Summary
Dit protocol demonstreert microscopiegeleide isolatie en immunofluorescentiekleuring van longaders van muizen. We bereiden weefselmonsters voor die het linker atrium, de longaders en de bijbehorende longen bevatten en kleuren ze voor cardiale troponine T en Connexin 43.
Abstract
Longaderen (PV's) zijn de belangrijkste bron van ectopische slagen bij atriale aritmieën en spelen een cruciale rol bij de ontwikkeling en progressie van atriale fibrillatie (AF). PV's bevatten myocardiale hulzen (MS) die zijn samengesteld uit cardiomyocyten. MS zijn betrokken bij het initiëren en onderhouden van AF, omdat ze overeenkomsten behouden met het cardiale werkende myocardium, inclusief het vermogen om ectopische elektrische impulsen te genereren. Knaagdieren worden veel gebruikt en kunnen uitstekende diermodellen zijn om het myocardium van de longader te bestuderen, aangezien cardiomyocyten overal in de vaatwand aanwezig zijn. Nauwkeurige microdissectie en bereiding van muizen PV's is echter een uitdaging vanwege de kleine orgaangrootte en ingewikkelde anatomie.
We demonstreren een microscopie-geleid microdissectieprotocol voor het isoleren van het linker atrium (LA) van de muizen samen met de PV's. Immunofluorescentiekleuring met behulp van cardiale troponine-T (cTNT) en connexine 43 (Cx43) antilichamen wordt uitgevoerd om de LA en PV's in volledige lengte te visualiseren. Beeldvorming met een vergroting van 10x en 40x biedt een uitgebreid beeld van de PV-structuur en gedetailleerde inzichten in de myocardiale architectuur, waarbij met name de aanwezigheid van connexine 43 in de MS wordt benadrukt.
Introduction
Boezemfibrilleren (AF) is de meest voorkomende aanhoudende aritmie1. De prevalentie van AF neemt nog verder toe met een verwacht aantal van ~17,9 miljoen patiënten in Europa in 20601. AF is klinisch zeer belangrijk omdat het een essentiële risicofactor is voor de ontwikkeling van een hartinfarct, hartfalen of beroerte, wat resulteert in een enorme individuele, sociale en sociaaleconomischelast. Hoewel AF al tientallen jaren bekend is, wordt de pathofysiologie van AF nog steeds niet volledig begrepen.
Al in de late jaren 1990 toonden studies de grote impact aan van longaders (PV's) bij het initiëren en behouden van AF, aangezien ze de belangrijkste bron zijn van AF-triggerende ectopische slagen3. Het is aangetoond dat PV's structureel verschillen van andere bloedvaten. Terwijl typische bloedvaten gladde spiercellen bevatten, bevatten de tunica media van PV's ook cardiomyocyten4. Bij knaagdieren is deze hartmusculatuur alomtegenwoordig aanwezig in de hele PV's, inclusief intra- en extrapulmonale delen, evenals in het openingsgebied5. Bij mensen bevatten PV's ook cardiomyocyten, die kunnen worden waargenomen in verlengstukken van het linker atriale (LA) myocardium, de zogenaamde myocardiale mouwen (MS)6,7.
MS hebben morfologische overeenkomsten met het atriale myocardium8. De vorm en grootte van atriale en PV-cardiomyocyten verschillen niet significant tussen elkaar en vertonen vergelijkbare elektrofysiologische eigenschappen8. Elektrofysiologische opnames in de PV hebben de elektrische activiteit van MS bewezen, en angiografische beeldvorming heeft weeën onthuld die synchroon lopen met de hartslag 9,10.
Gap junctions zijn porievormende eiwitcomplexen die zijn samengesteld uit zes connexine-subeenheden, die de doorgang van ionen en kleine moleculen mogelijk maken11. Er bestaan gap-juncties in de cel-tot-cel-apposities, die naburige cardiomyocyten met elkaar verbinden en een intercellulaire elektrische koppeling tussen cardiomyocyten mogelijkmaken 12,13. Verschillende connexine-isovormen worden tot expressie gebracht in het hart, waarbij connexine 43 (Cx43) de meest voorkomende isovorm is die tot expressie komt in alle regio's van het hart14. Eerdere studies leveren bewijs voor de expressie van Cx43 in cardiomyocyten van de PV's15,16.
Het blijft een uitdaging om MS in intacte PV's te onderzoeken vanwege hun delicate structuur, vooral in kleine diermodellen. Hier demonstreren we hoe PV's samen met LA en longkwabben bij muizen kunnen worden geïdentificeerd en geïsoleerd met behulp van microscopiegeleide microdissectie. Daarnaast demonstreren we immunofluorescentie (IF) kleuring van PV's om cardiomyocyten en hun onderlinge verbindingen binnen de PV's te visualiseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De verzorging van de dieren en alle experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Animal Care and Ethics Committee van de Ludwig-Maximilians-Universiteit van München, en alle procedures met muizen werden goedgekeurd door de Regierung von Oberbayern (ROB 55.2-2532. Vet_02-20-215, ROB 55.2-2532. Vet_02-18-46, ROB 55.2-2532. Vet_02-19-86, ROB 55.2-2532. Vet_02-21-178, ROB 55.2-2532. Vet_02-22-170). C57BL6/N-muizen werden commercieel verkregen.
1. Voorbereiding
- Bereid een 3% agarosegel door 3 mg agarose en 100 ml 1x Tris-gebufferde zoutoplossing te mengen in een erlenmeyer van 500 ml. Verwarm de oplossing in een magnetron op 600 W gedurende 2-3 minuten tot de gel homogeen wordt.
- Bereid de dissectieschaal voor door de gel voorzichtig in een petrischaal met een diameter van 100 mm te gieten. Vul de petrischaal voor de helft met gel. Verwijder belletjes uit de gel om een homogene consistentie te garanderen. Laat de dissectieschaal afkoelen totdat de gel stevig wordt.
- Bereid alle benodigde buffers en oplossingen voor, inclusief fixeeroplossing, permeabilisatieoplossing, blokkeerbuffer en wasbuffer volgens de recepten in tabel 1.
2. Orgaanoogst en weefselvoorbereiding
OPMERKING: Een uitgebreid protocol waarin de procedure van muisanesthesie en het oogsten van het hart wordt beschreven, is eerder gepubliceerd17,18. Daarom geven we slechts een korte beschrijving van dat deel. Experimenten werden uitgevoerd op 12 tot 16 weken oude C57BL6-muizen (zes mannetjes, vier vrouwtjes). Het lichaamsgewicht van het mannetje steeg van 26 g tot 28 g en het lichaamsgewicht van het vrouwtje van 19 g tot 22 g. De volgende stappen werden uitgevoerd zonder voorafgaande systemische heparine-injectie.
- Verdoof de muis met isofluraan (5%, 95% zuurstof, debiet: 1 L/min) en zorg voor voldoende anesthesiediepte.
- Breng de muis over naar de operatietafel en plaats deze in rugligging. Handhaaf de narcose met isofluraaninhalatie (2%, 98% zuurstof, stroom: 1 l/min) door een anesthesiemasker en bevestig de muis met tape aan de uiteinden. Injecteer fentanyl voor analgesie (0,1 mg/25 g lichaamsgewicht i.p.).
- Til de vacht op bij de processus xiphoidus en stel een transversale snede van 2 mm in. Koppel de vacht los van de onderhuidse fascia met behulp van stompe dissectie (achterkant van de schaar) en verleng de snede craniaal en lateraal om de thorax bloot te leggen.
- Open voorzichtig de buik caudaal naar de ribbenboog. Til de processus xiphoidus iets op om het middenrif van caudaal te snijden en de longen te laten instorten. Snijd vervolgens het middenrif van links naar rechts zonder organen te beschadigen en open de thorax bilateraal om het hart bloot te leggen.
- Snijd de inferieure vena cava (IVC) door terwijl het hart nog klopt om de muis te verbloeden en ga verder met het doordringen van het hart door de linker hartkamer binnen te dringen met een naald van 27 G en 10 ml ijskoude 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) te injecteren.
- Nadat u het bloed uit het muizenhart hebt verwijderd, zoekt u de aortaboogboog, de superieure vena cava (SVC) en de luchtpijp. Snijd ze ~3 mm boven de hartbasis en oogst het hart samen met de aangesloten longen.
- Dompel de geoogste organen onder in een conische buis van 10 ml met 2 ml gesteriliseerde 30% sucrose-oplossing. Laat de monsters 24 uur drogen bij 4 °C.
3. Microscopiegeleide voorbereiding van LA en PV's
- Plaats het uitgedroogde hart en de uitgedroogde longen in een dissectieschaal met 40-50 ml 1x PBS. Leg het onder een helderveldmicroscoop met een vergroting van 10x en stel de verlichting in. Plaats het hart met zijn dorsale oppervlak op de dissectieschaal. Identificeer de overgang tussen de ventriculaire en atriale wand en scheid de ventrikels voorzichtig van de boezems met behulp van een chirurgische schaar.
OPMERKING: Snijd ongeveer 1 mm onder de boezems om wat ventrikelweefsel te behouden. Dit zal later nodig zijn om de boezems op de dissectieschotel vast te pinnen zonder structuren aan de hartbasis te beschadigen. We raden aan om de ventrikels te bewaren, omdat ze kunnen worden gebruikt als een positief controlemonster. Om het ventriculaire weefsel in te bedden, volgt u dezelfde procedure als beschreven in rubriek 4 voor het inbedden van de PV's. - Plaats de gescheiden boezems met het ventriculaire snijvlak (stap 3.1) op de dissectieschaal zodat de hartbasis naar boven wijst. Oriënteer de boezems zo dat de longkwabben zich posterieur bevinden, de LA en het linker atriumaanhangsel (LAA) zich aan de rechterkant bevinden en het rechter atrium (RA) en rechter atriale aanhangsel (RAA) zich aan de linkerkant bevinden. Fixeer het preparaat door het resterende linkerventrikelweefsel op de dissectieschaal vast te pinnen. Spreid de longlobben voorzichtig uit zonder overmatige kracht uit te oefenen en speld ze vast aan de dissectieschaal (Figuur 1A).
- Krijg een overzicht van de anatomische oriëntatiepunten aan de hartbasis.
- Zoek de aorta met de aortaboog in het midden van de hartbasis.
- Detecteer de longstam (PT) direct rechts van de aorta en volg het verloop naar achteren om de longslagaders (PA's) te onderscheiden. Controleer hun locatie door hun koers te volgen tot aan de linkerkwab en de rechter superieure/middelste kwabben om het corresponderende longhilum (LH) te vinden.
- Bepaal de positie van de luchtpijp en/of de linker en rechter hoofdbronchiën (L Br, R Br), die zich achter de aorta bevinden, en controleer hun locatie door hun verloop naar de LH te volgen (figuur 1A).
- Zoek de SVC links van de aorta en verifieer door zijn loop te volgen in de RA naast de RAA.
- Verwijder bind- en vetweefsel rond de hartbasis met behoud van alle hierboven genoemde geïdentificeerde oriëntatiepunten. Verwijder bovendien de aortaboog en luchtpijp om een vrij zicht op de hartbasis te hebben (Figuur 1B).
- Scheid de PA's voorzichtig van het bovenoppervlak van het atrium door stompe dissectie met een fijne pincet. Snijd ze daarna af bij LH en draai ze opzij om de linker atriale vrije muur (LAFW) en de PV's in hun volledige afmeting bloot te leggen. Snijd de belangrijkste bronchiën van de LH af en verwijder het bronchiale weefsel (Figuur 1C).
OPMERKING: De LH dient zowel als het gemeenschappelijke toegangspunt voor PA's en luchtwegen naar de longen, als het uitgangspunt voor de PV's. Het is belangrijk om elke procedure bij de LH zorgvuldig uit te voeren om schade aan de PV's te voorkomen. - Om de LA/RA en de linker- en rechterventrikel (LV, RV) te scheiden, voert u een snede uit vanaf het voorste deel van de resterende RV naar boven door de tricuspidalisklep (TV) tot aan de voorste zijde van de SVC om de RA vanaf de frontale zijde te openen. Snijd de posterieure RA-vrije wand (RAFW) naast het interatriale septum om de RA en LA te scheiden. Snijd de achterste rechterventrikelwand naast het interventriculaire septum door om de LV en RV volledig door te snijden.
OPMERKING: Een uitgebreid protocol waarin de procedure van de voorbereiding en isolatie van het rechter atrium in detail wordt beschreven, is eerder gepubliceerd19. Het scheiden van de RA is nuttig om ongewenst weefsel uit het LA-PV weefselcomplex te verwijderen en weefsel te verzamelen voor aanvullende experimenten. - Verklein de grootte van de longkwabben door een deel van het basale longweefsel af te snijden, zodat er ongeveer 3-4 mm longweefsel overblijft.
OPMERKING: Bewaar de apices van de longlobben terwijl ze dienen als drijvers tijdens de volgende inbeddingsstappen en maak inbedding van de PV's horizontaal in de OCT-verbinding mogelijk.
4. Inbedding van weefsel
- Breng het preparaat, inclusief LA en PV's, over in een cryomal en zorg ervoor dat de hartbasis en longtop naar boven wijzen. Plaats ze in een fysiologische configuratie - zorg ervoor dat de PV's niet worden gedraaid of omgedraaid.
- Vul de cryomal met OCT-compound en druk de PV's voorzichtig samen met een fijne pincet om eventuele resterende lucht te verwijderen. Houd hun fysiologische configuratie gedurende het hele proces ongewijzigd.
- Zet de cryomal met het ingebedde weefsel op droogijs om de O.C.T.-verbinding te bevriezen. Bewaar de monsters bij -80 °C voor toekomstig gebruik.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de PV's in een horizontale positie te houden om ervoor te zorgen dat secties worden verkregen die PV's over de volledige lengte bevatten voor volgende procedures.
5. Snijden en verzamelen van ingevroren weefselcoupes
OPMERKING: Om de weefselblokken te snijden, werden de machine-instellingen aangepast aan een sampletemperatuur van -18 °C en een mestemperatuur van -25 °C.
- Installeer een weefselblok op de monsterhouder door een laag O.C.T.-verbinding aan te brengen tussen het weefselblok en de monsterhouder. Vries ze 3-4 minuten in.
- Blokkeer de samplekop en laad de samplehouder met het weefselblok op de samplekop door de ontgrendelingshendel van de samplekop te sluiten. Pas de positie van het weefselblok fijn aan met behulp van de fijnafstellingsknoppen.
- Verwijder de cryomal van het preparaat. Deblokkeer de samplekop en de elektrische rem van de cryostaat.
- Stel de cryostaat in op de trimmodus met een trimgrootte tussen 30 μm en 50 μm. Snijd het weefselmonster bij totdat de PV's zichtbaar worden.
- Schakel over naar de modus voor het snijden van fijne secties en stel de dikte in op 10 μm. Begin met het verzamelen van secties, inclusief PV's en verbonden long- en atriumweefsel. Verzamel secties met behulp van een anti-rolplaat of door het vrije uiteinde van elke sectie met een fijne koude borstel aan de meshouder te bevestigen en spreid ze uit.
- Plaats een dia (op kamertemperatuur bewaard) naast de sectie. Maak het gedeelte voorzichtig los van de borstel, zodat het gedeelte zich op natuurlijke wijze aan het glaasje kan hechten, aangezien het bevroren gedeelte en de O.C.T.-verbinding smelten bij het aanraken van het warmere glaasjeoppervlak.
NOTITIE: Zorg voor een stabiele en zachte toestand tijdens het sectieproces om breuken of vouwen in de secties te voorkomen. Vervang het mes indien nodig door een nieuw mes. - Verzamel maximaal drie secties op elke dia. Label de objectglaasjes en bewaar ze bij -20 °C.
OPMERKING: We raden aan om voor elke PV ten minste vijf secties (gelijk aan twee dia's) te verzamelen.
6. Immunofluorescentiekleuring van cryosecties van de PV's
- Leg de bevroren objectglaasjes op een kleuringssysteem en laat de secties ongeveer 20 minuten bij kamertemperatuur ontdooien.
NOTITIE: Vul het kleuringssysteem met water om de monsters vochtig te houden. Uitdroging van het weefsel kan antigenen beschadigen, waardoor niet-specifieke antilichaambinding en overkleuringsartefacten ontstaan tijdens de kleuringsprocedures. - Bedek de secties na 20 minuten ontdooien met een paar druppels fixeeroplossing (4% paraformaldehyde [PFA], tabel 1) om het weefsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op de objectglaasjes te fixeren.
- Breng de objectglaasjes na fixatie over naar het verticale glaasjesrek en dompel ze onder in een bak gevuld met 1x PBS. Plaats de container op een shaker op lage snelheid en was de glaasjes gedurende 5 minuten. Herhaal dit wasprogramma nog twee keer, waarbij je elke keer 1x verse PBS gebruikt.
- Omcirkel na het wassen elke afzonderlijke sectie op elk glaasje met een xylolhoudende liquid blocker-pen. Herschik de glaasjes op het kleuringssysteem en breng 1 of 2 druppels permeabilisatieoplossing (0,1% Triton X-100, tabel 1) aan op elk monster met een pasteurpipet. Laat de secties 10 minuten bij kamertemperatuur incuberen om de cel- en celorganelmembranen te permeabiliseren.
- Verwijder na permeabilisatie de 0,1% Triton X-100 oplossing door de objectglaasjes 3 x 5 minuten te wassen in 1x PBS, volgens dezelfde procedure als beschreven in stap 6.3.
- Herschik na het wassen de glaasjes op het kleursysteem en breng 1 of 2 druppels van de blokkeerbuffer (tabel 1) aan op elke sectie, waarbij u ervoor zorgt dat ze volledig bedekt zijn met de blokkeerbuffer. Laat de objectglaasjes 1 uur bij kamertemperatuur incuberen.
- Bereid 1 ml van het primaire antilichaammengsel door 5 μL van een anti-cTNT-antilichaam van muizen (verdund 1:200) en 1 μL van een anti-Cx43-antilichaam van konijnen (verdund 1:1.000) te pipetteren in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml gevuld met 994 μL blokkeerbuffer. Pipeteer het mengsel op en neer om een grondige menging te garanderen.
NOTITIE: Pas de hoeveelheid aangebrachte antilichaammix aan op basis van de grootte van de sectie. Zorg ervoor dat de secties volledig bedekt zijn met het antilichaammengsel. De concentratie, incubatietijd en optimale incubatietemperatuur van antilichamen kunnen variëren, afhankelijk van factoren zoals het type antilichaam, klonen van antilichamen en weefselkenmerken. We raden aan om de kleuringsomstandigheden voor elk antilichaam afzonderlijk te testen en te optimaliseren. - Verwijder na de blokkeringsstap (stap 6.6) de resterende blokkeerbuffer en breng direct 2 of 3 druppels van het primaire antilichaammengsel aan op elke sectie. Laat de objectglaasjes een nacht incuberen bij 4 °C.
- Was de objectglaasjes na de incubatie van de primaire antilichamen gedurende 3 x 5 minuten met Washing Buffer onder zacht schudden (tabel 1).
- Bereid 1 ml van het secundaire antilichaammengsel door 1 μl van een AF488-geconjugeerd secundair antimuisantilichaam tegen geiten (verdund 1:1.000) en 1 μl van een AF568-geconjugeerd secundair antilichaam tegen geiten (verdund 1:1.000) te pipetteren in een microcentrifugebuis van 1,5 ml gevuld met 998 μl wasbuffer. Pipeteer het mengsel op en neer om goed te mengen.
- Na de wasstap (stap 6.9) herschikt u de glaasjes in het kleuringssysteem en brengt u met een pipet 2 of 3 druppels van het secundaire antilichaammengsel aan op elke sectie. Laat de antilichamen 45 minuten bij kamertemperatuur incuberen en bescherm de monsters tegen licht om fluorofoor te voorkomen. Was de objectglaasjes na de incubatie van de secundaire antilichamen gedurende 3 x 5 minuten met Washing Buffer onder zacht schudden (tabel 1).
- Herschik de glaasjes op het kleursysteem. Verbeter de secties met Hoechst-33342 (in een verdunning van 1:1.000 in 1x PBS) door 2 tot 3 druppels van de Hoechst-33342-oplossing op elke sectie aan te brengen. Laat de glaasjes 10 minuten op kamertemperatuur incuberen.
- Was de objectglaasjes na de incubatie 3 x 5 min met Washing Buffer onder zacht schudden (tabel 1). Monteer de objectglaasjes door op elk glaasje 1 of 2 druppels fluorescerend montagemedium aan te brengen. Bedek de glaasjes met dekglaasjes.
NOTITIE: Zorg ervoor dat het dekglaasje plat is wanneer u het plaatst. Als er luchtbellen aanwezig zijn, oefen dan voorzichtig druk uit op de zijkant van de bel om ze te verwijderen. - Bewaar de gemonteerde glaasjes in een glaasjesbeschermer bij 4 °C.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de dia's zo vroeg mogelijk in beeld te brengen. Dit protocol is niet uitsluitend geldig voor de genoemde antilichamen. Doelantigenen en antilichamen kunnen worden vervangen of gewijzigd volgens de vereisten van het individuele experiment of alternatieve antigeendetectiestrategieën.
7. Beeldvorming van de plakjes immunofluorescentiekleuring
- Stel de microscoop op.
- Start de microscoop met de laserlichtbron, de aangesloten computer en de bijbehorende software volgens de handleiding van de fabrikant.
- Ga naar het menu Configuratie . Klik om het geschikte cameratype voor fluorescentiebeeldvorming te selecteren (bijv. DFC365FX monochrome camera).
- Ga naar het menu Acquireren en maak drie kanalen.
- Selecteer kanaal FCr1 voor de detectie van Hoechst-33342, label het en selecteer de DAP-filterkubus in het selectiegedeelte. Stel de belichtingstijd in op 200 ms, de elektronische versterking op 2 en de lichtintensiteit op 17%.
- Selecteer kanaal FCr2 voor de detectie van cTNT (gekleurd met AF488-geconjugeerd antilichaam), label het en selecteer de L5-filterkubus in het selectiegedeelte. Stel de belichtingstijd in op 200-300 ms, de elektronische versterking op 1.8 en de lichtintensiteit op 100%.
- Selecteer kanaal FCr3 voor de detectie van Cx43 (gekleurd met AF568-geconjugeerd antilichaam), label het en selecteer de TXR-filterkubus in het selectiegedeelte. Stel de belichtingstijd in op 150 ms, de elektronische versterking op 2 en de lichtintensiteit op 100%.
OPMERKING: De spectrale karakteristieken van de filterblokjes zijn vermeld in tabel 2.
- Plaats het objectglaasje op de microscooptafel.
- Voer een overzichtsbeeldvorming uit met een vergroting van 10x:
- Selecteer het 10x objectief en open de lasersluiter door op Live te klikken. Terwijl het FCr1-kanaal is geselecteerd, gebruikt u de navigatorfunctie om door de dia te navigeren totdat er een signaal wordt gedetecteerd. Richt het monster grofweg totdat de celkernen te onderscheiden zijn.
- Start de spiraalscanmodus om een volledige preview van het monster vast te leggen. Deactiveer live door nogmaals op de knop te klikken om het monster te beschermen. Identificeer de LA, PV's en longweefsel.
- Definieer het interessegebied voor de volgende tegelscan; Selecteer meerdere scherpstelpunten binnen het interessegebied. Klik op Live in het FCr1-kanaal en pas de scherpstelling voor elk scherpstelpunt aan. Sla de bijbehorende Z-posities op, die de exacte scherpstelpositie voor elk scherpstelpunt vertegenwoordigen. Start de tegelscan met een vergroting van 10x om een volledig overzichtsbeeld van het monster vast te leggen.
- Nadat de scan is voltooid, opent u de tegelscan en voegt u de afzonderlijke afbeeldingen samen. Om de helderheid en het contrast van afzonderlijke kanalen te verbeteren, selecteert u ze in de objectbalk en past u hun signaalbereik naar wens aan met de schuifregelaars.
- Verkrijg ingezoomde beelden met een vergroting van 40x :
- Selecteer de doelstelling 40x. Pas de belichtingstijd en versterkingsinstellingen voor elk kanaal als volgt aan: FCr1: DAP-filterkubus: belichtingstijd: 50 ms, versterking: 1.5; FCr2: L5-filterkubus: belichtingstijd: 80 ms, versterking: 1,8; FCr3: TXR-filterkubus: belichtingstijd: 20 ms, versterking: 2.
- Gebruik de overzichtsafbeelding van stap 7.3 om de PV-opening (PVO) te lokaliseren, evenals extrapulmonale en intrapulmonale PV-gebieden (PVex, PVin). Definieer dit gebied dat moet worden gescand.
- Open het submenu Afbeelding en klik op z om Z-Stack te activeren.
- Selecteer het FCr1-kanaal en open de lasersluiter om een live preview te krijgen.
- Ga naar het Z-Stack-submenu en bepaal het begin- en eindpunt van de Z-Stack door defijnafstellingsknop met de klok mee en tegen de klok in te draaien totdat het algehele signaal de focus begint te verliezen.
- Nadat u het scherpstelbereik hebt ingesteld, selecteert u de System Optimized Z-Stack-modus en activeert u de optie Extended depth of Field Images (EDF) berekenen. Afhankelijk van hoe plat het weefsel is, reken je op ongeveer 20 lagen met een stapinterval van ongeveer 0,5 μm.
- Start de tegelscan. Open na het scannen de tegelscan en voeg alleen de EDF-afbeelding samen. Om de helderheid en het contrast van afzonderlijke kanalen te verbeteren, selecteert u ze in de objectbalk en past u hun signaalbereik naar wens aan met de schuifregelaars (zie stap 7.3.4).
- Nadat u de afbeeldingen hebt gegenereerd, slaat u het project op en exporteert u zowel de samengevoegde versie als de onbewerkte kanalen van elke afbeelding als een TIFF-bestand.
OPMERKING: Door de bestanden op te slaan als ImageJ-leesbare TIFF, kan ImageJ de originele tegelgrootte importeren in μm in plaats van pixels. Sluit altijd de lasersluiter wanneer een lasersignaal niet nodig is om fotobleken van de secundaire antilichamen te voorkomen.
8. Beeldbewerking met ImageJ
- Laad de bijbehorende RAW-kanaalbestanden in ImageJ. Klik op Afbeelding | Kleur | Voeg samen en kies de gewenste kleur voor elk kanaal.
- Een schaalbalk maken door Analyseren | Gereedschap | Schaalbalk en plak deze in de rechterbenedenhoek. Ga verder met de verwerking en analyse volgens de beeldvereisten. Sla de samengevoegde afbeeldingen op wanneer u klaar bent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We voerden de microdissectie, kleuring en beeldvorming van de PV's uit bij 10 muizen van 12-16 weken oud. Volgens het protocol hebben we met succes PV's samen met de LA in alle experimentele muizen gemicrodisseceerd en secties verkregen met een uitgebreid beeld van de PV's in acht muizen. Overzichtsbeelden werden gemaakt met een vergroting van 10x om het PV-opening (PVO)-gebied bij de LA-PV-junctie, de extrapulmonale PV's (PVex) (PV's tussen het longhilum en de LA-PV-junctie) en de intrapulmonale PV's (PVin) (PV's omgeven door longweefsel) te identificeren (Figuur 2). Ingezoomde beelden van de genoemde regio's werden verkregen met een vergroting van 40x (Figuur 3).
We vonden specifieke cTNT-signalen met een typische spierstreep in de PVO, de PVex en de PVin (Figuur 3). Cx43 werd gevonden in alle drie de PV-regio's en werd meestal geprojecteerd tussen naburige cardiomyocyten (Figuur 3 en Figuur 4A). Cx43-gerelateerde signalen werden waargenomen aan zowel de polaire zijde (Figuur 3, gele pijlen) als de laterale zijde van de cardiomyocyten in de MS (Figuur 3, rode pijlen).
Figuur 1: Identificatie van longaders van muizen onder de microscoop. Helderveldmicroscopie (10x vergroting). Het hart wordt vastgemaakt aan de dissectieschotel met vier pinnen in het atrium, de linker longkwab, de rechter middelste longkwab en de rechter inferieure longkwab. (A) Overzicht van de hartbasis na het scheiden van het ventriculaire weefsel van het atrium met de aortaboog in het midden. Het atrium bevindt zich onderaan; De longkwabben zijn verspreid in de bovenste helft van het beeld. PV's worden verborgen door de AA, de belangrijkste bronchiën en de PA's. (B) Bovenaanzicht van de hartbasis na het verwijderen van de luchtpijp, delen van de belangrijkste bronchiën, de aortaboog en bind- en vetweefsel. De PA's in het midden van de afbeelding tonen hun volledige verloop van de PT naar de LH en bedekken de PV's. (C) Bovenaanzicht van de PV's na het snijden van de PA's uit de longkwabben en het verwijderen van het extrapulmonale bronchiale weefsel. Schaalverdelingen = 5 mm. Afkortingen: AA = aortaboog; AscA = aorta ascendens; IVC = inferieure vena cava; L Br = linker hoofdbronchiën; L PV = linker longader; LA-PV J = linker atrium-pulmonale ader overgang; LAA = linker hartoor; LAFW = linker atriale vrije muur; LH = longhilum; L. LL = linker longkwab; PA's = longslagaders; PT = longstam; R Br = rechter hoofdbronchiën; R PV = rechter longader; R-A PV = rechter opgaande longader; RAA = rechter hartoor; R. acc. LL = rechter accessoire longkwab; R. inf. LL = rechter inferieure longkwab; R. mid. LL = rechter middelste longkwab; R. sup. LL = rechter superieure longkwab; SVC = superieure vena cava. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Overzicht van de longaderen van volwassen muizen en het linker atrium in een transversale doorsnede door middel van immunofluorescentiemicroscopie. Celkernen werden gekleurd met Hoechst-33342 (blauw); cardiomyocyten werden gelabeld met anti-cTNT-antilichaam (wit); en gap junctions werden gedetecteerd met behulp van anti-Cx43-antilichaam (groen). De witte rechthoeken markeren de volgende gebieden: a, PV-opening (PVO); b, extrapulmonale PV (PVex); en c, intrapulmonale PV (PVin). Schaalbalk = 500 μm. Afkortingen: L PV = linker longader; LAA = linker hartoor; LAFW = linker atriale vrije muur; LV-EP = linker ventrikel - ejectiepad; R PV = rechter longader; R-A PV = rechter opgaande longader; RV = Rechterventrikel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Ingezoomde weergave van het rechter PV-myocardium met behulp van immunofluorescentiemicroscopie. Celkernen werden gekleurd met Hoechst-33342 (blauw); cardiomyocyten werden gelabeld met anti-cTNT-antilichaam (wit); en Cx43+ gap junctions werden gedetecteerd door anti-Cx43 antilichaam (groen). (A) EDF-tegelscans die een longitudinale doorsnede door de rechter extrapulmonale PV laten zien. De LA- en PV-opening worden niet weergegeven in de afbeelding en zouden zich aan de linkerkant bevinden, terwijl intrapulmonale PV en het bijbehorende longparenchym (ook niet afgebeeld) zich aan de rechterkant zouden bevinden. (B,C) EDF-scans met één tegel van de rechter extrapulmonale PV. Pijlen markeren Cx43+ gap junctions aan de cellulaire grenzen van cardiomyocyten. De gele pijlen geven gap junctions aan aan de polaire zijden van cardiomyocyten, gelokaliseerd met geïntercaleerde schijven, terwijl de rode pijlen gap junctions aan de laterale zijde van cardiomyocyten aangeven. Schaalbalken = 50 μm (A), 20 μm (B,C). Afkortingen: PV = longader; EDF = uitgebreide scherptediepte; LA = linker atrium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Immunofluorescentiekleuring van controleweefsel. (A) Positieve controlekleuring van de LV van muizen. De celkernen werden gekleurd met Hoechst 33342 (blauw); cardiomyocyten werden gelabeld met anti-cTNT-antilichaam (wit); en Cx43+ gap junctions werden gedetecteerd met anti-Cx43 antilichaam (groen). (B) Negatieve controlekleuring van de rechter extrapulmonale PV door alleen secundaire antilichamen te gebruiken. Celkernen zijn gekleurd met Hoechst 33342 (blauw). Schaalbalken = 20 μm (A), 50 μm (B). Afkortingen: LV = linker hartkamer; PV = longader. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Filter-kubus | Excitatie Filter | Emissie Filter |
| DAP | 350 / 50 | 460 / 50 |
| L5 | 480 / 40 | 527 / 30 |
| TXR | 560 / 40 | 630 / 75 |
Tabel 1: Excitatie- en emissiefilterkarakteristieken van de Leica DM6 B-filterblokjes.
| Verbinding | Definitieve concentratie | g of ml / 100 ml vereist |
| Fixerende oplossing | ||
| Paraformaldehyde (PFA) 16% | 4% | 25 ml |
| Fosfaat Gebufferde Zoutoplossing (PBS) 1x geconcentreerd | 75 ml | |
| Permeabilisatie-oplossing | ||
| Triton X-100 | 0.1% | 0,1 ml |
| Fosfaat Gebufferde Zoutoplossing (PBS) 1x geconcentreerd | 99,9 ml | |
| Buffer blokkeren | ||
| Normaal gaat serum (NGS) | 10% | 10 ml |
| Runderserumalbumine (BSA) | 0.5% | 0,5 mg |
| Tween 20 | 0.1% | 0,1 ml |
| Fosfaat Gebufferde Zoutoplossing (PBS) 1x geconcentreerd | 89,9 ml | |
| Buffer voor wassen | ||
| Runderserumalbumine (BSA) | 0.5% | 0,5 mg |
| Tween 20 | 0,1 ml | |
| Fosfaat Gebufferde Zoutoplossing (PBS) 1x geconcentreerd | 99,9 ml | |
Tabel 2: Bufferrecepten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met dit protocol delen we een methode om de PV's van het muizenhart te onderscheiden en te isoleren en er immunofluorescentiekleuring op uit te voeren. Na de orgaanoogst werden het hart en de longen uitgedroogd in een gesteriliseerde sucrose-oplossing, gevolgd door het scheiden van de ventrikels van het atrium en de longkwabben onder microscopische begeleiding. Daarna werd de hartbasis voorbereid om de PV's te visualiseren, gevolgd door ze uit de longen te snijden bij het hilum. De daaropvolgende immunofluorescentiekleuring werd uitgevoerd met behulp van een cryotechniek door het weefsel in te bedden in een O.C.T.-verbinding, het te snijden met een cryotoom en immunofluorescentiekleuring uit te voeren voor cTNT en Cx43.
Het isoleren van de PV's kan nuttig zijn voor het bestuderen van hun rol in de aritmogenese van AF. PV-isolatie bij muizen is echter een uitdaging. Naast hun kleine formaat zijn PV's verborgen achter de belangrijkste bronchiën en de prominente bloedvaten aan de hartbasis, waardoor hun detectie enorm ingewikkeld wordt. Dit protocol biedt een eenvoudige en transparante manier om de PV's van muizen te onderzoeken en maakt een economische benadering mogelijk om hun morfologische kenmerken in detail te bestuderen. De voorgestelde oogst- en voorbereidingsaanpak behoudt de anatomische relaties tussen PV's, de corresponderende longkwabben en de LA, waardoor onderzoek van het gehele LA-PV-weefselcomplex wordt vergemakkelijkt.
MS hebben een heterogene regeling. Significante variabiliteit in continuïteit en vezeloriëntatie is beschreven bij meerdere soorten, waaronder ratten en mensen, en wordt meestal aangetroffen rond de PV-openingen 4,20. Die diversiteit resulteert in anisotrope elektrische geleiding en kan de initiatie van reentry-excitaties en autonome activiteit in PV's induceren21. Bovendien kan de elektrische interconnectie tussen MS en atriale myocardium op de LA-PV-overgang leiden tot de overgang van gedesynchroniseerde elektrische impulsen van de PV's naar het linkeratrium, wat resulteert in AF2. Het behoud van de morfologische verhoudingen bij de LA-PV-junctie is daarom cruciaal voor het bestuderen van de interactie tussen het atriale myocardium en PV's. Om dit te bereiken, is de nauwkeurige identificatie van de belangrijkste bronchiën en PA's essentieel. We identificeerden de oriëntatiepunten op basis van hun anatomische posities en relaties met behulp van een microscoop met 10x vergroting en door systematisch hun koers van de hartbasis naar de LH te volgen.
We voerden IF-kleuring uit van de muizen-PV's. Kleuringsbenaderingen op basis van immunoreactieve kleurstoffen zijn wijdverbreid in verschillende soorten en maken de directe detectie van doelantigenen mogelijk, wat zorgt voor een visueel contrast van hoge kwaliteit in microscopie. Deze aanpak maakt zowel kwalitatieve als kwantitatieve karakterisering van intacte weefselplakken op eiwitniveau mogelijk. We gebruiken het cardiale isotype van TNT om onderscheid te maken tussen myocardium en niet-cardiale musculatuur. De aanwezigheid van cardiomyocyten in PV's, evenals de SVC en IVC is eerder beschreven7. Andere buisvormige structuren van de longen, waaronder de PA's, bronchiën en particuliere longvaten, bevatten echter geen hartspiercellen, waardoor ze gemakkelijk te onderscheiden zijn door IF-kleuring7. Door structuureiwitten zoals cTNT te labelen, vertonen cardiomyocyten hun karakteristieke dwarsstrepen, afhankelijk van hun oriëntatie op het bundelpad. De richting van de streep kan in ImageJ in kaart worden gebracht met plug-ins zoals OrientationJ of Directionality Plugin. Dit helpt bij het kwantificeren en karakteriseren van de directionaliteit van cardiomyocyten en kan nuttig zijn voor het identificeren van regio's met anisotrope elektrische geleiding. Bovendien ondersteunt deze studie eerdere bevindingen met betrekking tot de overvloedige aanwezigheid van Cx43 in het PV-myocardium van muizen, dat op een vergelijkbare manier is georganiseerd als in de LV (Figuur 4A)15,16. Opmerkelijk is dat we gap junctions hebben waargenomen bij het laterale membraan van cardiomyocyten in muizen PV's. Deze aandoening, bekend als lateralisatie, is aangetoond als een pathofysilogisch mechanisme bij AF, vooral bij mannelijke muizen22. Dit protocol benadrukt dus het potentieel voor soortgelijke studies in MS-cardiomyocyten van muizen.
PV-isolatie is een belangrijke techniek voor aritmieonderzoek, omdat het een aantal onderzoeken mogelijk maakt, waaronder IF-kleuring, flowcytometrie, fluorescentie-geactiveerde celsortering, optische mapping en patchklem. Aangezien het huidige protocol echter is opgesteld voor IF-beeldvorming van vast en ingebed weefsel, ontbreekt momenteel direct bewijs dat cardiomyocyten kunnen worden geïsoleerd uit PV-preparaten van voldoende kwaliteit om experimenten zoals patchklem mogelijk te maken. Het succes van de microdissectie hangt af van de ervaring van de onderzoeker vanwege de kleine omvang en kwetsbaarheid van het hartweefsel van muizen. De kwaliteit van IF-beeldvorming is ook grotendeels afhankelijk van de inbeddingsstap. Horizontale arrangementen zijn moeilijk te bereiken, de weefselintegriteit van de secties kan eronder lijden en PV's kunnen scheuren als ze niet worden gevuld met O.C.T.-verbinding. Bovendien is de geldigheid van het protocol beperkt tot 2D-beeldvorming, aangezien de methode de 3D-reconstructie van de PV's niet toelaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Duitse Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek (DZHK; 81X3600221 aan H.V., 81X2600255 aan S.C.), de China Scholarship Council (CSC201808130158 aan R.X.), de Duitse Onderzoeksstichting (DFG; Clinician Scientist Program in Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 tot PT), en de Corona Foundation (S199/10079/2019 tot SC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
References
- Lippi, G., Sanchis-Gomar, F., Cervellin, G. Global epidemiology of atrial fibrillation: An increasing epidemic and public health challenge. International Journal of Stroke. 16 (2), 217-221 (2021).
- Wijesurendra, R. S., Casadei, B.
- Haïssaguerre, M., et al. Spontaneous initiation of atrial fibrillation by ectopic beats originating in the pulmonary veins. The New England Journal of Medicine. 339 (10), 659-666 (1998).
- Mueller-Hoecker, J., et al. Of rodents and humans: a light microscopic and ultrastructural study on cardiomyocytes in pulmonary veins. International Journal of Medical Sciences. 5 (3), 152-158 (2008).
- Kramer, A. W., Marks, L. S. The occurrence of cardiac muscle in the pulmonary veins of Rodenita. Journal of Morphology. 117 (2), 135-149 (1965).
- Nathan, H., Eliakim, M. The junction between the left atrium and the pulmonary veins. Circulation. 34 (3), 412-422 (1966).
- Nathan, H., Gloobe, H. Myocardial atrio-venous junctions and extensions (sleeves) over the pulmonary and caval veins: Anatomical observations in various mammals. Thorax. 25 (3), 317-324 (1970).
- Bond, R. C., Choisy, S. C., Bryant, S. M., Hancox, J. C., James, A. F. Ion currents, action potentials, and noradrenergic responses in rat pulmonary vein and left atrial cardiomyocytes. Physiological Reports. 8 (9), 14432 (2020).
- Thiagalingam, A., et al. Pulmonary vein contraction: Characterization of dynamic changes in pulmonary vein morphology using multiphase multislice computed tomography scanning. Heart Rhythm. 5 (12), 1645-1650 (2008).
- Spach, M. S., Barr, R. C., Jewett, P. H. Spread of excitation from the atrium into thoracic veins in human beings and dogs. The American Journal of Cardiology. 30 (8), 844-854 (1972).
- Scott McNutt, N., Weinstein, R. S. Membrane ultrastructure at mammalian intercellular junctions. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 26, 45-101 (1973).
- Barr, L., Dewey, M. M., Berger, W. Propagation of action potentials and the structure of the nexus in cardiac muscle. Journal of General Physiology. 48 (5), 797-823 (1965).
- Kawamura, K., Konishi, T. Ultrastructure of the cell junction of heart muscle with special reference to its functional significance in excitation conduction and to the concept of "disease of intercalated disc". Japanese Circulation Journal. 31 (11), 1533-1543 (1967).
- Van Kempen, M. J., Fromaget, C., Gros, D., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Spatial distribution of connexin43, the major cardiac gap junction protein, in the developing and adult rat heart. Circulation Research. 68 (6), 1638-1651 (1991).
- Verheule, S. Tissue structure and connexin expression of canine pulmonary veins. Cardiovascular Research. 55 (4), 727-738 (2002).
- Xiao, Y., et al. Expression of connexin 43, ion channels and Ca2+-handling proteins in rat pulmonary vein cardiomyocytes. Experimental and Therapeutic Medicine. 12 (5), 3233-3241 (2016).
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), (2020).
- Tomsits, P., et al. Medetomidine/midazolam/fentanyl narcosis alters cardiac autonomic tone leading to conduction disorders and arrhythmias in mice. Lab Animal. 52 (4), 85-92 (2023).
- Xia, R., et al. Isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node. Journal of Visualized Experiments. (171), (2021).
- Bredeloux, P., Pasqualin, C., Bordy, R., Maupoil, V., Findlay, I. Automatic activity arising in cardiac muscle sleeves of the pulmonary vein. Biomolecules. 12 (1), 23 (2021).
- Chen, P. S., et al.
- Thibault, S., Ton, A. -T., Huynh, F., Fiset, C. Connexin lateralization contributes to male susceptibility to atrial fibrillation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (18), 10696 (2022).
