Summary
Questo protocollo dimostra l'isolamento guidato dalla microscopia e la colorazione in immunofluorescenza delle vene polmonari murine. Prepariamo campioni di tessuto contenenti l'atrio sinistro, le vene polmonari e i polmoni corrispondenti e li coloriamo per la troponina T cardiaca e la connessina 43.
Abstract
Le vene polmonari (PV) sono la principale fonte di battiti ectopici nelle aritmie atriali e svolgono un ruolo cruciale nello sviluppo e nella progressione della fibrillazione atriale (FA). I PV contengono manicotti miocardici (SM) composti da cardiomiociti. Le sclerosi multipla sono implicate nell'inizio e nel mantenimento della fibrillazione atriale, in quanto conservano somiglianze con il miocardio cardiaco, inclusa la capacità di generare impulsi elettrici ectopici. I roditori sono ampiamente utilizzati e possono rappresentare ottimi modelli animali per studiare il miocardio della vena polmonare poiché i cardiomiociti sono ampiamente presenti in tutta la parete del vaso. Tuttavia, la microdissezione precisa e la preparazione di PV murini sono impegnative a causa delle piccole dimensioni dell'organo e dell'anatomia intricata.
Dimostriamo un protocollo di microdissezione guidato dalla microscopia per isolare l'atrio sinistro murino (LA) insieme ai PV. Viene eseguita una colorazione a immunofluorescenza utilizzando anticorpi cardiaci Troponina-T (cTNT) e connessina 43 (Cx43) per visualizzare LA e PV in tutta la sua lunghezza. L'imaging con ingrandimenti 10x e 40x fornisce una visione completa della struttura del PV e approfondimenti dettagliati sull'architettura miocardica, evidenziando in particolare la presenza della connessina 43 all'interno della SM.
Introduction
La fibrillazione atriale (FA) è l'aritmia sostenuta più comune1. La prevalenza della fibrillazione atriale è in ulteriore aumento, con un numero previsto di ~17,9 milioni di pazienti in Europa nel 20601. La fibrillazione atriale è clinicamente molto importante poiché è un fattore di rischio essenziale per lo sviluppo di infarto miocardico, insufficienza cardiaca o ictus, con conseguente enorme onere individuale, sociale e socioeconomico1. Anche se la fibrillazione atriale è nota da decenni, la fisiopatologia della fibrillazione atriale non è ancora del tutto compresa2.
Già alla fine degli anni '90, gli studi hanno dimostrato il grande impatto delle vene polmonari (PV) nell'avvio e nel mantenimento della fibrillazione atriale, in quanto sono la principale fonte di battiti ectopici che innescano la fibrillazione atriale3. È stato dimostrato che i PV differiscono strutturalmente dagli altri vasi sanguigni. Mentre i vasi sanguigni tipici contengono cellule muscolari lisce, la tunica media dei PV contiene anche cardiomiociti4. Nei roditori, questa muscolatura cardiaca è presente in modo ubiquitario in tutte le PV, comprese le parti intra ed extrapolmonari, nonché la regione dell'orifizio5. Nell'uomo, i PV contengono anche cardiomiociti, che possono essere osservati all'interno delle estensioni del miocardio dell'atrio sinistro (LA), le cosiddette maniche miocardiche (SM)6,7.
La SM presenta somiglianze morfologiche con il miocardio8 atriale. La forma e le dimensioni dei cardiomiociti atriali e PV non variano significativamente tra loro e mostrano proprietà elettrofisiologiche comparabili8. Le registrazioni elettrofisiologiche all'interno del PV hanno dimostrato l'attività elettrica della SM e l'imaging angiografico ha rivelato contrazioni sincronizzate con il battito cardiaco 9,10.
Le giunzioni gap sono complessi proteici che formano pori composti da sei subunità connessine, che consentono il passaggio di ioni e piccole molecole11. Le giunzioni gap esistono nelle apposizioni cellula-cellula, interconnettono i cardiomiociti vicini e consentono un accoppiamento elettrico intercellulare tra i cardiomiociti 12,13. Diverse isoforme di connessina sono espresse nel cuore, con la connessina 43 (Cx43) che è l'isoforma più comune espressa in tutte le regioni del cuore14. Studi precedenti hanno fornito prove dell'espressione di Cx43 nei cardiomiociti dei PV15,16.
Rimane difficile studiare la SM all'interno di PV intatti a causa della loro struttura delicata, specialmente nei modelli animali di piccola taglia. Qui, dimostriamo come identificare e isolare i PV insieme a LA e ai lobi polmonari nei topi utilizzando la microdissezione guidata dalla microscopia. Inoltre, dimostriamo la colorazione in immunofluorescenza (IF) dei PV per visualizzare i cardiomiociti e le loro interconnessioni all'interno dei PV.
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Protocol
La cura degli animali e tutte le procedure sperimentali sono state condotte seguendo le linee guida del Comitato etico e per la cura degli animali dell'Università Ludwig-Maximilians di Monaco di Baviera, e tutte le procedure che utilizzano i topi sono state approvate dalla Regierung von Oberbayern (ROB 55.2-2532. Vet_02-20-215, ROB 55.2-2532. Vet_02-18-46, ROB 55.2-2532. Vet_02-19-86, ROB 55.2-2532. Vet_02-21-178, ROB 55.2-2532. Vet_02-22-170). I topi C57BL6/N sono stati ottenuti commercialmente.
1. Preparazione
- Preparare un gel di agarosio al 3% mescolando 3 mg di agarosio e 100 ml di soluzione salina tamponata con Tris in un pallone di Erlenmeyer da 500 ml. Scaldare la soluzione in microonde a 600 W per 2-3 minuti fino a quando il gel diventa omogeneo.
- Preparare la capsula di dissezione versando delicatamente il gel in una capsula di Petri di 100 mm di diametro. Riempi metà della capsula di Petri con il gel. Eliminare le bolle dal gel per garantire una consistenza omogenea. Lasciare raffreddare la piastra di dissezione fino a quando il gel non diventa solido.
- Preparare tutti i tamponi e le soluzioni necessarie, compresa la soluzione di fissaggio, la soluzione di permeabilizzazione, il tampone di blocco e il tampone di lavaggio secondo le ricette fornite nella Tabella 1.
2. Prelievo di organi e preparazione dei tessuti
NOTA: Un ampio protocollo che descrive in dettaglio la procedura di anestesia del topo e il prelievo del cuore è stato precedentemente pubblicato17,18. Pertanto, presentiamo solo una breve descrizione di quella parte. Gli esperimenti sono stati eseguiti su topi C57BL6 di età compresa tra 12 e 16 settimane (sei maschi, quattro femmine). Il peso corporeo del maschio è aumentato da 26 g a 28 g e il peso corporeo della femmina da 19 g a 22 g. I seguenti passaggi sono stati eseguiti senza una precedente iniezione sistemica di eparina.
- Anestetizzare il topo con isoflurano (5%, 95% di ossigeno, flusso: 1 L/min) e garantire una profondità di anestesia sufficiente.
- Trasferire il mouse sulla scrivania operativa posizionandolo in posizione supina. Mantenere la narcosi con inalazione di isoflurano (2%, 98% di ossigeno, flusso: 1 L/min) attraverso una maschera per anestesia e fissare il topo con del nastro adesivo alle estremità. Iniettare fentanil per analgesia (0,1 mg/25 g di peso corporeo i.p.).
- Sollevare il pelo in corrispondenza del processo xifoidale e impostare un taglio trasversale di 2 mm. Scollegare il pelo dalla fascia sottocutanea utilizzando una dissezione smussata (parte posteriore delle forbici) ed estendere il taglio cranialmente e lateralmente per esporre il torace.
- Aprire con cautela l'addome caudale all'arco costale. Sollevare leggermente il processo xifoidale per incidere il diaframma dalla caudale e far collassare i polmoni. Quindi, tagliare il diaframma da sinistra a destra senza ferire alcun organo e aprire il torace bilateralmente per esporre il cuore.
- Tagliare la vena cava inferiore (IVC) mentre il cuore batte ancora per dissanguare il topo e procedere alla perfusione del cuore penetrando nel ventricolo sinistro con un ago da 27 G e iniettando 10 ml di soluzione salina ghiacciata tamponata con fosfato (PBS).
- Dopo aver eliminato il sangue dal cuore del topo, individuare l'arco aortico, la vena cava superiore (SVC) e la trachea. Tagliali ~3 mm sopra la base del cuore e raccogli il cuore insieme ai polmoni collegati.
- Immergere gli organi prelevati in una provetta conica da 10 ml contenente 2 ml di soluzione sterilizzata di saccarosio al 30%. Lasciare disidratare i campioni per 24 ore a 4 °C.
3. Preparazione guidata al microscopio di LA e PV
- Mettere il cuore e i polmoni disidratati in una piastra di dissezione contenente 40-50 ml di PBS 1x. Mettilo sotto un microscopio a campo chiaro con ingrandimento 10x e imposta l'illuminazione. Posizionare il cuore con la sua superficie dorsale sul piatto di dissezione. Identificare la transizione tra la parete ventricolare e quella atriale e separare accuratamente i ventricoli dagli atri utilizzando le forbici chirurgiche.
NOTA: Tagliare circa 1 mm al di sotto degli atri per mantenere un po' di tessuto ventricolare. Questo sarà necessario in seguito per fissare gli atri alla piastra di dissezione senza danneggiare le strutture alla base del cuore. Si consiglia di conservare i ventricoli poiché possono essere utilizzati come campione di controllo positivo. Per incorporare il tessuto ventricolare, seguire la stessa procedura descritta per l'inclusione dei PV, come descritto nel paragrafo 4. - Posizionare gli atri separati con la superficie di taglio ventricolare (passaggio 3.1) sulla piastra di dissezione in modo che la base del cuore sia rivolta verso l'alto. Orientare gli atri in modo che i lobi polmonari siano posteriori, la LA e l'appendice atriale sinistra (LAA) siano a destra e l'atrio destro (RA) e l'appendice atriale destra (RAA) siano a sinistra. Fissare la preparazione fissando il tessuto ventricolare sinistro rimanente al piatto di dissezione. Allargare delicatamente i lobi polmonari senza applicare una forza eccessiva e fissarli al piatto di dissezione (Figura 1A).
- Ottieni una panoramica dei punti di riferimento anatomici alla base del cuore.
- Trova l'aorta con l'arco aortico al centro della base del cuore.
- Rilevare il tronco polmonare (PT) direttamente a destra dell'aorta e seguirne il decorso verso la parte posteriore per distinguere le arterie polmonari (PA). Verificare la loro posizione seguendo il loro decorso fino al lobo sinistro e ai lobi superiori/medi destro per trovare l'ilo polmonare (LH) corrispondente.
- Determinare la posizione della trachea e/o dei bronchi principali sinistro e destro (L Br, R Br), che si trovano posteriormente all'aorta, e verificarne la posizione seguendo il loro andamento verso l'LH (Figura 1A).
- Trova l'SVC a sinistra dell'aorta e verifica seguendo il suo decorso nell'AR accanto all'ARA.
- Rimuovere il tessuto connettivo e adiposo intorno alla base del cuore preservando tutti i punti di riferimento identificati sopra menzionati. Inoltre, rimuovere l'arco aortico e la trachea per avere una visione libera della base cardiaca (Figura 1B).
- Separare delicatamente i PA dalla superficie superiore dell'atrio mediante dissezione smussata utilizzando una pinza fine. Successivamente, tagliarli a sinistra e capovolgerli di lato per esporre la parete libera atriale sinistra (LAFW) e i PV nella loro piena dimensione. Tagliare i bronchi principali dall'LH e rimuovere il tessuto bronchiale (Figura 1C).
NOTA: L'LH funge sia da punto di ingresso comune per i PA e le vie aeree nei polmoni, sia da punto di uscita per i PV. È importante eseguire ogni procedura a sinistra con attenzione per evitare danni ai PV. - Per separare l'AR/AR e il ventricolo sinistro e destro (LV, RV), eseguire un taglio partendo dalla parte anteriore del restante RV verso l'alto attraverso la valvola tricuspide (TV) fino al lato anteriore della SVC per aprire l'AR dal lato frontale. Tagliare la parete posteriore libera dall'AR (RAFW) accanto al setto interatriale per separare l'AR e l'LA. Tagliare la parete ventricolare posteriore destra accanto al setto interventricolare per recidere completamente il ventricolo sinistro e il ventricolo destro.
NOTA: Un ampio protocollo che descrive in dettaglio la procedura di preparazione e isolamento dell'atrio destro è stato pubblicato in precedenza19. La separazione dell'artrite reumatoide è utile per rimuovere il tessuto indesiderato dal complesso tissutale LA-PV e per raccogliere il tessuto per ulteriori esperimenti. - Ridurre le dimensioni dei lobi polmonari tagliando parte del tessuto polmonare basale in modo da lasciare circa 3-4 mm di tessuto polmonare.
NOTA: Preservare gli apici dei lobi polmonari in quanto fungono da galleggianti durante le successive fasi di inclusione e consentono l'inclusione dei PV orizzontalmente nel composto OCT.
4. Inclusione dei tessuti
- Trasferire il preparato, compresi LA e PV, in un criostampo, assicurandosi che la base del cuore e l'apice polmonare siano rivolti verso l'alto. Disporli in una configurazione fisiologica, assicurandosi che i PV non siano attorcigliati o capovolti.
- Riempire il criostampo con composto OCT e comprimere delicatamente i PV con una pinza fine per rimuovere l'aria residua. Mantenere inalterata la loro configurazione fisiologica durante tutto il processo.
- Mettere il criostampo con il tessuto incorporato su ghiaccio secco per congelare il composto OCT. Conservare i campioni a -80 °C per un uso futuro.
NOTA: È fondamentale mantenere i PV in posizione orizzontale per garantire l'ottenimento di sezioni che contengano PV in tutta la loro lunghezza per le procedure successive.
5. Taglio e raccolta di sezioni di tessuto congelato
NOTA: Per tagliare i blocchi di tessuto, le impostazioni della macchina sono state regolate su una temperatura del provino di -18 °C e una temperatura della lama di -25 °C.
- Installare un blocco di tessuto sul portacampioni applicando uno strato di composto O.C.T. tra il blocco di tessuto e il portacampioni. Congelateli per 3-4 min.
- Bloccare la testa del campione e caricare il portacampioni con il blocco di tessuto sulla testa del campione chiudendo la leva di rilascio del mandrino del campione. Regolare finemente la posizione del blocco di tessuto utilizzando le manopole di regolazione fine.
- Rimuovere il criostampo dal campione. Sbloccare la testa del provino e il freno elettrico del criostato.
- Impostare il criostato in modalità trim con una dimensione di trim compresa tra 30 μm e 50 μm. Tagliare il campione di tessuto fino a quando i PV non diventano visibili.
- Passare alla modalità di taglio di sezioni fini e impostare lo spessore su 10 μm. Inizia a raccogliere le sezioni, compresi i PV e il tessuto polmonare e atriale collegato. Raccogliere le sezioni utilizzando una piastra antirollio o fissando l'estremità libera di ciascuna sezione al portalama con una spazzola fine a freddo e stenderle.
- Posizionare un vetrino (mantenuto a temperatura ambiente) adiacente alla sezione. Rilasciare con cautela la sezione dalla spazzola, consentendo alla sezione di aderire naturalmente al vetrino, poiché la sezione congelata e il composto OCT si sciolgono toccando la superficie del vetrino più calda.
NOTA: Mantenere una condizione stabile e delicata durante il processo di sezionamento per evitare rotture o pieghe nelle sezioni. Se necessario, sostituire la lama con una nuova. - Raccogli fino a tre sezioni su ogni diapositiva. Etichettare i vetrini e conservarli a -20 °C.
NOTA: Si consiglia di raccogliere almeno cinque sezioni (equivalenti a due vetrini) per ogni PV.
6. Colorazione in immunofluorescenza di criosezioni dai PV
- Disporre i vetrini congelati su un sistema di colorazione e lasciare scongelare le sezioni per circa 20 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: Riempire il sistema di colorazione con acqua per mantenere i campioni umidificati. L'essiccazione del tessuto può danneggiare gli antigeni, causando il legame anticorpale non specifico e artefatti sovracoloranti durante le procedure di colorazione. - Dopo 20 minuti di scongelamento, coprire le sezioni con alcune gocce di soluzione fissante (paraformaldeide al 4% [PFA], Tabella 1) per fissare il tessuto sui vetrini per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Dopo il fissaggio, trasferire i vetrini sulla griglia verticale e immergerli in un contenitore riempito con 1x PBS. Posizionare il contenitore su uno shaker a bassa velocità e lavare i vetrini per 5 min. Ripetere questo ciclo di lavaggio altre due volte, utilizzando ogni volta 1x PBS fresco.
- Dopo il lavaggio, cerchiare ogni singola sezione di ciascun vetrino con una penna bloccante liquida contenente xilolo. Ridisporre i vetrini sul sistema di colorazione e applicare 1 o 2 gocce di soluzione di permeabilizzazione (0,1% Triton X-100, Tabella 1) su ciascun campione con una pipetta Pasteur. Lasciare incubare le sezioni a temperatura ambiente per 10 minuti per permeabilizzare la cellula e le membrane degli organelli cellulari.
- Dopo la permeabilizzazione, rimuovere la soluzione di Triton X-100 allo 0,1% lavando i vetrini per 3 x 5 minuti in 1x PBS, seguendo la stessa procedura descritta al punto 6.3.
- Dopo il lavaggio, ridisporre i vetrini sul sistema di colorazione e applicare 1 o 2 gocce del tampone di blocco (Tabella 1) su ciascuna sezione, assicurandosi che siano completamente coperte dal tampone di blocco. Lasciare incubare i vetrini per 1 ora a temperatura ambiente.
- Preparare 1 mL della miscela di anticorpi primari pipettando 5 μL di un anticorpo anti-cTNT di topo (diluito 1:200) e 1 μL di un anticorpo anti-Cx43 di coniglio (diluito 1:1.000) in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL riempita con 994 μL di tampone bloccante. Pipettare la miscela su e giù per garantire una miscelazione accurata.
NOTA: Regolare la quantità di miscela di anticorpi applicata in base alle dimensioni della sezione. Assicurarsi che le sezioni siano completamente coperte dalla miscela di anticorpi. La concentrazione, il tempo di incubazione e la temperatura di incubazione ottimale degli anticorpi possono variare a seconda di fattori quali il tipo di anticorpo, i cloni di anticorpi e le caratteristiche del tessuto. Si consiglia di testare e ottimizzare le condizioni di colorazione individualmente per ciascun anticorpo. - Dopo la fase di blocco (fase 6.6), rimuovere il tampone bloccante rimanente e applicare direttamente 2 o 3 gocce della miscela di anticorpi primari su ciascuna sezione. Lasciare incubare i vetrini per una notte a 4 °C.
- Dopo l'incubazione degli anticorpi primari, lavare i vetrini per 3 x 5 minuti con il tampone di lavaggio agitando delicatamente (Tabella 1).
- Preparare 1 mL della miscela di anticorpi secondari pipettando 1 μL di un anticorpo secondario antitopo di capra coniugato AF488 (diluito 1:1.000) e 1 μL di un anticorpo secondario anticoniglio di capra coniugato AF568 (diluito 1:1.000) in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL riempita con 998 μL di tampone di lavaggio. Pipettare la miscela su e giù per amalgamare bene.
- Dopo la fase di lavaggio (fase 6.9), ridisporre i vetrini nel sistema di colorazione e applicare 2 o 3 gocce della miscela di anticorpi secondari su ciascuna sezione con una pipetta. Lasciare incubare gli anticorpi per 45 minuti a temperatura ambiente, proteggendo i campioni dalla luce per prevenire l'estinzione dei fluorofori. Dopo l'incubazione secondaria degli anticorpi, lavare i vetrini per 3 x 5 minuti con il tampone di lavaggio agitando delicatamente (Tabella 1).
- Riorganizzare i vetrini sul sistema di colorazione. Controcolorare le sezioni con Hoechst-33342 (in una diluizione di 1:1.000 in 1x PBS) applicando da 2 a 3 gocce della soluzione Hoechst-33342 su ciascuna sezione. Lasciare incubare i vetrini per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Dopo l'incubazione, lavare i vetrini 3 x 5 minuti con il tampone di lavaggio agitando delicatamente (Tabella 1). Montare i vetrini applicando 1 o 2 gocce di mezzo di montaggio fluorescente su ciascun vetrino. Coprire i vetrini con i vetrini coprioggetti.
NOTA: Assicurarsi che il vetrino coprioggetto sia piatto quando lo si posiziona. Se sono presenti bolle d'aria, esercitare una leggera pressione sul lato della bolla per rimuoverle. - Conservare i vetrini montati in un salvavetrino a 4 °C.
NOTA: Si consiglia di acquisire l'immagine delle diapositive il prima possibile. Questo protocollo non è valido esclusivamente per gli anticorpi menzionati. Gli antigeni e gli anticorpi bersaglio possono essere sostituiti o modificati in base ai requisiti dei singoli esperimenti o alle strategie alternative di rilevamento dell'antigene.
7. Imaging delle fette di colorazione in immunofluorescenza
- Posizionare il microscopio.
- Avviare il microscopio con la sorgente di luce laser, il computer collegato e il software di accompagnamento seguendo il manuale del produttore.
- Accedere al menu Configurazione . Fare clic per selezionare il tipo di telecamera adatto per l'imaging a fluorescenza (ad esempio, DFC365FX fotocamera monocromatica).
- Accedere al menu Acquisisci e creare tre canali.
- Selezionare il canale FCr1 per il rilevamento di Hoechst-33342, etichettarlo e selezionare il cubo del filtro DAP nella sezione di selezione. Impostare il tempo di esposizione a 200 ms, il guadagno elettronico a 2 e l'intensità della luce al 17%.
- Selezionare il canale FCr2 per la rilevazione di cTNT (colorato con anticorpo coniugato AF488), etichettarlo e selezionare il cubo del filtro L5 nella sezione di selezione. Impostare il tempo di esposizione a 200-300 ms, il guadagno elettronico a 1,8 e l'intensità della luce al 100%.
- Selezionare il canale FCr3 per il rilevamento di Cx43 (colorato con anticorpo coniugato AF568), etichettarlo e selezionare il cubo del filtro TXR nella sezione di selezione. Impostare il tempo di esposizione su 150 ms, il guadagno elettronico su 2 e l'intensità della luce su 100%.
NOTA: Le caratteristiche spettrali dei cubi filtranti sono elencate nella Tabella 2.
- Caricare il vetrino sul tavolino del microscopio.
- Eseguire un'immagine panoramica con un ingrandimento di 10x:
- Selezionare l'obiettivo 10x e aprire l'otturatore laser facendo clic su Live. Con il canale FCr1 selezionato, utilizzare la funzione di navigazione per navigare all'interno della diapositiva fino a quando non viene rilevato un segnale. Focalizzare approssimativamente il campione fino a quando i nuclei cellulari non sono distinguibili.
- Avviare la modalità di scansione a spirale per acquisire un'anteprima completa del campione. Disattiva live facendo nuovamente clic sul pulsante per proteggere il campione. Identificare l'LA, i PV e il tessuto polmonare.
- Definire l'area di interesse per la successiva scansione delle tessere; Selezionare più punti di messa a fuoco all'interno dell'area di interesse. Fare clic su Live nel canale FCr1 e regolare la messa a fuoco per ciascun punto AF. Salvare le posizioni Z corrispondenti, che rappresentano l'esatta posizione di messa a fuoco per ciascun punto AF. Avviare la scansione delle piastrelle con un ingrandimento di 10x per acquisire un'immagine panoramica completa del campione.
- Al termine della scansione, aprire la scansione dei riquadri e unire le singole immagini. Per migliorare la luminosità e il contrasto dei singoli canali, selezionarli nella barra degli oggetti e regolare la portata del segnale con i cursori come desiderato.
- Ottenere immagini ingrandite con un ingrandimento di 40x :
- Seleziona l'obiettivo 40x. Regolare le impostazioni del tempo di esposizione e del guadagno per ciascun canale come segue: FCr1: cubo filtro DAP: tempo di esposizione: 50 ms, guadagno: 1,5; FCr2: cubo filtrante L5: tempo di esposizione: 80 ms, guadagno: 1,8; FCr3: Cubo filtro TXR: tempo di esposizione: 20 ms, guadagno: 2.
- Utilizzare l'immagine panoramica del passaggio 7.3 per individuare l'orifizio PV (PVO) e le regioni PV extrapolmonari e intrapolmonari (PVex, PVin). Definire l'area da sottoporre a scansione.
- Aprire il sottomenu Immagine e fare clic su z per attivare Z-Stack.
- Selezionare il canale FCr1 e aprire l'otturatore laser per ottenere un'anteprima dal vivo .
- Andare al sottomenu Z-Stack e determinare i punti di inizio e fine dello Z-Stack ruotando lamanopola di regolazione fine del f ocus in senso orario e antiorario fino a quando il segnale complessivo inizia a perdere la messa a fuoco.
- Dopo aver impostato l'intervallo di messa a fuoco, selezionare la modalità Z-Stack ottimizzata per il sistema e attivare l'opzione Calcola immagini con profondità di campo estesa (EDF). A seconda di quanto è piatto il tessuto, aspettati circa 20 strati con un intervallo di passi di circa 0,5 μm.
- Avviare la scansione delle piastrelle. Dopo la scansione, apri la scansione delle tessere e unisci solo l'immagine EDF. Per migliorare la luminosità e il contrasto dei singoli canali, selezionarli nella barra degli oggetti e regolare la loro portata del segnale con i cursori come desiderato (vedere il passaggio 7.3.4).
- Dopo aver generato le immagini, salvate il progetto ed esportate sia la versione unita che i canali raw di ogni immagine come file TIFF.
NOTA: il salvataggio dei file in formato TIFF leggibile da ImageJ consente a ImageJ di importare le dimensioni della porzione originale in μm anziché in pixel. Chiudere sempre l'otturatore laser ogni volta che non è necessario un segnale laser per prevenire il fotosbiancamento degli anticorpi secondari.
8. Modifica delle immagini con ImageJ
- Caricare i file di canale raw corrispondenti in ImageJ. Clicca sull'immagine | Colore | Unisci e scegli il colore desiderato per ogni canale.
- Creare una barra di scala selezionando Analizza | Strumenti | Scala la barra e incollala nell'angolo in basso a destra. Procedere con ulteriori elaborazioni e analisi in base ai requisiti dell'immagine. Al termine, salva le immagini unite.
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Representative Results
Abbiamo eseguito la microdissezione, la colorazione e l'imaging dei PV in 10 topi di 12-16 settimane. Seguendo il protocollo, abbiamo microsezionato con successo i PV insieme al LA in tutti i topi sperimentali e abbiamo ottenuto sezioni con una visione completa dei PV in otto topi. Le immagini panoramiche sono state scattate con un ingrandimento di 10x per identificare la regione dell'orifizio PV (PVO) alla giunzione LA-PV, i PV extrapolmonari (PVex) (PV tra l'ilo polmonare e la giunzione LA-PV) e i PV intrapolmonari (PVin) (PV circondati da tessuto polmonare) (Figura 2). Le immagini ingrandite delle regioni menzionate sono state ottenute con un obiettivo con ingrandimento 40x (Figura 3).
Abbiamo trovato segnali cTNT specifici con una tipica striatura muscolare nel PVO, nel PVex e nel PVin (Figura 3). Cx43 è stato trovato in tutte e tre le regioni PV ed è stato proiettato principalmente tra cardiomiociti vicini (Figura 3 e Figura 4A). I segnali correlati a Cx43 sono stati osservati sia sul lato polare (Figura 3, frecce gialle) che sul lato laterale dei cardiomiociti nella SM (Figura 3, frecce rosse).
Figura 1: Identificazione delle vene polmonari murine al microscopio. Microscopia in campo chiaro (ingrandimento 10x). Il cuore è fissato alla piastra di dissezione con quattro perni nell'atrio, il lobo polmonare sinistro, il lobo polmonare medio destro e il lobo polmonare inferiore destro. (A) Panoramica della base cardiaca dopo aver separato il tessuto ventricolare dall'atrio con l'arco aortico al centro. L'atrio si trova nella parte inferiore; I lobi polmonari sono sparsi nella metà superiore dell'immagine. I PV sono nascosti dall'AA, dai bronchi principali e dai PA. (B) Immagine vista dall'alto della base cardiaca dopo aver rimosso la trachea, parti dei bronchi principali, l'arco aortico e il tessuto connettivo e adiposo. I PA al centro dell'immagine mostrano il loro decorso completo dal PT al LH e coprono i PV. (C) Immagine vista dall'alto dei PV dopo aver tagliato i PA dai lobi polmonari e rimosso il tessuto bronchiale extrapolmonare. Barre graduate = 5 mm. Abbreviazioni: AA = arco aortico; AscA = aorta ascendente; IVC = vena cava inferiore; L Br = bronco principale sinistro; L PV = vena polmonare sinistra; LA-PV J = giunzione atrio sinistro-vena polmonare; LAA = appendice atriale sinistra; LAFW = parete libera atriale sinistra; LH = ilo polmonare; L. LL = lobo polmonare sinistro; PA = arterie polmonari; PT = tronco polmonare; R Br = bronco principale destro; R PV = vena polmonare destra; R-A PV = vena polmonare ascendente destra; RAA = appendice atriale destra; LL = lobo polmonare accessorio destro; LL = lobo polmonare inferiore destro; R. mid. LL = lobo polmonare medio destro; LL = lobo polmonare superiore destro; SVC = vena cava superiore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Panoramica delle vene polmonari di topo adulto e dell'atrio sinistro in un'immagine di sezione trasversale mediante microscopia a immunofluorescenza. I nuclei cellulari sono stati colorati con Hoechst-33342 (blu); i cardiomiociti sono stati marcati con l'anticorpo anti-cTNT (bianco); e le giunzioni gap sono state rilevate utilizzando l'anticorpo anti-Cx43 (verde). I rettangoli bianchi evidenziano le seguenti regioni: a, orifizio PV (PVO); b, PV extrapolmonare (PVex); e c, PV intrapolmonare (PVin). Barra graduata = 500 μm. Abbreviazioni: L PV = vena polmonare sinistra; LAA = appendice atriale sinistra; LAFW = parete libera atriale sinistra; LV-EP = ventricolo sinistro - via di eiezione; R PV = vena polmonare destra; R-A PV = vena polmonare ascendente destra; RV = ventricolo destro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Vista ingrandita del miocardio PV destro mediante microscopia a immunofluorescenza. I nuclei cellulari sono stati colorati con Hoechst-33342 (blu); i cardiomiociti sono stati marcati con l'anticorpo anti-cTNT (bianco); e le giunzioni gap Cx43+ sono state rilevate dall'anticorpo anti-Cx43 (verde). (A) Scansioni di piastrelle EDF che mostrano una sezione longitudinale attraverso il PV extrapolmonare destro. L'orifizio LA e PV non sono mostrati nell'immagine e si troverebbero a sinistra, mentre il PV intrapolmonare e il corrispondente parenchima polmonare (anch'esso non mostrato) si troverebbero a destra. (B,C) Scansioni EDF a singola piastrella del PV extrapolmonare destro. Le frecce evidenziano le giunzioni gap Cx43+ ai bordi cellulari dei cardiomiociti. Le frecce gialle indicano le giunzioni gap ai lati polari dei cardiomiociti, colocalizzate con i dischi intercalati, mentre le frecce rosse indicano le gap junction sul lato laterale dei cardiomiociti. Barre di scala = 50 μm (A), 20 μm (B,C). Abbreviazioni: PV = vena polmonare; EDF = profondità di campo estesa; LA = atrio sinistro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Colorazione in immunofluorescenza del tessuto di controllo. (A) Colorazione di controllo positiva del ventricolo sinistro murino. I nuclei cellulari sono stati colorati con Hoechst 33342 (blu); i cardiomiociti sono stati marcati con l'anticorpo anti-cTNT (bianco); e le giunzioni gap Cx43+ sono state rilevate con l'anticorpo anti-Cx43 (verde). (B) Colorazione di controllo negativo della PV extrapolmonare destra utilizzando solo anticorpi secondari. I nuclei cellulari sono colorati con Hoechst 33342 (blu). Barre di scala = 20 μm (A), 50 μm (B). Abbreviazioni: LV = ventricolo sinistro; PV = vena polmonare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Cubo filtrante | Filtro di eccitazione | Filtro Emissioni |
| DAP | 350 / 50 | 460 / 50 |
| L5 | 480 / 40 | 527 / 30 |
| TXR | 560 / 40 | 630 / 75 |
Tabella 1: Caratteristiche del filtro di eccitazione e di emissione dei cubi filtranti Leica DM6 B.
| Composto | Concentrazione finale | g o mL / 100 mL richiesti |
| Soluzione di fissaggio | ||
| Paraformaldeide (PFA) 16% | 4% | 25 ml |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x concentrata | 75 ml | |
| Soluzione di permeabilizzazione | ||
| Tritone X-100 | 0.1% | 0,1 mL |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x concentrata | 99,9 ml | |
| Buffer di blocco | ||
| Siero normale (NGS) | 10% | 10 ml |
| Albumina sierica bovina (BSA) | 0.5% | magnesio 0,5 |
| Tween 20 | 0.1% | 0,1 mL |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x concentrata | 89,9 mL | |
| Tampone di lavaggio | ||
| Albumina sierica bovina (BSA) | 0.5% | magnesio 0,5 |
| Tween 20 | 0,1 mL | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x concentrata | 99,9 ml | |
Tabella 2: Ricette tampone.
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Discussion
Con questo protocollo, condividiamo un metodo per distinguere e isolare i PV del cuore di topo ed eseguire la colorazione in immunofluorescenza su di essi. Dopo il prelievo di organi, il cuore e i polmoni sono stati disidratati in una soluzione di saccarosio sterilizzata, seguita dalla separazione dei ventricoli dall'atrio e dai lobi polmonari sotto guida microscopica. Successivamente, la base del cuore è stata preparata per visualizzare i PV seguiti dal taglio dai polmoni all'ilo. La successiva colorazione a immunofluorescenza è stata eseguita utilizzando una criotecnica incorporando il tessuto in un composto OCT, tagliandolo con un criotomo ed eseguendo la colorazione a immunofluorescenza per cTNT e Cx43.
L'isolamento dei PV può essere utile per studiare il loro ruolo nell'aritmogenesi della fibrillazione atriale. Tuttavia, l'isolamento fotovoltaico nei topi è impegnativo. Oltre alle loro piccole dimensioni, i PV sono nascosti dietro i bronchi principali e i vasi prominenti alla base del cuore, contorcendo enormemente il loro rilevamento. Questo protocollo fornisce un modo semplice e trasparente per studiare i PV murini e consente un approccio economico per studiare in dettaglio le loro caratteristiche morfologiche. L'approccio di raccolta e preparazione proposto preserva le relazioni anatomiche tra le PV, i corrispondenti lobi polmonari e l'LA, facilitando le indagini dell'intero complesso tissutale LA-PV.
Gli SM hanno una disposizione eterogenea. Una significativa variabilità nella continuità e nell'orientamento delle fibre è stata descritta in più specie, inclusi ratti ed esseri umani, e si trova principalmente intorno agli orifizi PV 4,20. Queste diversità provocano una conduzione elettrica anisotropa e possono indurre l'inizio delle eccitazioni di rientro e dell'attività autonoma nei PV21. Inoltre, l'interconnessione elettrica tra MS e miocardio atriale alla giunzione LA-PV può portare alla transizione di impulsi elettrici desincronizzati dai PV all'atrio sinistro, con conseguente AF2. Preservare le proporzioni morfologiche alla giunzione LA-PV è, quindi, fondamentale per studiare l'interazione tra il miocardio atriale e le PV. Per raggiungere questo obiettivo, è essenziale l'identificazione accurata dei bronchi principali e dei PA. Abbiamo identificato i punti di riferimento in base alle loro posizioni anatomiche e alle loro relazioni utilizzando un microscopio con ingrandimento 10x e seguendo sistematicamente il loro decorso dalla base del cuore all'LH.
Gli approcci di colorazione basati su coloranti immunoreattivi sono ampiamente consolidati in diverse specie e consentono la rilevazione diretta degli antigeni bersaglio, fornendo un contrasto visivo di alta qualità in microscopia. Questo approccio consente la caratterizzazione sia qualitativa che quantitativa di fette di tessuto intatte a livello proteico. Usiamo l'isotipo cardiaco del TNT per distinguere tra miocardio e muscolatura non cardiaca. La presenza di cardiomiociti nelle PV, così come nelle SVC e IVC è stata descritta in precedenza7. Tuttavia, altre strutture tubulari dei polmoni, tra cui i PA, i bronchi e i vasi polmonari privati, non contengono cellule muscolari cardiache, il che le rende facili da distinguere dalla colorazione IF7. Marcando le proteine della struttura come il cTNT, i cardiomiociti mostrano la loro caratteristica striatura incrociata a seconda del loro orientamento verso il percorso del fascio. La direzione della striatura può essere mappata in ImageJ con plugin come OrientationJ o Directionality Plugin. Questo aiuta a quantificare e caratterizzare la direzionalità dei cardiomiociti e potrebbe essere utile per identificare le regioni con conduzione elettrica anisotropa. Inoltre, questo studio supporta i risultati precedenti riguardanti l'abbondante presenza di Cx43 nel miocardio murino PV, che è organizzato in modo simile al ventricolo sinistro (Figura 4A)15,16. Sorprendentemente, abbiamo osservato giunzioni gap sulla membrana laterale dei cardiomiociti nei PV murini. Questa condizione, nota come lateralizzazione, è stata dimostrata come un meccanismo fisiopatologico nella fibrillazione atriale, specialmente nei topi maschi22. Pertanto, questo protocollo evidenzia il potenziale per studi simili nei cardiomiociti della SM di topo.
L'isolamento PV è una tecnica importante per la ricerca sull'aritmia poiché consente una serie di indagini, tra cui la colorazione IF, la citometria a flusso, lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza, la mappatura ottica e il patch clamp. Tuttavia, poiché l'attuale protocollo è stato stabilito per l'imaging IF di tessuto fisso e incorporato, attualmente manca una prova diretta che i cardiomiociti possono essere isolati da preparati PV con una qualità sufficiente per consentire esperimenti come il patch clamp. Il successo della microdissezione dipende dall'esperienza del ricercatore a causa delle piccole dimensioni e della fragilità del tessuto cardiaco murino. Anche la qualità dell'imaging IF dipende in gran parte dalla fase di inclusione. Le disposizioni orizzontali sono difficili da ottenere, l'integrità tissutale delle sezioni può risentirne e i PV possono rompersi se non sono riempiti con composto OCT. Inoltre, la validità del protocollo è limitata all'imaging 2D, in quanto il metodo non consente la ricostruzione 3D dei PV.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare (DZHK; 81X3600221to H.V., 81X2600255 to S.C.), dal China Scholarship Council (CSC201808130158 to R.X.), dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG; Clinician Scientist Program in Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 a P. T.), e la Fondazione Corona (S199/10079/2019 a S. C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
References
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