Summary
Este protocolo demuestra el aislamiento guiado por microscopía y la tinción por inmunofluorescencia de las venas pulmonares murinas. Preparamos muestras de tejido que contienen la aurícula izquierda, las venas pulmonares y los pulmones correspondientes y las teñimos para troponina T cardíaca y conexina 43.
Abstract
Las venas pulmonares (VP) son la principal fuente de latidos ectópicos en las arritmias auriculares y desempeñan un papel crucial en el desarrollo y la progresión de la fibrilación auricular (FA). Los VP contienen mangas miocárdicas (EM) compuestas por cardiomiocitos. Los SM están implicados en el inicio y mantenimiento de la FA, ya que conservan similitudes con el miocardio cardíaco que funciona, incluida la capacidad de generar impulsos eléctricos ectópicos. Los roedores son ampliamente utilizados y pueden representar excelentes modelos animales para estudiar el miocardio de la vena pulmonar, ya que los cardiomiocitos están ampliamente presentes en toda la pared del vaso. Sin embargo, la microdisección y preparación precisas de las VP murinas es un reto debido al pequeño tamaño de los órganos y a la intrincada anatomía.
Demostramos un protocolo de microdisección guiada por microscopía para aislar la aurícula izquierda murina (AI) junto con los VPs. Se realiza una tinción de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos cardíacos contra la troponina-T (cTNT) y la conexina 43 (Cx43) para visualizar los AL y los VPs en toda su longitud. Las imágenes con aumentos de 10x y 40x proporcionan una visión completa de la estructura de la VP, así como información detallada sobre la arquitectura miocárdica, destacando especialmente la presencia de la conexina 43 dentro de la EM.
Introduction
La fibrilación auricular (FA) es la arritmia sostenida más frecuente1. La prevalencia de la FA está aumentando aún más, con un número esperado de ~17,9 millones de pacientes en Europa en 20601. La FA es clínicamente muy importante, ya que es un factor de riesgo esencial para el desarrollo de infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca o accidente cerebrovascular, lo que resulta en una enorme carga individual, social y socioeconómica1. A pesar de que la FA se conoce desde hace décadas, la fisiopatología de la FA aún no se comprende completamente2.
Ya a finales de la década de 1990, los estudios demostraron el gran impacto de las venas pulmonares (VP) en el inicio y mantenimiento de la FA, ya que son la principal fuente de latidos ectópicos desencadenantes de la FA3. Se ha demostrado que los VP difieren estructuralmente de otros vasos sanguíneos. Mientras que los vasos sanguíneos típicos contienen células musculares lisas, la túnica media de los PV también contiene cardiomiocitos4. En los roedores, esta musculatura cardíaca está presente de forma ubicua en toda la VP, incluidas las partes intra y extrapulmonares, así como en la región del orificio5. En los seres humanos, los VP también contienen cardiomiocitos, que pueden observarse dentro de las extensiones del miocardio de la aurícula izquierda (AI), las llamadas mangas miocárdicas (EM)6,7.
Los SM tienen similitudes morfológicas con el miocardio auricular8. La forma y el tamaño de los cardiomiocitos auriculares y PV no varían significativamente entre sí y muestran propiedades electrofisiológicas comparables8. Los registros electrofisiológicos dentro de la VP han demostrado la actividad eléctrica del SM y las imágenes angiográficas han revelado contracciones sincronizadas con los latidos del corazón 9,10.
Las uniones gap son complejos proteicos formadores de poros compuestos por seis subunidades de conexina, que permiten el paso de iones y moléculas pequeñas11. Existen uniones gap en las aposiciones de célula a célula, interconectan cardiomiocitos vecinos y permiten un acoplamiento eléctrico intercelular entre cardiomiocitos 12,13. Varias isoformas de conexina se expresan en el corazón, siendo la conexina 43 (Cx43) la isoforma más común expresada en todas las regiones del corazón14. Estudios previos proporcionan evidencias de la expresión de Cx43 en cardiomiocitos de los PVs15,16.
Sigue siendo un reto investigar la EM dentro de las VP intactas debido a su delicada estructura, especialmente en modelos animales pequeños. Aquí, demostramos cómo identificar y aislar los PV junto con los lóbulos pulmonares y de LA en ratones mediante microdisección guiada por microscopía. Además, demostramos la tinción por inmunofluorescencia (IF) de los PV para visualizar los cardiomiocitos y sus interconexiones dentro de los PV.
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Protocol
El cuidado de los animales y todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo siguiendo las directrices del Comité de Ética y Cuidado de los Animales de la Universidad Ludwig-Maximilians de Múnich, y todos los procedimientos con ratones fueron aprobados por el Regierung von Oberbayern (ROB 55.2-2532. Vet_02-20-215, ROB 55.2-2532. Vet_02-18-46, ROB 55.2-2532. Vet_02-19-86, ROB 55.2-2532. Vet_02-21-178, ROB 55.2-2532. Vet_02-22-170). Los ratones C57BL6/N se obtuvieron comercialmente.
1. Preparación
- Prepare un gel de agarosa al 3% mezclando 3 mg de agarosa y 100 ml de solución salina tamponada con 1x Tris en un matraz Erlenmeyer de 500 ml. Calentar la solución en un microondas a 600 W durante 2-3 min hasta que el gel se vuelva homogéneo.
- Prepare la placa de disección vertiendo suavemente el gel en una placa de Petri de 100 mm de diámetro. Llene la mitad de la placa de Petri con gel. Elimina las burbujas del gel para garantizar una consistencia homogénea. Deje que la placa de disección se enfríe hasta que el gel se solidifique.
- Prepare todos los tampones y soluciones necesarios, incluida la solución de fijación, la solución de permeabilización, el tampón de bloqueo y el tampón de lavado de acuerdo con las recetas proporcionadas en la Tabla 1.
2. Extracción de órganos y preparación de tejidos
NOTA: Un protocolo extenso que detalla el procedimiento de anestesia en ratones y la extracción del corazón ha sido publicado previamente17,18. Por lo tanto, presentamos solo una breve descripción de esa parte. Los experimentos se realizaron en ratones C57BL6 de 12 a 16 semanas de edad (seis machos y cuatro hembras). El peso corporal del macho se extendió de 26 g a 28 g y el peso corporal de la hembra de 19 g a 22 g. Los siguientes pasos se realizaron sin inyección sistémica previa de heparina.
- Anestesiar al ratón con isoflurano (5%, 95% de oxígeno, Flujo: 1 L/min) y asegurar una profundidad de anestesia suficiente.
- Transfiera el ratón a la mesa de operaciones colocándolo en posición supina. Mantener la narcosis con inhalación de isoflurano (2%, 98% de oxígeno, Flujo: 1 L/min) a través de una máscara de anestesia y fijar el ratón con cinta adhesiva en sus extremidades. Inyectar fentanilo para analgesia (0,1 mg/25 g de peso corporal i.p.).
- Levante el pelaje en la apófisis xifoidal y establezca un corte transversal de 2 mm. Desconecte el pelaje de la fascia subcutánea mediante una disección roma (parte posterior de las tijeras) y extienda el corte craneal y lateralmente para exponer el tórax.
- Abra con cuidado el abdomen caudal hasta el arco costal. Levante ligeramente la apófisis xifoides para incidir el diafragma desde la caudal y hacer que los pulmones colapsen. Luego, corte el diafragma de izquierda a derecha sin lesionar ningún órgano y abra el tórax bilateralmente para exponer el corazón.
- Cortar la vena cava inferior (VCI) mientras el corazón aún está latiendo para desangrar al ratón y proceder a perfundir el corazón penetrando en el ventrículo izquierdo con una aguja de 27 G e inyectando 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x helada.
- Después de eliminar la sangre del corazón del ratón, localice el arco aórtico, la vena cava superior (VCS) y la tráquea. Córtelos ~ 3 mm por encima de la base del corazón y extraiga el corazón junto con los pulmones conectados.
- Sumerja los órganos extraídos en un tubo cónico de 10 ml que contenga 2 ml de solución esterilizada de sacarosa al 30%. Dejar que las muestras se deshidraten durante 24 h a 4 °C.
3. Preparación guiada por microscopía de LA y PV
- Coloque el corazón y los pulmones deshidratados en una placa de disección que contenga 40-50 ml de 1x PBS. Colóquelo bajo un microscopio de campo brillante con un aumento de 10x y configure la iluminación. Coloque el corazón con su superficie dorsal sobre la placa de disección. Identifique la transición entre la pared ventricular y auricular, y separe cuidadosamente los ventrículos de las aurículas con unas tijeras quirúrgicas.
NOTA: Cortar aproximadamente 1 mm por debajo de las aurículas para conservar algo de tejido ventricular. Esto será necesario más adelante para fijar las aurículas a la placa de disección sin dañar las estructuras en la base del corazón. Sugerimos conservar los ventrículos, ya que se pueden utilizar como una muestra de control positivo. Para incrustar el tejido ventricular, siga el mismo procedimiento descrito para la inclusión de los VP, como se describe en la Sección 4. - Coloque las aurículas separadas con la superficie de corte ventricular (paso 3.1) en la placa de disección de modo que la base del corazón quede hacia arriba. Oriente las aurículas de modo que los lóbulos pulmonares sean posteriores, la AI y la orejuela auricular izquierda (LAA) estén a la derecha, y la aurícula derecha (AR) y la orejuela auricular derecha (ARA) estén a la izquierda. Fije la preparación fijando el tejido ventricular izquierdo restante a la placa de disección. Extienda suavemente los lóbulos pulmonares sin aplicar una fuerza excesiva y fíjelos con alfileres en la placa de disección (Figura 1A).
- Obtenga una visión general de los puntos de referencia anatómicos en la base del corazón.
- Encuentre la aorta con el arco aórtico en el centro de la base del corazón.
- Detectar el tronco pulmonar (TP) directamente a la derecha de la aorta y seguir su curso hacia la parte posterior para distinguir las arterias pulmonares (AP). Verifique su ubicación siguiendo su curso hasta el lóbulo izquierdo y los lóbulos superior/medio derecho para encontrar el hilio pulmonar (LH) correspondiente.
- Determinar la posición de la tráquea y/o de los bronquios principales izquierdo y derecho (L Br, R Br), que se encuentran posteriores a la aorta, y verificar su ubicación siguiendo su curso hacia la LH (Figura 1A).
- Encuentre el VCS a la izquierda de la aorta y verifíquelo siguiendo su curso hacia la AR junto al RAA.
- Elimine el tejido conectivo y graso alrededor de la base del corazón mientras conserva todos los puntos de referencia identificados mencionados anteriormente. Además, retire el arco aórtico y la tráquea para tener una vista libre de la base del corazón (Figura 1B).
- Separe suavemente los PA de la superficie superior de la aurícula mediante una disección roma con pinzas finas. Después, córtelos a la izquierda y gírelos hacia un lado para exponer la pared libre de la aurícula izquierda (LAFW) y los PV en toda su dimensión. Cortar los bronquios principales de la LH y extirpar el tejido bronquial (Figura 1C).
NOTA: La LH sirve como punto de entrada común para las AP y las vías respiratorias hacia los pulmones, así como el punto de salida para las VP. Es importante realizar todos los procedimientos en la LH con cuidado para evitar cualquier daño a los PV. - Para separar la LA/AR y el ventrículo izquierdo y derecho (VI, VD), realice un corte comenzando desde la parte anterior del VD restante hacia arriba a través de la válvula tricúspide (TV) hasta el lado anterior de la VCS para abrir la AR desde el lado frontal. Cortar la pared posterior libre de AR (RAFW) junto al tabique interauricular para separar la AR y la LA. Cortar la pared posterior del ventrículo derecho junto al tabique interventricular para cortar completamente el VI y el VD.
NOTA: Previamente se ha publicado un extenso protocolo que describe en detalle el procedimiento de preparación y aislamiento de la aurícula derecha19. La separación de la AR es útil para eliminar el tejido no deseado del complejo tisular LA-PV y para recolectar tejido para experimentos adicionales. - Reduzca el tamaño de los lóbulos pulmonares cortando parte del tejido pulmonar basal para que queden aproximadamente 3-4 mm de tejido pulmonar.
NOTA: Conserve los ápices de los lóbulos pulmonares, ya que sirven como flotadores durante los pasos de inclusión posteriores y permiten la incrustación de los PV horizontalmente en el compuesto O.C.T.
4. Inclusión de tejidos
- Transfiera la preparación, incluidos los LA y los PV, a un criomolde, asegurándose de que la base del corazón y el ápice pulmonar estén hacia arriba. Colóquelos en una configuración fisiológica: asegúrese de que los PV no se retuerzan ni se volteen.
- Llene el criomold con compuesto O.C.T. y comprima suavemente los PV con pinzas finas para eliminar el aire restante. Mantener inalterada su configuración fisiológica durante todo el proceso.
- Coloque el criomold con el tejido incrustado en hielo seco para congelar el compuesto OCT. Almacene las muestras a -80 °C para su uso futuro.
NOTA: Es crucial mantener los PV en posición horizontal para garantizar la obtención de secciones que contengan PV en toda su longitud para los procedimientos posteriores.
5. Corte y recolección de secciones de tejido congelado
NOTA: Para cortar los bloques de tejido, la configuración de la máquina se ajustó a una temperatura de la muestra de -18 °C y una temperatura de la cuchilla de -25 °C.
- Instale un bloque de tejido en el soporte de la muestra aplicando una capa de compuesto O.C.T. entre el bloque de tejido y el soporte de la muestra. Congélalos durante 3-4 min.
- Bloquee el cabezal de la muestra y cargue el soporte de la muestra con el bloque de tejido en la cabeza de la muestra cerrando la palanca de liberación del mandril de la muestra. Ajuste con precisión la posición del bloque de tejido con las perillas de ajuste fino.
- Retire el criomold de la muestra. Desbloquee el cabezal de la muestra y el freno eléctrico del criostato.
- Configure el criostato en modo de recorte con un tamaño de recorte entre 30 μm y 50 μm. Recorte la muestra de tejido hasta que los PV se vuelvan visibles.
- Cambie al modo de corte de sección fina y ajuste el grosor a 10 μm. Comience a recolectar secciones, incluidas las VP y el tejido pulmonar y auricular conectado. Recoja las secciones con una placa estabilizadora o fijando el extremo libre de cada sección al portacuchillas con un cepillo fino y frío y extiéndalas.
- Coloque un portaobjetos (mantenido a temperatura ambiente) adyacente a la sección. Suelte con cuidado la sección del cepillo, permitiendo que la sección se adhiera naturalmente al portaobjetos, ya que la sección congelada y el compuesto O.C.T. se derriten al tocar la superficie más cálida del portaobjetos.
NOTA: Mantenga una condición estable y suave durante el proceso de corte para evitar rupturas o pliegues en las secciones. Reemplace la cuchilla por una nueva si es necesario. - Recopila hasta tres secciones en cada diapositiva. Etiquete los portaobjetos y guárdelos a -20 °C.
NOTA: Recomendamos recolectar al menos cinco secciones (equivalentes a dos diapositivas) para cada PV.
6. Tinción por inmunofluorescencia de criosecciones de los PV
- Coloque los portaobjetos congelados en un sistema de tinción y deje que las secciones se descongelen durante aproximadamente 20 minutos a temperatura ambiente.
NOTA: Llene el sistema de tinción con agua para mantener las muestras humidificadas. El secado del tejido puede dañar los antígenos, causando la unión de anticuerpos inespecíficos y artefactos de tinción excesiva durante los procedimientos de tinción. - Después de 20 min de descongelación, cubra las secciones con unas gotas de solución de fijación (paraformaldehído [PFA] al 4%, Tabla 1) para fijar el tejido en los portaobjetos durante 10 min a temperatura ambiente.
- Después de la fijación, transfiera los portaobjetos a la rejilla vertical de portaobjetos y sumérjalos en un recipiente lleno de 1x PBS. Coloque el recipiente en una coctelera a baja velocidad y lave los portaobjetos durante 5 min. Repita este ciclo de lavado dos veces más, usando 1x PBS nuevo cada vez.
- Después del lavado, encierre en un círculo cada sección individual de cada portaobjetos con un rotulador bloqueador de líquidos que contenga xilol. Reorganice los portaobjetos en el sistema de tinción y aplique 1 o 2 gotas de solución de permeabilización (Triton X-100 al 0,1 %, Tabla 1) sobre cada muestra con una pipeta Pasteur. Deje que las secciones se incuben a temperatura ambiente durante 10 minutos para permeabilizar la célula y las membranas de los orgánulos celulares.
- Después de la permeabilización, retire la solución de Triton X-100 al 0,1 % lavando los portaobjetos durante 3 x 5 min en 1x PBS, siguiendo el mismo procedimiento descrito en el paso 6.3.
- Después del lavado, reorganice los portaobjetos en el sistema de tinción y aplique 1 o 2 gotas del tampón de bloqueo (Tabla 1) a cada sección, asegurándose de que estén completamente cubiertas con el tampón de bloqueo. Deje que los portaobjetos se incuben durante 1 h a temperatura ambiente.
- Preparar 1 ml de la mezcla primaria de anticuerpos pipeteando 5 μl de un anticuerpo anti-cTNT de ratón (diluido 1:200) y 1 μl de un anticuerpo anti-Cx43 de conejo (diluido 1:1.000) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml lleno de 994 μl de tampón de bloqueo. Pipetee la mezcla hacia arriba y hacia abajo para asegurar una mezcla completa.
NOTA: Ajuste la cantidad de mezcla de anticuerpos aplicada de acuerdo con el tamaño de la sección. Asegúrese de que las secciones estén completamente cubiertas por la mezcla de anticuerpos. La concentración, el tiempo de incubación y la temperatura óptima de incubación de los anticuerpos pueden variar en función de factores como el tipo de anticuerpo, los clones de anticuerpos y las características de los tejidos. Recomendamos probar y optimizar las condiciones de tinción individualmente para cada anticuerpo. - Después del paso de bloqueo (paso 6.6), retire el tampón de bloqueo restante y aplique directamente 2 o 3 gotas de la mezcla de anticuerpos primarios en cada sección. Deje que los portaobjetos se incuben durante la noche a 4 °C.
- Después de la incubación primaria de anticuerpos, lave los portaobjetos durante 3 x 5 minutos con tampón de lavado bajo una agitación suave (Tabla 1).
- Prepare 1 ml de la mezcla de anticuerpos secundarios pipeteando 1 μl de un anticuerpo secundario antiratón de cabra conjugado con AF488 (diluido 1:1.000) y 1 μl de un anticuerpo secundario anticonejo de cabra conjugado con AF568 (diluido 1:1.000) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml lleno de 998 μl de tampón de lavado. Pipetea la mezcla hacia arriba y hacia abajo para que se mezcle bien.
- Después del paso de lavado (paso 6.9), reorganice los portaobjetos en el sistema de tinción y aplique 2 o 3 gotas de la mezcla de anticuerpos secundarios en cada sección con una pipeta. Deje que los anticuerpos se incuben durante 45 minutos a temperatura ambiente mientras protege las muestras de la luz para evitar que se apaguen los fluoróforos. Después de la incubación secundaria de anticuerpos, lavar los portaobjetos durante 3 x 5 minutos con tampón de lavado bajo una suave agitación (Tabla 1).
- Reorganice los portaobjetos en el sistema de tinción. Contratiñir las secciones con Hoechst-33342 (en una dilución de 1:1.000 en 1x PBS) aplicando de 2 a 3 gotas de la solución de Hoechst-33342 en cada sección. Deje que los portaobjetos se incuben durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Después de la incubación, lave los portaobjetos 3 x 5 min con tampón de lavado bajo una suave agitación (Tabla 1). Monte las guías aplicando 1 o 2 gotas de medio de montaje fluorescente en cada guía. Cubra los portaobjetos con cubreobjetos.
NOTA: Asegúrese de que el cubreobjetos esté plano al colocarlo. Si hay burbujas de aire, aplique presión suavemente en el costado de la burbuja para eliminarlas. - Guarde las guías montadas en un protector de diapositivas a 4 °C.
NOTA: Se recomienda tomar imágenes de las diapositivas lo antes posible. Este protocolo no es válido exclusivamente para los anticuerpos mencionados. Los antígenos diana y los anticuerpos pueden sustituirse o modificarse de acuerdo con los requisitos individuales del experimento o con estrategias alternativas de detección de antígenos.
7. Obtención de imágenes de los cortes de tinción de inmunofluorescencia
- Configura el microscopio.
- Encienda el microscopio con la fuente de luz láser, la computadora conectada y el software que lo acompaña siguiendo el manual del fabricante.
- Entra en el menú Configuración . Haga clic para seleccionar el tipo de cámara adecuado para la obtención de imágenes de fluorescencia (por ejemplo, DFC365FX cámara monocromática).
- Entra en el menú Adquirir y crea tres canales.
- Seleccione el canal FCr1 para la detección de Hoechst-33342, etiquételo y seleccione el cubo de filtro DAP en la sección de selección. Ajuste el tiempo de exposición a 200 ms, la ganancia electrónica a 2 y la intensidad de la luz al 17%.
- Seleccione el canal FCr2 para la detección de cTNT (teñido con anticuerpo conjugado AF488), etiquételo y seleccione el cubo de filtro L5 en la sección de selección. Ajuste el tiempo de exposición a 200-300 ms, la ganancia electrónica a 1,8 y la intensidad de la luz al 100%.
- Seleccione el canal FCr3 para la detección de Cx43 (teñido con anticuerpo conjugado AF568), etiquételo y seleccione el cubo de filtro TXR en la sección de selección. Ajuste el tiempo de exposición a 150 ms, la ganancia electrónica a 2 y la intensidad de la luz al 100%.
NOTA: Las características espectrales de los cubos de filtro se enumeran en la Tabla 2.
- Cargue el portaobjetos en la platina del microscopio.
- Realice una imagen general con un aumento de 10x:
- Seleccione el objetivo de 10x y abra el obturador láser haciendo clic en Live. Con el canal FCr1 seleccionado, utilice la función de navegador para navegar por la diapositiva hasta que se detecte una señal. Enfoque aproximadamente la muestra hasta que se distingan los núcleos celulares.
- Inicie el modo de escaneo en espiral para capturar una vista previa completa de la muestra. Desactívalo en vivo haciendo clic en el botón de nuevo para proteger el espécimen. Identificar la LA, las VP y el tejido pulmonar.
- Defina el área de interés para el escaneo de mosaico posterior; Seleccione varios puntos de enfoque dentro del área de interés. Haga clic en En vivo en el canal FCr1 y ajuste el enfoque para cada punto de enfoque. Guarde las posiciones Z correspondientes, que representan la posición de enfoque exacta para cada punto de enfoque. Inicie el escaneo de mosaicos con un aumento de 10x para capturar una imagen general completa de la muestra.
- Una vez finalizado el escaneo, abra el escaneo de mosaico y combine las imágenes individuales. Para mejorar el brillo y el contraste de los canales individuales, selecciónelos en la barra de objetos y ajuste su rango de señal con los controles deslizantes como desee.
- Obtenga imágenes ampliadas con un aumento de 40x :
- Seleccione el objetivo 40x. Ajuste el tiempo de exposición y la configuración de ganancia para cada canal de la siguiente manera: FCr1: Cubo de filtro DAP: tiempo de exposición: 50 ms, ganancia: 1,5; FCr2: Cubo de filtro L5: tiempo de exposición: 80 ms, ganancia: 1,8; FCr3: Cubo de filtro TXR: tiempo de exposición: 20 ms, ganancia: 2.
- Utilice la imagen general del paso 7.3 para localizar el orificio de la VP (PVO), así como las regiones de PV extrapulmonar e intrapulmonar (PVex, PVin). Defina esta área que se va a escanear.
- Abra el submenú Imagen y haga clic en z para activar Z-Stack.
- Seleccione el canal FCr1 y abra el obturador láser para obtener una vista previa en vivo .
- Vaya al submenú Z-Stack y determine los puntos de inicio y fin de Z-Stack girando laperilla de ajuste fino de la pila en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj hasta que la señal general comience a perder el foco.
- Después de configurar el rango de enfoque, seleccione el modo Z-Stack optimizado para el sistema y active la opción calcular imágenes de profundidad de campo extendida (EDF). Dependiendo de lo plano que sea el tejido, espere aproximadamente 20 capas con un intervalo de paso de aproximadamente 0,5 μm.
- Comience el escaneo de mosaicos. Después de escanear, abra el escaneo de mosaico y combine solo la imagen EDF. Para mejorar el brillo y el contraste de los canales individuales, selecciónelos en la barra de objetos y ajuste su rango de señal con los controles deslizantes como desee (consulte el paso 7.3.4).
- Después de generar las imágenes, guarde el proyecto y exporte tanto la versión combinada como los canales sin procesar de cada imagen como un archivo TIFF.
NOTA: Guardar los archivos como TIFF legible por ImageJ permite a ImageJ importar el tamaño de tesela original en μm en lugar de píxeles. Cierre siempre el obturador láser siempre que no se necesite una señal láser para evitar el fotoblanqueo de los anticuerpos secundarios.
8. Edición de imágenes con ImageJ
- Cargue los archivos de canal sin procesar correspondientes en ImageJ. Haga clic en la imagen | Color | Combine y elija el color deseado para cada canal.
- Para crear una barra de escala, seleccione Analizar | Herramientas | Barra de escala y pégala en la esquina inferior derecha. Proceda con el procesamiento y análisis posteriores de acuerdo con los requisitos de la imagen. Guarde las imágenes combinadas cuando haya terminado.
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Representative Results
Realizamos la microdisección, tinción e imágenes de los PV en 10 ratones de 12 a 16 semanas de edad. Siguiendo el protocolo, microdiseccionamos con éxito los VP junto con el AL en todos los ratones experimentales y obtuvimos secciones con una visión completa de los VP en ocho ratones. Se tomaron imágenes generales con un aumento de 10x para identificar la región del orificio de la VP (PVO) en la unión LA-PV, las VP extrapulmonares (PVex) (VP entre el hilio pulmonar y la unión LA-PV) y las VP intrapulmonares (PVen) (VP rodeadas de tejido pulmonar) (Figura 2). Las imágenes ampliadas de las regiones mencionadas se obtuvieron con un objetivo de aumento de 40x (Figura 3).
Encontramos señales específicas de cTNT con una estría muscular típica en el PVO, el PVex y el PVen (Figura 3). Cx43 se encontró en las tres regiones PV y se proyectó principalmente entre cardiomiocitos vecinos (Figura 3 y Figura 4A). Se observaron señales relacionadas con Cx43 tanto en el lado polar (Figura 3, flechas amarillas) como en el lado lateral de los cardiomiocitos en el MS (Figura 3, flechas rojas).
Figura 1: Identificación de venas pulmonares murinas bajo el microscopio. Microscopía de campo claro (aumento de 10x). El corazón está fijado a la placa de disección con cuatro clavos en la aurícula, el lóbulo pulmonar izquierdo, el lóbulo pulmonar medio derecho y el lóbulo pulmonar inferior derecho. (A) Visión general de la base del corazón después de separar el tejido ventricular de la aurícula con el arco aórtico en el medio. El atrio se encuentra en la parte inferior; Los lóbulos pulmonares se extienden en la mitad superior de la imagen. Los VP están ocultos por el AA, los bronquios principales y los PA. (B) Imagen de vista superior de la base del corazón después de extirpar la tráquea, partes de los bronquios principales, el arco aórtico, así como el tejido conectivo y graso. Los PA en el centro de la imagen muestran su curso completo desde el TP hasta el LH y cubren los VP. (C) Imagen de vista superior de los VP después de cortar los PA de los lóbulos pulmonares y extirpar el tejido bronquial extrapulmonar. Barras de escala = 5 mm. Abreviaturas: AA = arco aórtico; AscA = aorta ascendente; VCI = vena cava inferior; L Br = bronquio principal izquierdo; L PV = vena pulmonar izquierda; LA-PV J = unión aurícula izquierda-vena pulmonar; OAI = orejuela auricular izquierda; LAFW = pared libre de la aurícula izquierda; LH = hilio pulmonar; L. LL = lóbulo pulmonar izquierdo; AP = arterias pulmonares; PT = tronco pulmonar; R Br = bronquio principal derecho; R PV = vena pulmonar derecha; R-A PV = vena pulmonar ascendente derecha; RAA = orejuela auricular derecha; R. acc. LL = lóbulo pulmonar accesorio derecho; R. inf. LL = lóbulo pulmonar inferior derecho; R. mid. LL = lóbulo pulmonar medio derecho; R. sup. LL = lóbulo pulmonar superior derecho; VCS = vena cava superior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Vista general de las venas pulmonares del ratón adulto y de la aurícula izquierda en una imagen de sección transversal mediante microscopía de inmunofluorescencia. Los núcleos celulares se tiñeron con Hoechst-33342 (azul); los cardiomiocitos se marcaron con anticuerpos anti-cTNT (blancos); y las uniones gap se detectaron utilizando el anticuerpo anti-Cx43 (verde). Los rectángulos blancos resaltan las siguientes regiones: a, orificio PV (PVO); b, VP extrapulmonar (PVex); y c, VP intrapulmonar (PVin). Barra de escala = 500 μm. Abreviaturas: L PV = vena pulmonar izquierda; OAI = orejuela auricular izquierda; LAFW = pared libre de la aurícula izquierda; LV-EP = ventrículo izquierdo - vía de eyección; R PV = vena pulmonar derecha; R-A PV = vena pulmonar ascendente derecha; VD = Ventrículo derecho. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Vista ampliada del miocardio PV derecho mediante microscopía de inmunofluorescencia. Los núcleos celulares se tiñeron con Hoechst-33342 (azul); los cardiomiocitos se marcaron con anticuerpos anti-cTNT (blancos); y las uniones gap Cx43+ se detectaron mediante el anticuerpo anti-Cx43 (verde). (A) Escaneos de baldosas EDF que muestran una sección longitudinal a través de la VP extrapulmonar derecha. El orificio de la LA y la VP no se muestran en la imagen y se ubicarían a la izquierda, mientras que la VP intrapulmonar y el parénquima pulmonar correspondiente (tampoco se muestran) se ubicarían a la derecha. (B,C) Escaneos de EDF de una sola baldosa de la VP extrapulmonar derecha. Las flechas resaltan las uniones gap Cx43+ en los bordes celulares de los cardiomiocitos. Las flechas amarillas indican uniones gap en los lados polares de los cardiomiocitos, colocalizadas con discos intercalados, mientras que las flechas rojas indican uniones gap en el lado lateral de los cardiomiocitos. Barras de escala = 50 μm (A), 20 μm (B,C). Abreviaturas: PV = vena pulmonar; EDF = profundidad de campo ampliada; LA = aurícula izquierda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Tinción por inmunofluorescencia del tejido control. (A) Tinción de control positivo del VI murino. Los núcleos celulares se tiñeron con Hoechst 33342 (azul); los cardiomiocitos se marcaron con anticuerpos anti-cTNT (blancos); y se detectaron uniones gap Cx43+ con anticuerpo anti-Cx43 (verde). (B) Tinción de control negativo de la VP extrapulmonar derecha mediante el uso exclusivo de anticuerpos secundarios. Los núcleos celulares se tiñen con Hoechst 33342 (azul). Barras de escala = 20 μm (A), 50 μm (B). Abreviaturas: VI = ventrículo izquierdo; VP = vena pulmonar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Cubo de filtro | Filtro de excitación | Filtro de emisiones |
| DAP | 350 / 50 | 460 / 50 |
| L5 | 480 / 40 | 527 / 30 |
| TXR | 560 / 40 | 630 / 75 |
Tabla 1: Características del filtro de excitación y emisión de los cubos de filtro Leica DM6 B.
| Compuesto | Concentración final | g o mL / 100 mL requerido |
| Solución de fijación | ||
| Paraformaldehído (PFA) 16% | 4% | 25 mL |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x concentrada | 75 mL | |
| Solución de permeabilización | ||
| Tritón X-100 | 0.1% | 0,1 ml |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x concentrada | 99.9 mL | |
| Búfer de bloqueo | ||
| Suero normal (NGS) | 10% | 10 mL |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | 0.5% | 0,5 mg |
| Preadolescente 20 | 0.1% | 0,1 ml |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x concentrada | 89.9 mL | |
| Tampón de lavado | ||
| Albúmina sérica bovina (BSA) | 0.5% | 0,5 mg |
| Preadolescente 20 | 0,1 ml | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x concentrada | 99.9 mL | |
Tabla 2: Recetas tampón.
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Discussion
Con este protocolo, compartimos un método para distinguir y aislar las VPs del corazón del ratón y realizar tinciones de inmunofluorescencia sobre ellas. Después de la extracción de órganos, el corazón y los pulmones se deshidrataron en una solución de sacarosa esterilizada, seguida de la separación de los ventrículos de la aurícula y los lóbulos pulmonares bajo guía microscópica. Posteriormente, se preparó la base del corazón para visualizar los VP y luego se cortaron de los pulmones en el hilio. La posterior tinción de inmunofluorescencia se realizó mediante criotécnica mediante la inclusión del tejido en el compuesto O.C.T., el corte con un criotomo y la realización de la tinción de inmunofluorescencia para cTNT y Cx43.
El aislamiento de los VP puede ser útil para estudiar su papel en la arritmogénesis de la FA. Sin embargo, el aislamiento de la energía fotovoltaica en ratones es un reto. Además de su pequeño tamaño, los PV están ocultos detrás de los bronquios principales y los vasos prominentes en la base del corazón, lo que complica enormemente su detección. Este protocolo proporciona una forma sencilla y transparente de investigar las PV murinas y permite un enfoque económico para estudiar sus características morfológicas en detalle. El enfoque de recolección y preparación propuesto preserva las relaciones anatómicas entre los PV, los lóbulos pulmonares correspondientes y la LA, lo que facilita las investigaciones de todo el complejo tisular LA-PV.
Los EM tienen una disposición heterogénea. Se ha descrito una variabilidad significativa en la continuidad y la orientación de las fibras en múltiples especies, incluidas ratas y humanos, y se encuentran principalmente alrededor de los orificios de PV 4,20. Esas diversidades dan lugar a una conducción eléctrica anisotrópica y pueden inducir el inicio de excitaciones de reentrada y actividad autonómica en las PV21. Además, la interconexión eléctrica entre la EM y el miocardio auricular en la unión LA-PV puede conducir a la transición de impulsos eléctricos desincronizados de las VP a la aurícula izquierda, lo que da lugar a FA2. Por lo tanto, preservar las proporciones morfológicas en la unión LA-PV es crucial para estudiar la interacción entre el miocardio auricular y los VP. Para lograr esto, la identificación precisa de los bronquios principales y las AP es esencial. Identificamos los puntos de referencia de acuerdo con sus posiciones y relaciones anatómicas utilizando un microscopio con aumento de 10x y siguiendo sistemáticamente su curso desde la base del corazón hasta la LH.
Se realizó la tinción de FI de los PV murinos. Los enfoques de tinción basados en colorantes inmunorreactivos están ampliamente establecidos en diferentes especies y permiten la detección directa de antígenos diana, proporcionando un contraste visual de alta calidad en microscopía. Este enfoque permite la caracterización cualitativa y cuantitativa de cortes de tejido intactos a nivel proteico. Utilizamos el isotipo cardíaco de TNT para distinguir entre la musculatura miocárdica y la no cardíaca. La presencia de cardiomiocitos en las VP, así como en la VCS y la VCI ha sido descrita previamente7. Sin embargo, otras estructuras tubulares de los pulmones, incluidos los PA, los bronquios y los vasos pulmonares privados, no contienen células del músculo cardíaco, lo que hace que sean fáciles de distinguir por la tinción de FI7. Al marcar proteínas de estructura como cTNT, los cardiomiocitos muestran su estría cruzada característica dependiendo de su orientación hacia la trayectoria del haz. La dirección de la estría se puede mapear en ImageJ con complementos como OrientationJ o Directionality Plugin. Esto ayuda a cuantificar y caracterizar la direccionalidad de los cardiomiocitos y podría ser útil para identificar regiones con conducción eléctrica anisotrópica. Además, este estudio apoya los hallazgos previos sobre la abundante presencia de Cx43 en el miocardio murino PV, que se organiza de manera similar al VI (Figura 4A)15,16. Sorprendentemente, observamos uniones gap en la membrana lateral de los cardiomiocitos en las VP murinas. Esta condición, conocida como lateralización, ha sido demostrada como un mecanismo fisiopatológico en la FA, especialmente en ratones machos22. Por lo tanto, este protocolo destaca el potencial de estudios similares en cardiomiocitos de EM de ratón.
El aislamiento de PV es una técnica importante para la investigación de arritmias, ya que permite una serie de investigaciones, incluida la tinción de IF, la citometría de flujo, la clasificación de células activadas por fluorescencia, el mapeo óptico y la pinza de parche. Sin embargo, dado que se estableció el protocolo actual para la obtención de imágenes de FI de tejido fijo e incrustado, actualmente no hay pruebas directas de que los cardiomiocitos puedan aislarse de preparaciones de PV con una calidad suficiente para permitir experimentos como la pinza de parche. El éxito de la microdisección depende de la experiencia del investigador debido al pequeño tamaño y fragilidad del tejido cardíaco murino. La calidad de las imágenes de FI también depende en gran medida del paso de inclusión. Los arreglos horizontales son difíciles de lograr, la integridad tisular de las secciones puede verse afectada y los PV pueden romperse si no se llenan con compuesto O.C.T. Además, la validez del protocolo se limita a las imágenes en 2D, ya que el método no permite la reconstrucción en 3D de los PV.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Este trabajo contó con el apoyo del Centro Alemán de Investigación Cardiovascular (DZHK; 81X3600221 a H.V., 81X2600255 a S.C.), el Consejo de Becas de China (CSC201808130158 a R.X.), la Fundación Alemana de Investigación (DFG; Programa de Científicos Clínicos en Medicina Vascular (PRIME), MA 2186/14-1 a P. T.), y la Fundación Corona (S199/10079/2019 a S. C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
References
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