og autonom aktivitet i PV21. Videre kan den elektriske sammenkoblingen mellom MS og atriemyokard ved LA-PV-krysset føre til overgang av desynkroniserte elektriske impulser fra PVene til venstre atrium, noe som resulterer i AF2. Bevaring av morfologiske proporsjoner ved LA-PV-overgangen er derfor avgjørende for å studere samspillet mellom atriemyokard og PV. For å oppnå dette er nøyaktig identifisering av hovedbronkiene og PA avgjørende. Vi identifiserte landemerkene i henhold til deres anatomiske posisjoner og relasjoner ved hjelp av et mikroskop med 10x forstørrelse og ved systematisk å følge deres kurs fra hjertebasen til LH.
Vi utførte IF-farging av murine PV. Fargetilnærminger basert på immunoreaktive fargestoffer er allment etablert i forskjellige arter og tillater direkte påvisning av målantigener, noe som gir visuell kontrast av høy kvalitet i mikroskopi. Denne tilnærmingen muliggjør både kvalitativ og kvantitativ karakterisering av intakte vevsskiver på proteinnivå. Vi bruker hjerteisotypen av TNT for å skille mellom myokard og ikke-kardial muskulatur. Tilstedeværelsen av kardiomyocytter i PV, samt SVC og IVC er beskrevet tidligere7. Imidlertid inneholder andre rørformede strukturer i lungene, inkludert PA, bronkier og private lungekar, ikke hjertemuskelceller, noe som gjør dem enkle å skille ved IF farging7. Ved å merke strukturproteiner som cTNT, viser kardiomyocytter deres karakteristiske kryssstrikking avhengig av deres orientering mot strålebanen. Retningen av striation kan kartlegges i ImageJ med plugins som OrientationJ eller Directionality Plugin. Dette hjelper til med å kvantifisere og karakterisere retningen til kardiomyocytter og kan være nyttig for å identifisere regioner med anisotrop elektrisk ledning. Videre støtter denne studien tidligere funn om rikelig tilstedeværelse av Cx43 i murine PV-myokardiet, som er organisert på lignende måte som i LV (figur 4A)15,16. Bemerkelsesverdig observerte vi gap-junctions ved lateral membran av kardiomyocytter i murine PV. Denne tilstanden, kjent som lateralisering, har blitt demonstrert som en patofysiologisk mekanisme i AF, spesielt hos hannmus22. Dermed fremhever denne protokollen potensialet for lignende studier i MS-kardiomyocytter fra mus.
PV-isolasjon er en viktig teknikk for arytmiforskning siden den tillater en rekke undersøkelser, inkludert IF-farging, flowcytometri, fluorescensaktivert cellesortering, optisk kartlegging og patchklemme. Men siden den nåværende protokollen ble etablert for IF-avbildning av fast og innebygd vev, mangler direkte bevis på at kardiomyocytter kan isoleres fra PV-preparater i tilstrekkelig kvalitet til å tillate eksperimenter som patchklemme. Suksessen til mikrodisseksjonen avhenger av forskerens erfaring på grunn av den lille størrelsen og skjøtheten i murine hjertevevet. Kvaliteten på IF-avbildning er også i stor grad avhengig av innebyggingstrinnet. Horisontale arrangementer er vanskelige å oppnå, vevsintegriteten til seksjonene kan lide, og PVer kan sprekke hvis de ikke er fylt med O.C.T.-forbindelse. Videre er gyldigheten av protokollen begrenset til 2D-avbildning, da metoden ikke tillater 3D-rekonstruksjon av PV-ene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av det tyske senteret for kardiovaskulær forskning (DZHK; 81X3600221til H.V., 81X2600255 til SC), China Scholarship Council (CSC201808130158 til RX), den tyske forskningsstiftelsen (DFG; Clinician Scientist Program in Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 til P. T.), og Corona Foundation (S199/10079/2019 til SC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
References
- Lippi, G., Sanchis-Gomar, F., Cervellin, G. Global epidemiology of atrial fibrillation: An increasing epidemic and public health challenge. International Journal of Stroke. 16 (2), 217-221 (2021).
- Wijesurendra, R. S., Casadei, B.
- Haïssaguerre, M., et al. Spontaneous initiation of atrial fibrillation by ectopic beats originating in the pulmonary veins. The New England Journal of Medicine. 339 (10), 659-666 (1998).
- Mueller-Hoecker, J., et al. Of rodents and humans: a light microscopic and ultrastructural study on cardiomyocytes in pulmonary veins. International Journal of Medical Sciences. 5 (3), 152-158 (2008).
- Kramer, A. W., Marks, L. S. The occurrence of cardiac muscle in the pulmonary veins of Rodenita. Journal of Morphology. 117 (2), 135-149 (1965).
- Nathan, H., Eliakim, M. The junction between the left atrium and the pulmonary veins. Circulation. 34 (3), 412-422 (1966).
- Nathan, H., Gloobe, H. Myocardial atrio-venous junctions and extensions (sleeves) over the pulmonary and caval veins: Anatomical observations in various mammals. Thorax. 25 (3), 317-324 (1970).
- Bond, R. C., Choisy, S. C., Bryant, S. M., Hancox, J. C., James, A. F. Ion currents, action potentials, and noradrenergic responses in rat pulmonary vein and left atrial cardiomyocytes. Physiological Reports. 8 (9), 14432 (2020).
- Thiagalingam, A., et al. Pulmonary vein contraction: Characterization of dynamic changes in pulmonary vein morphology using multiphase multislice computed tomography scanning. Heart Rhythm. 5 (12), 1645-1650 (2008).
- Spach, M. S., Barr, R. C., Jewett, P. H. Spread of excitation from the atrium into thoracic veins in human beings and dogs. The American Journal of Cardiology. 30 (8), 844-854 (1972).
- Scott McNutt, N., Weinstein, R. S. Membrane ultrastructure at mammalian intercellular junctions. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 26, 45-101 (1973).
- Barr, L., Dewey, M. M., Berger, W. Propagation of action potentials and the structure of the nexus in cardiac muscle. Journal of General Physiology. 48 (5), 797-823 (1965).
- Kawamura, K., Konishi, T. Ultrastructure of the cell junction of heart muscle with special reference to its functional significance in excitation conduction and to the concept of "disease of intercalated disc". Japanese Circulation Journal. 31 (11), 1533-1543 (1967).
- Van Kempen, M. J., Fromaget, C., Gros, D., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Spatial distribution of connexin43, the major cardiac gap junction protein, in the developing and adult rat heart. Circulation Research. 68 (6), 1638-1651 (1991).
- Verheule, S. Tissue structure and connexin expression of canine pulmonary veins. Cardiovascular Research. 55 (4), 727-738 (2002).
- Xiao, Y., et al. Expression of connexin 43, ion channels and Ca2+-handling proteins in rat pulmonary vein cardiomyocytes. Experimental and Therapeutic Medicine. 12 (5), 3233-3241 (2016).
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), (2020).
- Tomsits, P., et al. Medetomidine/midazolam/fentanyl narcosis alters cardiac autonomic tone leading to conduction disorders and arrhythmias in mice. Lab Animal. 52 (4), 85-92 (2023).
- Xia, R., et al. Isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node. Journal of Visualized Experiments. (171), (2021).
- Bredeloux, P., Pasqualin, C., Bordy, R., Maupoil, V., Findlay, I. Automatic activity arising in cardiac muscle sleeves of the pulmonary vein. Biomolecules. 12 (1), 23 (2021).
- Chen, P. S., et al.
- Thibault, S., Ton, A. -T., Huynh, F., Fiset, C. Connexin lateralization contributes to male susceptibility to atrial fibrillation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (18), 10696 (2022).
