Summary
Este protocolo demonstra isolamento guiado por microscopia e coloração por imunofluorescência de veias pulmonares murinas. Preparamos amostras de tecido contendo o átrio esquerdo, veias pulmonares e pulmões correspondentes e as coramos para troponina cardíaca T e Conexina 43.
Abstract
As veias pulmonares (VVPs) são a principal fonte de batimentos ectópicos nas arritmias atriais e desempenham um papel crucial no desenvolvimento e progressão da fibrilação atrial (FA). As VPs contêm mangas miocárdicas (SM) compostas por cardiomiócitos. A SM está implicada no início e manutenção da FA, pois preserva semelhanças com o miocárdio cardíaco de trabalho, incluindo a capacidade de gerar impulsos elétricos ectópicos. Os roedores são amplamente utilizados e podem representar excelentes modelos animais para o estudo do miocárdio da veia pulmonar, uma vez que os cardiomiócitos estão amplamente presentes em toda a parede do vaso. No entanto, a microdissecção precisa e a preparação de PVs murinos são desafiadoras devido ao pequeno tamanho do órgão e à intrincada anatomia.
Demonstramos um protocolo de microdissecção guiado por microscopia para isolar o átrio esquerdo (AE) murino juntamente com as VVPPs. A coloração por imunofluorescência usando anticorpos cardíacos Troponina-T (cTNT) e conexina 43 (Cx43) é realizada para visualizar o AE e as VPs em toda a extensão. A aquisição de imagens em aumentos de 10x e 40x fornece uma visão abrangente da estrutura das VVPN, bem como informações detalhadas sobre a arquitetura miocárdica, destacando particularmente a presença de conexina 43 dentro da EM.
Introduction
A fibrilação atrial (FA) é a arritmia sustentada mais comum1. A prevalência da FA está aumentando ainda mais, com um número esperado de ~17,9 milhões de pacientes na Europa em 20601. A FA é clinicamente de grande importância, pois é um fator de risco essencial para o desenvolvimento de infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca ou acidente vascular cerebral, resultando em uma enorme carga individual, social e socioeconômica1. Embora a FA seja conhecida há décadas, a fisiopatologia da FA ainda não étotalmente compreendida2.
Já no final da década de 1990, estudos demonstraram o grande impacto das veias pulmonares (VVPs) no início e manutenção da FA, pois são a principal fonte de batimentos ectópicos desencadeantes de FA3. Foi demonstrado que os PVs diferem estruturalmente de outros vasos sanguíneos. Enquanto os vasos sanguíneos típicos contêm células musculares lisas, a túnica média dos PVs também contém cardiomiócitos4. Em roedores, essa musculatura cardíaca está presente em toda a VP, incluindo as partes intra e extrapulmonares, bem como na região doorifício5. Em humanos, as VPs também contêm cardiomiócitos, que podem ser observados dentro de extensões do miocárdio do átrio esquerdo (AE), as chamadas mangas miocárdicas (SM)6,7.
A SM tem semelhanças morfológicas com o miocárdioatrial8. A forma e o tamanho dos cardiomiócitos atriais e PV não variam significativamente entre si e apresentam propriedades eletrofisiológicas comparáveis8. Registros eletrofisiológicos dentro do PV comprovaram a atividade elétrica da SM, e imagens angiográficas revelaram contrações sincronizadas com os batimentos cardíacos 9,10.
As junções comunicantes são complexos proteicos formadores de poros compostos por seis subunidades de conexinas, que permitem a passagem de íons e pequenas moléculas11. As junções comunicantes existem nas aposições célula-célula, interconectam cardiomiócitos vizinhos e permitem um acoplamento elétrico intercelular entre os cardiomiócitos12,13. Várias isoformas de conexina são expressas no coração, sendo a conexina 43 (Cx43) a isoforma mais comum expressa em todas as regiões docoração14. Estudos prévios evidenciam a expressão da Cx43 em cardiomiócitos dasVPs15,16.
Permanece um desafio investigar a EM dentro de PVs intactos devido à sua estrutura delicada, especialmente em modelos animais de pequeno porte. Aqui, demonstramos como identificar e isolar PVs juntamente com AL e lobos pulmonares em camundongos usando microdissecção guiada por microscopia. Além disso, demonstramos a coloração por imunofluorescência (IF) dos PVs para visualizar os cardiomiócitos e suas interconexões dentro dos PVs.
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Protocol
Os cuidados com os animais e todos os procedimentos experimentais foram conduzidos seguindo as diretrizes do Comitê de Ética e Cuidados com Animais da Ludwig-Maximilians-University of Munich, e todos os procedimentos com camundongos foram aprovados pelo Regierung von Oberbayern (ROB 55.2-2532. Vet_02-20-215, ROB 55.2-2532. Vet_02-18-46, ROB 55.2-2532. Vet_02-19-86, ROB 55.2-2532. Vet_02-21-178, ROB 55.2-2532. Vet_02-22-170). Camundongos C57BL6/N foram obtidos comercialmente.
1. Preparo
- Preparar um gel de agarose a 3% misturando 3 mg de agarose e 100 ml de solução salina 1x tamponada com Tris num balão de Erlenmeyer de 500 ml. Aqueça a solução no micro-ondas a 600 W por 2-3 min até que o gel fique homogêneo.
- Prepare a placa de dissecção despejando suavemente o gel em uma placa de Petri de 100 mm de diâmetro. Recheie a placa de Petri pela metade com gel. Limpe as bolhas do gel para garantir uma consistência homogênea. Deixe a placa de dissecção esfriar até que o gel fique sólido.
- Prepare todos os tampões e soluções necessários, incluindo solução de fixação, solução de permeabilização, tampão de bloqueio e tampão de lavagem de acordo com as receitas fornecidas na Tabela 1.
2. Captação de órgãos e preparação de tecidos
NOTA: Um extenso protocolo detalhando o procedimento de anestesia em camundongos e coleta do coração foi publicadoanteriormente 17,18. Assim, apresentamos apenas uma breve descrição dessa parte. Os experimentos foram realizados em camundongos C57BL6 com 12 a 16 semanas de idade (seis machos e quatro fêmeas). O peso corporal do macho variou de 26 g para 28 g e o peso corporal da fêmea de 19 g para 22 g. As etapas seguintes foram realizadas sem injeção prévia de heparina sistêmica.
- Anestesiar o camundongo com isoflurano (5%, oxigênio a 95%, fluxo: 1 L/min) e garantir profundidade suficiente da anestesia.
- Transfira o mouse para a mesa de operação, posicionando-o em decúbito dorsal. Manter a narcose com inalação de isoflurano (2%, oxigênio a 98%, Fluxo: 1 L/min) através de uma máscara de anestesia e fixar o mouse com fita adesiva em suas extremidades. Injetar fentanil para analgesia (0,1 mg/25 g de peso corporal i.p.).
- Levante o pelo no processo xifoidal e defina um corte transversal de 2 mm. Desconecte a pele da fáscia subcutânea com dissecção romba (dorso da tesoura) e estenda o corte craniana e lateralmente para expor o tórax.
- Abra cuidadosamente o abdome caudal ao arco costal. Levante o processo xifoidal levemente para incisar o diafragma da caudal e fazer os pulmões colapsarem. Em seguida, cortar o diafragma da esquerda para a direita sem lesar nenhum órgão e abrir o tórax bilateralmente para expor o coração.
- Cortar a veia cava inferior (VCI) enquanto o coração ainda está batendo para exsanguinar o camundongo e proceder à perfusão do coração penetrando o ventrículo esquerdo com uma agulha 27 G e injetando 10 mL de solução salina 1x tamponada com fosfato (PBS) gelada.
- Depois de limpar o sangue do coração de camundongo, localize o arco aórtico, a veia cava superior (VCS) e a traqueia. Corte-os ~3 mm acima da base do coração e colha o coração junto com os pulmões conectados.
- Submergir os órgãos retirados em um tubo cônico de 10 mL contendo 2 mL de solução esterilizada de sacarose a 30%. Deixar desidratar as amostras durante 24 h a 4 °C.
3. Preparação guiada por microscopia de AL e PVs
- Coloque o coração e os pulmões desidratados em uma placa de dissecção contendo 40-50 mL de 1x PBS. Coloque-o sob um microscópio de campo brilhante com ampliação de 10x e configure a iluminação. Coloque o coração com sua superfície dorsal sobre a placa de dissecção. Identificar a transição entre a parede ventricular e atrial e separar cuidadosamente os ventrículos dos átrios com tesoura cirúrgica.
OBS: Corte aproximadamente 1 mm inferior aos átrios para manter algum tecido ventricular. Isso será necessário mais tarde para fixar os átrios na placa de dissecção sem danificar estruturas na base do coração. Sugerimos a manutenção dos ventrículos, pois eles podem ser usados como amostra de controle positivo. Para incorporar o tecido ventricular, siga o mesmo procedimento descrito para a incorporação das VPs, conforme descrito na seção 4. - Colocar os átrios separados com a superfície de corte ventricular (passo 3.1) na placa de dissecção de modo a que a base do coração esteja virada para cima. Orientar os átrios de modo que os lobos pulmonares sejam posteriores, o AE e o apêndice atrial esquerdo (AAE) estejam à direita e o átrio direito (AD) e o apêndice atrial direito (AAR) estejam à esquerda. Fixe a preparação fixando o tecido ventricular esquerdo restante na placa de dissecção. Espalhe suavemente os lobos pulmonares sem aplicar força excessiva e fixe-os na placa de dissecção (Figura 1A).
- Obtenha uma visão geral dos pontos anatômicos na base do coração.
- Encontre a aorta com o arco aórtico no centro da base do coração.
- Detectar o tronco pulmonar (TP) diretamente à direita da aorta e seguir seu curso em direção à posterior para distinguir as artérias pulmonares (APs). Verificar sua localização seguindo seu curso até o lobo esquerdo e lobos superior/médio direito para encontrar o hilo pulmonar (LH) correspondente.
- Determinar a posição da traqueia e/ou dos brônquios principais esquerdo e direito (L Br, R Br), que estão localizados posteriormente à aorta, e verificar sua localização seguindo seu curso em direção ao LH (Figura 1A).
- Localize a VCS à esquerda da aorta e verifique seguindo seu curso para o AD ao lado do RAA.
- Remova o tecido conjuntivo e adiposo ao redor da base do coração, preservando todos os pontos de referência identificados mencionados acima. Além disso, remover o arco aórtico e a traqueia para ter uma visão livre da base do coração (Figura 1B).
- Separe suavemente os APs da superfície superior do átrio por dissecção romba usando pinças finas. Em seguida, corte-os no LH e vire-os para o lado para expor a parede livre do átrio esquerdo (AAF) e as VVP em toda a sua dimensão. Cortar os brônquios principais do LH e remover o tecido brônquico (Figura 1C).
NOTA: O LH serve tanto como ponto de entrada comum para APs e vias aéreas nos pulmões, quanto como ponto de saída para os PVs. É importante realizar todos os procedimentos no LH com cuidado para evitar qualquer dano aos PVs. - Para separar o AE/AR e os ventrículos esquerdo e direito (VE, VD), realizar um corte partindo da parte anterior do VD restante para cima, passando pela valva tricúspide (VC) até a face anterior da VCS para abrir a AD pelo lado frontal. Cortar a parede livre de AR posterior (RAFW) junto ao septo interatrial para separar o AD e o AE. Cortar a parede posterior do ventrículo direito junto ao septo interventricular para cortar completamente o VE e o VD.
NOTA: Um extenso protocolo descrevendo detalhadamente o procedimento de preparo e isolamento do átrio direito foi publicado anteriormente19. A separação da AR é útil para remover tecido indesejado do complexo tecidual LA-PV e coletar tecido para experimentos adicionais. - Reduza o tamanho dos lobos pulmonares cortando parte do tecido pulmonar basal para que aproximadamente 3-4 mm de tecido pulmonar seja deixado.
NOTA: Preservar os ápices dos lóbulos pulmonares, pois eles servem como flutuadores durante as etapas subsequentes de incorporação e permitem a incorporação dos PVs horizontalmente no composto O.C.T.
4. Incorporação de tecidos
- Transfira a preparação, incluindo LA e PVs, para um criomold, garantindo que a base do coração e o ápice do pulmão estejam voltados para cima. Organize-os em uma configuração fisiológica - certifique-se de que os PVs não sejam torcidos ou invertidos.
- Encha o criomold com composto O.C.T e comprima suavemente os PVs com pinças finas para remover o ar restante. Manter sua configuração fisiológica inalterada durante todo o processo.
- Coloque o criomold com o tecido embutido no gelo seco para congelar o composto O.C.T. Conservar as amostras a -80 °C para utilização futura.
NOTA: É crucial manter os PVs em uma posição horizontal para garantir a obtenção de seções que contenham PVs em todo o comprimento para procedimentos subsequentes.
5. Corte e coleta de cortes de tecidos congelados
NOTA: Para o corte dos blocos de tecido, as configurações da máquina foram ajustadas para uma temperatura do corpo de prova de -18 °C e temperatura da lâmina de -25 °C.
- Instale um bloco de tecido no suporte da amostra aplicando uma camada de composto O.C.T. entre o bloco de tecido e o suporte da amostra. Congele-os por 3-4 min.
- Bloqueie a cabeça do espécime e carregue o suporte do espécime com o bloco de tecido na cabeça do espécime fechando a alavanca de liberação do mandril do espécime. Ajuste finamente a posição do bloco de tecido usando os botões de ajuste fino.
- Retire o criomold do espécime. Desbloqueie a cabeça do espécime e o freio elétrico do criostato.
- Ajuste o criostato para o modo de corte com um tamanho de corte entre 30 μm e 50 μm. Aparar o espécime de tecido até que os PVs se tornem visíveis.
- Mude para o modo de corte de secção fina e ajuste a espessura para 10 μm. Comece a coletar cortes, incluindo PVs e tecido pulmonar e atrial conectados. Colete seções usando uma placa anti-rolagem ou fixando a extremidade livre de cada seção no suporte da lâmina com uma escova fria fina e espalhe-as.
- Posicione uma lâmina (mantida à temperatura ambiente) adjacente à seção. Solte cuidadosamente a seção do pincel, permitindo que a seção adera naturalmente à lâmina, pois a seção congelada e o composto O.C.T. derretem ao tocar a superfície da lâmina mais quente.
NOTA: Manter uma condição estável e suave durante o processo de seccionamento para evitar rupturas ou dobras nas seções. Substitua a lâmina por uma nova lâmina, se necessário. - Colete até três seções em cada slide. Rotule as lâminas e guarde-as a -20 °C.
NOTA: Recomendamos coletar pelo menos cinco seções (equivalente a dois slides) para cada PV.
6. Coloração por imunofluorescência das criossecções das VPs
- Disponha as lâminas congeladas em um sistema de coloração e deixe as seções descongelarem por aproximadamente 20 min à temperatura ambiente.
OBS: Encher o sistema de coloração com água para manter as amostras umidificadas. A secagem do tecido pode danificar antígenos, causando ligação inespecífica de anticorpos e artefatos de coloração excessiva durante os procedimentos de coloração. - Após 20 min de descongelamento, cobrir os cortes com algumas gotas de solução fixadora (paraformaldeído [PFA] a 4%, Tabela 1) para fixar o tecido nas lâminas por 10 min à temperatura ambiente.
- Após a fixação, transfira as corrediças para o rack deslizante vertical e mergulhe-as em um recipiente preenchido com 1x PBS. Coloque o recipiente em um agitador em baixa velocidade e lave as lâminas por 5 min. Repita este ciclo de lavagem mais duas vezes, usando 1x PBS fresco de cada vez.
- Após a lavagem, circule cada seção individual em cada lâmina com uma caneta bloqueadora de líquido contendo xilol. Reorganizar as lâminas no sistema de coloração e aplicar 1 ou 2 gotas de solução de permeabilização (Triton X-100 a 0,1%, Tabela 1) em cada amostra com pipeta de Pasteur. Deixar incubar as secções à temperatura ambiente durante 10 minutos para permeabilizar as membranas celulares e da organela celular.
- Após a permeabilização, remover a solução de Triton X-100 a 0,1% lavando as lâminas por 3 x 5 min em PBS 1x, seguindo o mesmo procedimento descrito na Etapa 6.3.
- Após a lavagem, reorganize as lâminas no sistema de coloração e aplique 1 ou 2 gotas do Buffer de Bloqueio (Tabela 1) em cada seção, garantindo que estejam totalmente cobertas com o buffer de bloqueio. Deixe as lâminas incubarem por 1 h à temperatura ambiente.
- Preparar 1 ml da mistura de anticorpos primários pipetando 5 μL de um anticorpo anti-cTNT de rato (diluído 1:200) e 1 μL de um anticorpo anti-Cx43 de coelho (diluído 1:1.000) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml preenchido com 994 μL de tampão de bloqueio. Pipetar a mistura para cima e para baixo para garantir uma mistura completa.
NOTA: Ajuste a quantidade de mistura de anticorpos aplicada de acordo com o tamanho da seção. Certifique-se de que as secções estão totalmente cobertas pela mistura de anticorpos. A concentração, o tempo de incubação e a temperatura ótima de incubação dos anticorpos podem variar dependendo de fatores como tipo de anticorpo, clones de anticorpos e características teciduais. Recomendamos testar e otimizar as condições de coloração individualmente para cada anticorpo. - Após a etapa de bloqueio (etapa 6.6), remova o buffer de bloqueio restante e aplique diretamente 2 ou 3 gotas da mistura de anticorpos primários em cada seção. Deixe as lâminas incubarem durante a noite a 4 °C.
- Após a incubação do anticorpo primário, lavar as lâminas por 3 x 5 min com tampão de lavagem sob agitação suave (Tabela 1).
- Preparar 1 ml da mistura de anticorpos secundários pipetando 1 μL de um anticorpo secundário anti-rato-cabra conjugado com AF488 (diluído 1:1.000) e 1 μL de um anticorpo secundário anticoelho de cabra conjugado AF568 (diluído 1:1.000) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml preenchido com 998 μL de tampão de lavagem. Pipetar a mistura para cima e para baixo para misturar bem.
- Após a etapa de lavagem (passo 6.9), reorganizar as lâminas no sistema de coloração e aplicar 2 ou 3 gotas da mistura de anticorpos secundários em cada seção com uma pipeta. Permitir que os anticorpos incubem por 45 min à temperatura ambiente, protegendo as amostras da luz para evitar a extinção do fluoróforo. Após a incubação do anticorpo secundário, lavar as lâminas por 3 x 5 min com tampão de lavagem sob agitação suave (Tabela 1).
- Reorganize as lâminas no sistema de coloração. Contramanchar as secções com Hoechst-33342 (numa diluição de 1:1.000 em 1x PBS) aplicando 2 a 3 gotas da solução Hoechst-33342 em cada secção. Deixe as lâminas incubarem por 10 min à temperatura ambiente.
- Após a incubação, lavar as lâminas 3 x 5 min com tampão de lavagem sob agitação suave (Tabela 1). Monte as lâminas aplicando 1 ou 2 gotas de meio de montagem fluorescente em cada lâmina. Cubra as corrediças com lamínulas.
NOTA: Certifique-se de que a tampa está plana ao colocá-la. Se houver bolhas de ar, aplique suavemente pressão na lateral da bolha para removê-las. - Guarde as corrediças montadas em uma proteção de slides a 4 °C.
NOTA: Recomenda-se criar imagens dos slides o mais cedo possível. Este protocolo não é válido exclusivamente para os anticorpos mencionados. Os antígenos-alvo e os anticorpos podem ser substituídos ou modificados de acordo com os requisitos individuais do experimento ou estratégias alternativas de detecção de antígenos.
7. Imagem dos cortes corantes de imunofluorescência
- Configure o microscópio.
- Inicie o microscópio com a fonte de luz laser, o computador conectado e o software que o acompanha seguindo o manual do fabricante.
- Entre no menu Configuração . Clique para selecionar o tipo de câmera adequado para imagens de fluorescência (por exemplo, DFC365FX câmera monocromática).
- Entre no menu Adquirir e crie três canais.
- Selecione o canal FCr1 para a detecção de Hoechst-33342, rotule-o e selecione o cubo de filtro DAP na seção de seleção. Ajuste o tempo de exposição para 200 ms, o ganho eletrônico para 2 e a intensidade da luz para 17%.
- Selecione o canal FCr2 para a detecção de cTNT (corado com anticorpo conjugado AF488), rotule-o e selecione o cubo de filtro L5 na seção de seleção. Ajuste o tempo de exposição para 200-300 ms, o ganho eletrônico para 1,8 e a intensidade da luz para 100%.
- Selecione o canal FCr3 para a detecção de Cx43 (corado com anticorpo conjugado AF568), rotule-o e selecione o cubo de filtro TXR na seção de seleção. Ajuste o tempo de exposição para 150 ms, o ganho eletrônico para 2 e a intensidade da luz para 100%.
NOTA: As características espectrais dos cubos de filtro estão listadas na Tabela 2.
- Coloque a lâmina no palco do microscópio.
- Execute uma visão geral da imagem com ampliação de 10x:
- Selecione a objetiva de 10x e abra o obturador a laser clicando em Ao vivo. Com o canal FCr1 selecionado, use a função de navegador para navegar pelo slide até que um sinal seja detectado. Focalize aproximadamente a amostra até que os núcleos celulares sejam distinguíveis.
- Inicie o modo de varredura em espiral para capturar uma visualização completa da amostra. Desative ao vivo clicando no botão novamente para proteger o espécime. Identificar o AE, os PVs e o tecido pulmonar.
- Definir a área de interesse para a varredura de blocos subsequente; Selecione vários pontos de foco dentro da área de interesse. Clique em Ao vivo no canal FCr1 e ajuste o foco para cada ponto de foco. Salve as posições Z correspondentes, que representam a posição de foco exata para cada ponto de foco. Inicie a varredura de bloco com ampliação de 10x para capturar uma imagem de visão geral completa da amostra.
- Depois que a varredura for concluída, abra a varredura de bloco e mescle as imagens individuais. Para melhorar o brilho e o contraste de canais individuais, selecione-os na barra de objetos e ajuste seu intervalo de sinal com os controles deslizantes, conforme desejado.
- Obtenha imagens ampliadas com ampliação de 40x :
- Selecione o objetivo 40x. Ajuste as configurações de tempo de exposição e ganho para cada canal da seguinte forma: FCr1: cubo de filtro DAP: tempo de exposição: 50 ms, ganho: 1,5; FCr2: cubo do filtro L5: tempo de exposição: 80 ms, ganho: 1,8; FCr3: cubo de filtro TXR: tempo de exposição: 20 ms, ganho: 2.
- Use a imagem de visão geral da etapa 7.3 para localizar o orifício PV (PVO), bem como as regiões extrapulmonar e intrapulmonar PV (PVex, PVin). Defina esta área a ser digitalizada.
- Abra o submenu Imagem e clique em z para ativar o Z-Stack.
- Selecione o canal FCr1 e abra o obturador a laser para obter uma visualização ao vivo .
- Vá para o submenu Z-Stack e determine os pontos de início e fim do Z-Stack girando obotão de ajuste fino f ocus no sentido horário e anti-horário até que o sinal geral comece a perder o foco.
- Depois de configurar o intervalo de foco, selecione o modo Z-Stack otimizado pelo sistema e ative a opção calcular imagens de profundidade de campo estendida (EDF). Dependendo de quão plano é o tecido, espere aproximadamente 20 camadas com um intervalo de passo de aproximadamente 0,5 μm.
- Inicie a varredura de blocos. Após a digitalização, abra a varredura de bloco e mescle somente a imagem EDF. Para melhorar o brilho e o contraste de canais individuais, selecione-os na barra de objetos e ajuste seu intervalo de sinal com os controles deslizantes conforme desejado (consulte a etapa 7.3.4).
- Depois de gerar as imagens, salve o projeto e exporte ambos, a versão mesclada e os canais brutos de cada imagem como um arquivo TIFF.
Observação : salvar os arquivos como TIFF legível ImageJ permite que o ImageJ importe o tamanho do bloco original em μm em vez de pixels. Sempre feche o obturador do laser sempre que um sinal de laser não for necessário para evitar o fotoclareamento dos anticorpos secundários.
8. Edição de imagem com ImageJ
- Carregue os arquivos de canal brutos correspondentes no ImageJ. Clique na Imagem | Cor | Mescle e escolha a cor desejada para cada canal.
- Crie uma barra de escala selecionando Analisar | Ferramentas | Dimensione a barra e cole-a no canto inferior direito. Prossiga com o processamento e análise adicionais de acordo com os requisitos de imagem. Salve as imagens mescladas quando terminar.
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Representative Results
Realizamos a microdissecção, coloração e imagem das VPs em 10 camundongos de 12-16 semanas de idade. Seguindo o protocolo, microdissecamos com sucesso as VPs juntamente com o AL em todos os camundongos experimentais e obtivemos cortes com uma visão abrangente das VPs em oito camundongos. As imagens de visão geral foram obtidas em aumento de 10x para identificar a região do orifício das VVP (PVO) na junção AE-PV, as VPs extrapulmonares (PVex) (VPs entre o hilo pulmonar e a junção AE-PV) e as VVP intrapulmonares (PVin) (VPs circundadas por tecido pulmonar) (Figura 2). Imagens ampliadas das regiões citadas foram obtidas com objetiva de aumento de 40x (Figura 3).
Encontramos sinais específicos de TNT com estriação muscular típica no PVO, noVP ex e no PVin (Figura 3). A Cx43 foi encontrada nas três regiões das VVPP e foi projetada principalmente entre cardiomiócitos vizinhos (Figura 3 e Figura 4A). Sinais relacionados à Cx43 foram observados tanto no lado polar (Figura 3, setas amarelas) quanto na face lateral dos cardiomiócitos na FM (Figura 3, setas vermelhas).
Figura 1: Identificação das veias pulmonares murinas ao microscópio. Microscopia de campo brilhante (aumento de 10x). O coração é fixado à placa de dissecção com quatro pinos no átrio, no lobo pulmonar esquerdo, no lobo pulmonar médio direito e no lobo pulmonar inferior direito. (A) Visão geral da base do coração após separação do tecido ventricular do átrio com o arco aórtico no meio. O átrio está localizado na parte inferior; Os lobos pulmonares estão espalhados na metade superior do quadro. As VPs são ocultadas pelos AA, pelos brônquios principais e pelos APs. (B) Imagem em cima da base do coração após a remoção da traqueia, partes dos brônquios principais, arco aórtico, bem como tecido conjuntivo e adiposo. Os APs no meio da imagem mostram seu curso completo do TP ao LH e cobrem os VPs. (C) Imagem de visão superior dos VPs após o corte dos APs dos lobos pulmonares e remoção do tecido brônquico extrapulmonar. Barras de escala = 5 mm. Abreviações: AA = arco aórtico; AscA = aorta ascendente; VCI = veia cava inferior; L Br = brônquio principal esquerdo; L PV = veia pulmonar esquerda; AE-VP J = junção átrio-veia pulmonar esquerda; AAE = apêndice atrial esquerdo; PAAF = parede livre do átrio esquerdo; LH = hilo pulmonar; L. LL = lobo pulmonar esquerdo; APs = artérias pulmonares; TP = tronco pulmonar; R Br = brônquio principal direito; R PV = veia pulmonar direita; R-A PV = veia pulmonar ascendente direita; AR = apêndice atrial direito; LL = lobo pulmonar acessório direito; R. inf. LL = lobo pulmonar inferior direito; R. mid. LL = lobo médio do pulmão direito; LL = lobo pulmonar superior direito; VCS = veia cava superior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visão geral das veias pulmonares de camundongos adultos e do átrio esquerdo em imagem de corte transversal por microscopia de imunofluorescência. Os núcleos celulares foram corados com Hoechst-33342 (azul); os cardiomiócitos foram marcados com anticorpo anti-cTNT (branco); e as junções comunicantes foram detectadas com o anticorpo anti-Cx43 (verde). Os retângulos brancos destacam as seguintes regiões: a, orifício PV (PVO); b, PV extrapulmonar (PVex); e c, PV intrapulmonar (PVin). Barra da escala = 500 μm. Abreviações: L PV = veia pulmonar esquerda; AAE = apêndice atrial esquerdo; PAAF = parede livre do átrio esquerdo; VE-EP = ventrículo esquerdo - trajeto de ejeção; R PV = veia pulmonar direita; R-A PV = veia pulmonar ascendente direita; VD = Ventrículo direito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Ampliação do miocárdio PV direito por microscopia de imunofluorescência. Os núcleos celulares foram corados com Hoechst-33342 (azul); os cardiomiócitos foram marcados com anticorpo anti-cTNT (branco); e as junções comunicantes Cx43+ foram detectadas pelo anticorpo anti-Cx43 (verde). (A) Imagens de telhas de FED mostrando um corte longitudinal através do PV extrapulmonar direito. O orifício do AE e das VVPP não são mostrados na imagem e estariam localizados à esquerda, enquanto as VVPP intrapulmonares e o parênquima pulmonar correspondente (também não mostrado) estariam localizados à direita. (B,C) FED em bloco único da VVPP extrapulmonar direita. As setas destacam as junções comunicantes Cx43+ nas bordas celulares dos cardiomiócitos. As setas amarelas indicam junções comunicantes nos lados polares dos cardiomiócitos, colocalizadas com discos intercalados, enquanto as setas vermelhas indicam junções comunicantes na face lateral dos cardiomiócitos. Barras de escala = 50 μm (A), 20 μm (B,C). Abreviações: VP = veia pulmonar; FED = profundidade de campo alargada; AE = átrio esquerdo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Coloração por imunofluorescência do tecido controle. (A) Coloração de controle positivo do VE murino. Os núcleos celulares foram corados com Hoechst 33342 (azul); os cardiomiócitos foram marcados com anticorpo anti-cTNT (branco); e as junções comunicantes Cx43+ foram detectadas com o anticorpo anti-Cx43 (verde). (B) Coloração de controle negativo do PV extrapulmonar direito usando apenas anticorpos secundários. Os núcleos celulares são corados com Hoechst 33342 (azul). Barras de escala = 20 μm (A), 50 μm (B). Abreviações: VE = ventrículo esquerdo; VP = veia pulmonar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Filtro-Cubo | Filtro de Excitação | Filtro de Emissões |
| DAP | 350 / 50 | 460 / 50 |
| L5 | 480 / 40 | 527 / 30 |
| TXR | 560 / 40 | 630 / 75 |
Tabela 1: Características dos filtros de excitação e emissão dos cubos de filtro Leica DM6 B.
| Composto | Concentração final | g ou mL / 100 mL necessários |
| Solução de fixação | ||
| Paraformaldeído (PFA) 16% | 4% | 25 mL |
| Fosfato Salino Tamponada (PBS) 1x concentrado | 75 mL | |
| Solução de Permeabilização | ||
| Tritão X-100 | 0.1% | 0,1 mL |
| Fosfato Salino Tamponada (PBS) 1x concentrado | 99,9 mL | |
| Buffer de bloqueio | ||
| Soro normal (NGS) | 10% | 10 mL |
| Albumina de Soro Bovino (BSA) | 0.5% | 0,5 mg |
| Interpolação 20 | 0.1% | 0,1 mL |
| Fosfato Salino Tamponada (PBS) 1x concentrado | 89,9 mL | |
| Tampão de lavagem | ||
| Albumina de Soro Bovino (BSA) | 0.5% | 0,5 mg |
| Interpolação 20 | 0,1 mL | |
| Fosfato Salino Tamponada (PBS) 1x concentrado | 99,9 mL | |
Tabela 2: Receitas de tampão.
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Discussion
Com esse protocolo, compartilhamos um método para distinguir e isolar os PVs do coração de camundongos e realizar a coloração de imunofluorescência neles. Após a retirada dos órgãos, o coração e os pulmões foram desidratados em solução de sacarose esterilizada, seguindo-se a separação dos ventrículos do átrio e dos lobos pulmonares sob orientação microscópica. Em seguida, a base do coração foi preparada para visualizar as VVPP e cortá-las dos pulmões no hilo. A coloração subsequente por imunofluorescência foi realizada por criotécnica, incorporando-se o tecido no composto O.C.T., cortando-o com criótomo e realizando-se a coloração por imunofluorescência para cTNT e Cx43.
O isolamento das VVPP pode ser útil para estudar seu papel na arritmogênese da FA. No entanto, o isolamento PV em camundongos é um desafio. Além de seu pequeno tamanho, os PVs estão escondidos atrás dos brônquios principais e dos vasos proeminentes na base do coração, dificultando sua detecção massivamente. Este protocolo fornece uma maneira simples e transparente de investigar as PVs murinas e permite uma abordagem econômica para estudar suas características morfológicas em detalhes. A abordagem de coleta e preparo proposta preserva as relações anatômicas entre as VPs, os lobos pulmonares correspondentes e o AE, facilitando a investigação de todo o complexo tecidual AE-PV.
A EM tem um arranjo heterogêneo. Variabilidade significativa na continuidade e orientação das fibras tem sido descrita em várias espécies, incluindo ratos e humanos, e são encontradas principalmente ao redor dos orifícios PV 4,20. Essas diversidades resultam em condução elétrica anisotrópica e podem induzir o início de excitações de reentrada e atividade autonômica em PVs21. Além disso, a interconexão elétrica entre a EM e o miocárdio atrial na junção AE-PV pode levar à transição de impulsos elétricos dessincronizados das VPs para o átrio esquerdo, resultando em FA2. A preservação das proporções morfológicas na junção AE-PV é, portanto, crucial para o estudo da interação entre o miocárdio atrial e as VVPP. Para isso, a identificação precisa dos brônquios principais e APs é essencial. Os pontos de referência foram identificados de acordo com suas posições anatômicas e relações utilizando um microscópio com aumento de 10x e acompanhando sistematicamente seu trajeto desde a base do coração até o LH.
Realizamos a coloração IF das PVs murinas. As abordagens de coloração baseadas em corantes imunorreativos são amplamente estabelecidas em diferentes espécies e permitem a detecção direta de antígenos-alvo, proporcionando contraste visual de alta qualidade em microscopia. Esta abordagem permite a caracterização qualitativa e quantitativa de cortes de tecido intactos em nível de proteína. Utilizamos o isotipo cardíaco do TNT para distinguir entre miocárdio e musculatura não cardíaca. A presença de cardiomiócitos nas VPs, assim como na CVL e na VCI já foi descritapreviamente7. No entanto, outras estruturas tubulares dos pulmões, incluindo APs, brônquios e vasos pulmonares privados, não contêm células musculares cardíacas, o que as torna fáceis de distinguir pela coloração de FI7. Ao marcar proteínas estruturais como o cTNT, os cardiomiócitos mostram sua estriação cruzada característica dependendo de sua orientação para o caminho do feixe. A direção da estriação pode ser mapeada no ImageJ com plugins como OrientationJ ou Directionality Plugin. Isso auxilia na quantificação e caracterização da direcionalidade dos cardiomiócitos e pode ser útil na identificação de regiões com condução elétrica anisotrópica. Além disso, este estudo corrobora achados anteriores quanto à presença abundante de Cx43 no miocárdio PV murino, que se organiza de forma semelhante ao VE (Figura 4A)15,16. Notavelmente, observamos junções comunicantes na membrana lateral dos cardiomiócitos em PVs murinos. Essa condição, conhecida como lateralização, tem sido demonstrada como mecanismo fisiopatológico na FA, especialmente em camundongosmachos22. Assim, este protocolo destaca o potencial para estudos semelhantes em cardiomiócitos MS de camundongos.
O isolamento PV é uma técnica importante para a pesquisa de arritmias, pois permite uma série de investigações, incluindo coloração de FI, citometria de fluxo, classificação de células ativadas por fluorescência, mapeamento óptico e patch clamp. No entanto, desde que o protocolo atual foi estabelecido para imagens de FI de tecido fixo e embutido, atualmente falta prova direta de que os cardiomiócitos podem ser isolados de preparações de PV em qualidade suficiente para permitir experimentos como patch clamp. O sucesso da microdissecção depende da experiência do pesquisador devido ao pequeno tamanho e fragilidade do tecido cardíaco murino. A qualidade da imagem de FI também depende em grande parte da etapa de incorporação. Arranjos horizontais são difíceis de alcançar, a integridade tecidual dos cortes pode sofrer e os PVs podem se romper se não forem preenchidos com composto de O.C.T. Além disso, a validade do protocolo é limitada à imagem 2D, uma vez que o método não permite a reconstrução 3D das VPs.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular (DZHK; 81X3600221to H.V., 81X2600255 to S.C.), pelo China Scholarship Council (CSC201808130158 a R.X.), pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG; Programa de Cientista Clínico em Medicina Vascular (PRIME), MA 2186/14-1 a P. T.), e a Fundação Corona (S199/10079/2019 a S. C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
References
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