Summary
Этот протокол демонстрирует изоляцию под контролем микроскопии и иммунофлуоресцентное окрашивание легочных вен мышей. Мы подготавливаем образцы тканей, содержащие левое предсердие, легочные вены и соответствующие легкие, и окрашиваем их на сердечные тропонины Т и коннексин 43.
Abstract
Легочные вены (ЛВ) являются основным источником эктопических биений при предсердных аритмиях и играют решающую роль в развитии и прогрессировании фибрилляции предсердий (ФП). ПВ содержат рукава миокарда (МС), состоящие из кардиомиоцитов. Рассеянный склероз участвует в инициации и поддержании мерцательной аритмии, поскольку он сохраняет сходство с работающим миокардом сердца, включая способность генерировать эктопические электрические импульсы. Грызуны широко используются и могут представлять собой отличные животные модели для изучения миокарда легочной вены, поскольку кардиомиоциты широко представлены по всей стенке сосуда. Тем не менее, точное микровскрытие и приготовление мышиных ПВ является сложной задачей из-за небольшого размера органа и сложной анатомии.
Мы демонстрируем протокол микродиссекции под контролем микроскопии для изоляции левого предсердия мыши (ЛП) вместе с ЛВ. Иммунофлуоресцентное окрашивание с использованием сердечных антител к тропонину-Т (цТНТ) и коннексину 43 (Сх43) выполняется для визуализации ЛП и ЛП в полный рост. Визуализация при 10-кратном и 40-кратном увеличении обеспечивает всестороннее представление о структуре ФВ, а также детальное представление об архитектуре миокарда, в частности, подчеркивая присутствие коннексина 43 в МС.
Introduction
Фибрилляция предсердий (ФП) является наиболее распространенной устойчивой аритмией1. Распространенность мерцательной аритмии продолжает расти: ожидается, что в 2060 г. число пациентов в Европе составит ~17,9 млн1. Мерцательная аритмия имеет большое клиническое значение, поскольку является существенным фактором риска развития инфаркта миокарда, сердечной недостаточности или инсульта, что приводит к огромному индивидуальному, социальному и социально-экономическому бремени1. Несмотря на то, что мерцательная аритмия известна уже несколько десятилетий, патофизиология мерцательной аритмии до сих пор до конца не изучена2.
Уже в конце 1990-х годов исследования продемонстрировали большое влияние легочных вен (ЛП) на инициацию и поддержание мерцательной аритмии, поскольку они являются основным источником эктопическихсокращений, вызывающих мерцательную аритмию. Показано, что ВВ структурно отличаются от других кровеносных сосудов. В то время как типичные кровеносные сосуды содержат гладкомышечные клетки, оболочка ВП также содержит кардиомиоциты4. У грызунов эта сердечная мускулатура повсеместно присутствует на протяжении всего ВП, включая внутри- и внелегочные отделы, а также область отверстия5. У человека ВП также содержат кардиомиоциты, которые можно наблюдать в расширениях миокарда левого предсердия (ЛП) — так называемых рукавах миокарда (МС)6,7.
Рассеянный склероз имеет морфологическое сходство с миокардом предсердий8. Форма и размер предсердий и кардиомиоцитов ВП существенно не различаются между собой и демонстрируют сопоставимые электрофизиологические свойства8. Электрофизиологические записи в ПВ доказали электрическую активность рассеянного склероза, а ангиографическая визуализация выявила сокращения, синхронизированные с сердцебиением 9,10.
Щелевые контакты представляют собой порообразующие белковые комплексы, состоящие из шести субъединиц коннексина, которые обеспечивают прохождение ионов и малых молекул11. Щелевые контакты существуют в межклеточных аппозициях, соединяют между собой соседние кардиомиоциты и обеспечивают межклеточное электрическое соединение между кардиомиоцитами12,13. В сердце экспрессируется несколько изоформ коннексина, причем коннексин 43 (Cx43) является наиболее распространенной изоформой, экспрессируемой во всех областях сердца14. Предыдущие исследования свидетельствуют об экспрессии Cx43 в кардиомиоцитах PV15,16.
По-прежнему сложно исследовать рассеянный склероз в интактных ФВ из-за их тонкой структуры, особенно на моделях мелких животных. В этой статье мы продемонстрируем, как идентифицировать и изолировать ВП вместе с ЛП и долями легких у мышей с помощью микродиссекции под контролем микроскопии. Кроме того, мы демонстрируем иммунофлуоресцентное (ИФ) окрашивание ФВ для визуализации кардиомиоцитов и их взаимосвязей внутри ФВ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Уход за животными и все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с рекомендациями Комитета по уходу за животными и этике Мюнхенского университета им. Людвига-Максимилиана, а все процедуры с использованием мышей были одобрены Regierung von Oberbayern (ROB 55.2-2532. Vet_02-20-215, РОБ 55.2-2532. Vet_02-18-46, РОБ 55.2-2532. Vet_02-19-86, РОБ 55.2-2532. Vet_02-21-178, РОБ 55.2-2532. Vet_02-22-170). Мыши C57BL6/N были получены в промышленных масштабах.
1. Подготовка
- Приготовьте 3% агарозный гель, смешав 3 мг агарозы и 100 мл 1x Tris-буферного физиологического раствора в колбе Эрленмейера объемом 500 мл. Нагрейте раствор в микроволновой печи при мощности 600 Вт в течение 2-3 мин, пока гель не станет однородным.
- Подготовьте чашку для препарирования, аккуратно перелив гель в чашку Петри диаметром 100 мм. Наполните чашку Петри гелем наполовину. Очистите гель от пузырьков, чтобы обеспечить однородную консистенцию. Дайте чашке для препарирования остыть, пока гель не затвердеет.
- Приготовьте все необходимые буферы и растворы, включая фиксирующий раствор, раствор для пермеабилизации, блокирующий буфер и промывочный буфер в соответствии с рецептами, приведенными в таблице 1.
2. Забор органов и подготовка тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Обширный протокол с подробным описанием процедуры мышиной анестезии и забора сердца был опубликован ранее17,18. Таким образом, мы приводим лишь краткое описание этой части. Эксперименты проводились на мышах C57BL6 в возрасте от 12 до 16 недель (шесть самцов, четыре самки). Масса тела самца увеличилась с 26 г до 28 г, а самки — с 19 г до 22 г. Следующие этапы выполнялись без предварительной системной инъекции гепарина.
- Обезболивайте мышь изофлураном (5%, 95% кислорода, расход: 1 л/мин) и обеспечьте достаточную глубину анестезии.
- Переместите мышь на операционный стол, расположив ее в положении лежа на спине. Поддерживайте наркоз ингаляцией изофлурана (2%, 98% кислорода, расход: 1 л/мин) через наркозную маску и фиксируйте мышь скотчем на концах. Вводят фентанил для обезболивания (0,1 мг/25 г массы тела в/в).
- Приподнимите мех на мечевидном отростке и установите поперечный срез 2 мм. Отделите шерсть от подкожной фасции с помощью тупого рассечения (тыльной стороной ножниц) и удлините разрез краниально и латерально, чтобы обнажить грудную клетку.
- Осторожно вскрывают брюшко хвостом к реберной дуге. Слегка приподнимите мечевидный отросток, чтобы разрезать диафрагму от каудальной и вызвать коллапс легких. Затем разрежьте диафрагму слева направо, не повредив ни одного органа, и откройте грудную клетку с двух сторон, чтобы обнажить сердце.
- Перережьте нижнюю полую вену (IVC), пока сердце все еще бьется, чтобы обескровить мышь, и приступайте к перфузии сердца, проникая в левый желудочек иглой 27 G и вводя 10 мл ледяного 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
- Очистив сердце мыши от крови, найдите дугу аорты, верхнюю полую вену (SVC) и трахею. Обрежьте их на ~3 мм выше основания сердца и соберите сердце вместе с соединенными легкими.
- Погрузите собранные органы в коническую пробирку объемом 10 мл, содержащую 2 мл стерилизованного 30% раствора сахарозы. Дайте образцам обезвоживаться в течение 24 ч при температуре 4 °C.
3. Подготовка ЛХ и ФВ под контролем микроскопии
- Поместите обезвоженное сердце и легкие в чашку для вскрытия, содержащую 40-50 мл 1x PBS. Поместите его под яркопольный микроскоп с 10-кратным увеличением и настройте освещение. Поместите сердце тыльной поверхностью на чашку для препарирования. Определите переход между желудочком и стенкой предсердий, и аккуратно отделите желудочки от предсердий с помощью хирургических ножниц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разрежьте примерно на 1 мм ниже предсердий, чтобы сохранить часть желудочковой ткани. Это понадобится в дальнейшем для прикрепления предсердий к чашке для рассечения, не повреждая структуры у основания сердца. Мы рекомендуем оставить желудочки, так как они могут быть использованы в качестве положительного контрольного образца. Чтобы внедрить ткань желудочка, выполните ту же процедуру, что и для встраивания ФВ, как описано в разделе 4. - Поместите отделенные предсердия с режущей поверхностью желудочка (шаг 3.1) на чашку для препарирования так, чтобы основание сердца было обращено вверх. Сориентируйте предсердия так, чтобы доли легких находились кзадне, ЛД и левый придаток предсердия (ЛДА) находились справа, а правое предсердие (РА) и придаток правого предсердия (РА) находились слева. Зафиксируйте препарат, прикрепив оставшуюся ткань левого желудочка к чашке для вскрытия. Аккуратно разведите доли легких, не прилагая чрезмерных усилий, и прикрепите их к чашке для препарирования (рис. 1А).
- Получите представление об анатомических ориентирах у основания сердца.
- Найдите аорту с дугой аорты в центре основания сердца.
- Определите легочный ствол (ЛТ) непосредственно справа от аорты и проследите его курс к задне, чтобы различить легочные артерии (ПА). Проверьте их местоположение, проследив их курс до левой доли и правой верхней/средней доли, чтобы найти соответствующую подвздошную кость легкого (ЛГ).
- Определите положение трахеи и/или левого и правого главных бронхов (L Br, R Br), которые расположены позади аорты, и проверьте их расположение, следуя их курсу к ЛГ (рис. 1A).
- Найдите SVC слева от аорты и убедитесь в этом, проследив за его курсом в RAA рядом с RAA.
- Удалить соединительную и жировую ткань вокруг основания сердца, сохранив все выявленные ориентиры, упомянутые выше. Кроме того, удалите дугу аорты и трахею, чтобы иметь свободный обзор основания сердца (рис. 1B).
- Аккуратно отделите ПА от верхней поверхности предсердия путем тупого рассечения с помощью тонких щипцов. После этого отрежьте их на ЛГ и отверните в сторону, чтобы обнажить левую стенку предсердий (LAFW) и PV в их полном размере. Отрезают главные бронхи от ЛГ и удаляют бронхиальную ткань (рис. 1В).
ПРИМЕЧАНИЕ: ЛГ служит как общей точкой входа для ПА и дыхательных путей в легкие, так и точкой выхода для ЛГ. Важно выполнять каждую процедуру на ЛГ осторожно, чтобы не повредить ПВ. - Чтобы отделить ЛП/РА и левый и правый желудочек (ЛЖ, ПЖ), выполняют разрез, начиная от передней части оставшегося ПЖ вверх через трехстворчатый клапан (ТВ) до передней стороны СВК, чтобы открыть РА с фронтальной стороны. Разрежьте заднюю свободную стенку РА (RAFW) рядом с межпредсердной перегородкой, чтобы разделить РА и LA. Разрежьте заднюю стенку правого желудочка рядом с межжелудочковой перегородкой, чтобы полностью разорвать ЛЖ и ПЖ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обширный протокол, подробно описывающий процедуру препарирования и изоляции правого предсердия, был опубликован ранее19. Разделение РА полезно для удаления нежелательной ткани из тканевого комплекса LA-PV и для сбора ткани для дополнительных экспериментов. - Уменьшите размер долей легких, отрезав часть базальной легочной ткани так, чтобы осталось примерно 3-4 мм легочной ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраняйте верхушки долей легких, так как они служат поплавками на последующих этапах встраивания, и допускайте горизонтальное встраивание PV в соединение O.C.T.
4. Встраивание тканей
- Перенесите препарат, включая LA и PV, в криоформу, убедившись, что основание сердца и верхушка легкого направлены вверх. Расположите их в физиологической конфигурации — убедитесь, что PV не перекручены и не перевернуты.
- Заполните криомолд компаундом O.C.T и осторожно сожмите PV тонкими щипцами, чтобы удалить оставшийся воздух. Поддерживать их физиологическую конфигурацию неизменной на протяжении всего процесса.
- Положите криомолд с внедренной тканью на сухой лед, чтобы заморозить соединение O.C.T. Храните образцы при температуре -80 °C для использования в будущем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно держать PV в горизонтальном положении, чтобы обеспечить получение секций, содержащих PV по всей длине, для последующих процедур.
5. Нарезка и сбор замороженных срезов ткани
ПРИМЕЧАНИЕ: Для резки блоков ткани настройки машины были настроены на температуру образца -18 °C и температуру лезвия -25 °C.
- Установите тканевый блок на держатель образца, нанеся слой соединения O.C.T. между тканевым блоком и держателем образца. Заморозьте их на 3-4 минуты.
- Заблокируйте головку образца и загрузите держатель образца тканевым блоком на головку образца, закрыв рычаг разблокировки патрона образца. Точно отрегулируйте положение тканевого блока с помощью ручек тонкой регулировки.
- Извлеките криомолд из образца. Разблокируйте головку образца и электрический тормоз криостата.
- Установите криостат в режим обрезки с размером обрезки от 30 мкм до 50 мкм. Обрежьте образец ткани до тех пор, пока PV не станут видимыми.
- Переключитесь в режим резки тонких сечений и установите толщину 10 мкм. Начните собирать срезы, в том числе ВП и связанную ткань легких и предсердий. Соберите секции с помощью пластины для защиты от крена или прикрепив свободный конец каждой секции к держателю лезвия мелкой холодной щеткой и разложите их.
- Расположите предметное стекло (при комнатной температуре) рядом с секцией. Осторожно снимите секцию с щетки, позволяя секции естественным образом прилипнуть к предметному стеклу, так как замороженная секция и соединение O.C.T. плавятся при прикосновении к более теплой поверхности предметного стекла.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте стабильное и щадящее состояние во время процесса секционирования, чтобы предотвратить любые разрывы или складки в секциях. При необходимости замените лезвие новым. - Соберите до трех разделов на каждом слайде. Маркируйте слайды и храните их при температуре -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем собрать не менее пяти разделов (эквивалентно двум слайдам) для каждого PV.
6. Иммунофлуоресцентное окрашивание криосекций из ФВ
- Разложите замороженные предметные стекла на системе окрашивания и дайте участкам оттаять в течение примерно 20 минут при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наполните систему окрашивания водой, чтобы образцы оставались влажными. Высыхание ткани может повредить антигены, вызывая артефакты неспецифического связывания антител и перекрашивания во время процедур окрашивания. - После 20 мин оттаивания покройте срезы несколькими каплями фиксирующего раствора (4% параформальдегид [PFA], табл. 1), чтобы зафиксировать ткань на предметных стеклах в течение 10 мин при комнатной температуре.
- После фиксации перенесите слайды на вертикальную стойку для слайдов и погрузите их в контейнер, наполненный 1x PBS. Поставьте емкость на шейкер на низкой скорости и мойте горки в течение 5 минут. Повторите этот цикл стирки еще два раза, каждый раз используя свежий 1x PBS.
- После мытья обведите каждый отдельный участок на каждом предметном стекле ручкой-блокатором, содержащей ксилол. Переставьте предметные стекла на системе окрашивания и нанесите 1 или 2 капли раствора пермеабилизации (0,1% Тритон Х-100, таблица 1) на каждый образец с помощью пипетки Пастера. Дайте срезам инкубироваться при комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы проникнуть в клетки и мембраны клеточных органелл.
- После пермеабилизации удалите 0,1% раствор Triton X-100, промыв предметные стекла в течение 3 x 5 мин в 1x PBS, следуя той же процедуре, что описана в шаге 6.3.
- После промывки переставьте предметные стекла на окрашивающей системе и нанесите 1 или 2 капли блокирующего буфера (таблица 1) на каждую секцию, убедившись, что они полностью покрыты блокирующим буфером. Дайте предметным стеклам инкубироваться в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Приготовьте 1 мл первичной смеси антител путем пипетирования 5 мкл мышиного антитела к цтротилу (разбавленного 1:200) и 1 мкл кроличьего антитела к Cx43 (разбавленного 1:1000) в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, заполненную 994 мкл блокирующего буфера. Пипеткой проведите смесь вверх и вниз, чтобы обеспечить тщательное перемешивание.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте количество наносимой смеси антител в соответствии с размером секции. Убедитесь, что срезы полностью покрыты смесью антител. Концентрация, время инкубации и оптимальная температура инкубации антител могут варьироваться в зависимости от таких факторов, как тип антител, клоны антител и характеристики тканей. Мы рекомендуем тестировать и оптимизировать условия окрашивания индивидуально для каждого антитела. - После этапа блокировки (шаг 6.6) удалите оставшийся блокирующий буфер и непосредственно нанесите 2 или 3 капли смеси первичных антител на каждый участок. Дайте предметным стеклам инкубироваться в течение ночи при температуре 4 °C.
- После первичной инкубации антител промывают предметные стекла в течение 3 х 5 мин промывочным буфером при легком встряхивании (Таблица 1).
- Приготовьте 1 мл смеси вторичных антител путем пипетирования 1 мкл конъюгированного вторичного антитела к козьему антителу AF488 (разбавленного 1:1000) и 1 мкл конъюгированного вторичного антитела к козьему антикролику AF568 (разбавленного 1:1000) в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, заполненную 998 мкл промывочного буфера. Пипеткой протрите смесь вверх и вниз, чтобы она хорошо перемешалась.
- После этапа промывки (шаг 6.9) переставьте предметные стекла в системе окрашивания и нанесите пипеткой 2 или 3 капли смеси вторичных антител на каждый срез. Дайте антителам инкубироваться в течение 45 минут при комнатной температуре, защищая образцы от света, чтобы предотвратить тушение флуорофора. После инкубации вторичных антител промывают предметные стекла в течение 3 х 5 мин промывочным буфером при легком встряхивании (Таблица 1).
- Переставьте предметные стекла на окрашивающей системе. Окрасьте срезы Hoechst-33342 (в разведении 1:1,000 в 1x PBS), нанеся 2-3 капли раствора Hoechst-33342 на каждую секцию. Дайте предметным стеклам инкубироваться в течение 10 минут при комнатной температуре.
- После инкубации промывайте предметные стекла 3 x 5 мин промывочным буфером при легком встряхивании (Таблица 1). Установите предметные стекла, нанеся 1 или 2 капли флуоресцентного монтажного средства на каждое слайд. Накройте слайды покровными листами.
ПРИМЕЧАНИЕ: При размещении покровного листа убедитесь, что он плоский. Если присутствуют пузырьки воздуха, осторожно надавите на боковую часть пузырька, чтобы удалить их. - Храните смонтированные слайды в заставке для слайдов при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется создавать изображения слайдов как можно раньше. Этот протокол действителен не только для упомянутых антител. Антигены-мишени и антитела могут быть заменены или модифицированы в соответствии с индивидуальными требованиями эксперимента или альтернативными стратегиями обнаружения антигенов.
7. Визуализация срезов иммунофлуоресцентного окрашивания
- Настройте микроскоп.
- Запустите микроскоп с помощью лазерного источника света, подключенного компьютера и прилагаемого программного обеспечения, следуя руководству производителя.
- Войдите в меню Конфигурация . Нажмите, чтобы выбрать подходящий тип камеры для флуоресцентной визуализации (например, DFC365FX монохромную камеру).
- Войдите в меню «Получение» и создайте три канала.
- Выберите канал FCr1 для обнаружения Hoechst-33342, пометьте его и выберите куб фильтра DAP в разделе выбора. Установите время экспозиции на 200 мс, электронное усиление на 2 и интенсивность света на 17%.
- Выберите канал FCr2 для обнаружения cTNT (окрашенного конъюгированным антителом AF488), пометьте его и выберите куб фильтра L5 в разделе выбора. Установите время экспозиции 200-300 мс, электронное усиление 1,8 и интенсивность света 100%.
- Выберите канал FCr3 для обнаружения Cx43 (окрашенного конъюгированным антителом AF568), пометьте его и выберите куб фильтра TXR в разделе выбора. Установите время экспозиции на 150 мс, электронное усиление на 2 и интенсивность света на 100%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Спектральные характеристики фильтровальных кубов приведены в таблице 2.
- Загрузите предметное стекло на предметный столик микроскопа.
- Выполните обзорную визуализацию с 10-кратным увеличением:
- Выберите объектив с 10-кратным увеличением и откройте лазерный затвор, нажав кнопку Live. Выбрав канал FCr1 , используйте функцию навигатора для навигации по слайду до тех пор, пока не будет обнаружен сигнал. Грубо сфокусируйте образец до тех пор, пока ядра клеток не станут различимы.
- Активируйте режим спирального сканирования , чтобы получить полный предварительный просмотр образца. Деактивируйте в реальном времени , нажав кнопку еще раз, чтобы защитить образец. Определите ЛП, ПВ и легочную ткань.
- Определите область интереса для последующего сканирования плитки; Выберите несколько точек фокусировки в области интереса. Нажмите Live ( Live) в канале FCr1 и отрегулируйте фокусировку для каждой точки фокусировки. Сохраните соответствующие Z-позиции, которые представляют собой точное положение фокусировки для каждой точки фокусировки. Запустите сканирование плиток с 10-кратным увеличением, чтобы получить полное общее изображение образца.
- После завершения сканирования откройте мозаичное сканирование и объедините отдельные изображения. Чтобы повысить яркость и контрастность отдельных каналов, выберите их на панели объектов и отрегулируйте диапазон сигнала с помощью ползунков.
- Получение увеличенных изображений при 40-кратном увеличении:
- Выберите цель 40x. Отрегулируйте время экспозиции и настройки усиления для каждого канала следующим образом: FCr1: куб фильтра DAP: время экспозиции: 50 мс, усиление: 1,5; FCr2: куб фильтра L5: время экспозиции: 80 мс, коэффициент усиления: 1,8; FCr3: Куб фильтра TXR: время экспозиции: 20 мс, усиление: 2.
- Используйте обзорное изображение шага 7.3 для определения местоположения отверстия ФВ, а также внелегочной и внутрилегочной областей ВП (ВП ex, ВВ). Определите эту область для сканирования.
- Откройте подменю Image и нажмите на z, чтобы активировать Z-Stack.
- Выберите канал FCr1 и откройте лазерный затвор для предварительного просмотра в реальном времени .
- Перейдите в подменю Z-Stack и определите начальную и конечную точки Z-Stack, вращаяручку точной регулировки по часовой стрелке и против часовой стрелки до тех пор, пока общий сигнал не начнет терять фокус.
- После настройки диапазона фокусировки выберите режим System Optimized Z-Stack ( Оптимизированный для системы Z-стек) и активируйте опцию вычисления изображений с расширенной глубиной резкости (EDF). В зависимости от того, насколько плоская ткань, ожидайте примерно 20 слоев с шагом примерно 0,5 мкм.
- Начните сканирование плитки. После сканирования откройте сканирование плиток и объедините только изображение EDF. Чтобы повысить яркость и контрастность отдельных каналов, выберите их на панели объектов и отрегулируйте диапазон сигнала с помощью ползунков (см. шаг 7.3.4).
- После создания изображений сохраните проект и экспортируйте как объединенную версию, так и необработанные каналы каждого изображения в виде файла TIFF.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сохранение файлов в формате TIFF, читаемом с помощью ImageJ, позволяет ImageJ импортировать исходный размер листа в мкм, а не в пикселях. Всегда закрывайте лазерный затвор всякий раз, когда лазерный сигнал не нужен, чтобы предотвратить фотообесцвечивание вторичных антител.
8. Редактирование изображений с помощью ImageJ
- Загрузите соответствующие файлы необработанных каналов в ImageJ. Нажмите на изображение | Цвет | Объедините и выберите нужный цвет для каждого канала.
- Создайте масштабную линейку, выбрав Анализ | Инструменты | Масштабная линейка и вставьте ее в правый нижний угол. Приступайте к дальнейшей обработке и анализу в соответствии с требованиями к изображению. По завершении сохраните объединенные изображения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы провели микродиссекцию, окрашивание и визуализацию ВП у 10 мышей в возрасте 12-16 недель. Следуя протоколу, мы успешно провели микропрепарирование ФВ вместе с ЛП у всех подопытных мышей и получили срезы с комплексным изображением ФВ у восьми мышей. Обзорные изображения были сделаны при 10-кратном увеличении для идентификации области диафрагмы (PVO) в месте соединения LA-PV, внелегочных PV (PVex) (PV между легким хилумом и соединением LA-PV) и внутрилегочных PV (PVin) (PV, окруженных легочной тканью) (рис. 2). Увеличенные изображения указанных областей были получены при 40-кратном увеличении объектива (рис. 3).
Мы обнаружили специфические сигналы cTNT с типичной мышечной бороздкой в PVO, PVex и PVin (рис. 3). Cx43 был обнаружен во всех трех областях ВП и в основном проецировался между соседними кардиомиоцитами (рис. 3 и рис. 4А). Сигналы, связанные с Cx43, наблюдались как на полярной стороне (рис. 3, желтые стрелки), так и на латеральной стороне кардиомиоцитов при МС (рис. 3, красные стрелки).
Рисунок 1: Идентификация легочных вен мышей под микроскопом. Светлопольная микроскопия (10-кратное увеличение). Сердце прикрепляется к чашке для вскрытия четырьмя штифтами в предсердии, левой доле легкого, правой средней доле легкого и правой нижней доле легкого. (А) Обзор основания сердца после отделения ткани желудочка от предсердия с дугой аорты посередине. Атриум расположен внизу; Доли легких расположены в верхней половине снимка. ПВ скрыты АА, главными бронхами и ПА. (Б) Вид сверху на основание сердца после удаления трахеи, части главных бронхов, дуги аорты, а также соединительной и жировой ткани. ПА в середине снимка показывают их полный ход от ЛГ к ЛГ и охватывают ВП. (C) Вид сверху на ВП после вырезания ПА из долей легких и удаления внелегочной бронхиальной ткани. Масштабные линейки = 5 мм. Сокращения: АА = дуга аорты; AscA = восходящая аорта; IVC = нижняя полая вена; L Br = левый главный бронх; L PV = левая легочная вена; LA-PV J = соединение левого предсердия с легочной веной; LAA = левый предсердный придаток; LAFW = свободная стенка левого предсердия; ЛГ = подвздошная кость легкого; L. LL = левая доля легкого; ПА = легочные артерии; PT = легочный ствол; R Br = правый главный бронх; R PV = правая легочная вена; R-A PV = правая восходящая легочная вена; RAA = придаток правого предсердия; R. acc. LL = правая добавочная доля легкого; R. inf. LL = правая нижняя доля легкого; R. mid. LL = правая средняя доля легкого; R. sup. LL = правая верхняя доля легкого; SVC = верхняя полая вена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Обзор легочных вен и левого предсердия взрослой мыши на изображении поперечного среза методом иммунофлуоресцентной микроскопии. Клеточные ядра окрашивали Hoechst-33342 (синий); кардиомиоциты были мечены антителами к цТНТ (белого цвета); и щелевые контакты были обнаружены с помощью антител к Cx43 (зеленый). Белыми прямоугольниками выделены следующие области: a, отверстие PV (PVO); б, внелегочная ВП (ВПex); и c, внутрилегочная ВП (ВВ). Масштабная линейка = 500 мкм. Сокращения: L PV = левая легочная вена; LAA = левый предсердный придаток; LAFW = свободная стенка левого предсердия; ЛЖ-ВП = левый желудочек - путь выброса; R PV = правая легочная вена; R-A PV = правая восходящая легочная вена; RV = Правый желудочек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Увеличенный вид миокарда правой ВП с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Клеточные ядра окрашивали Hoechst-33342 (синий); кардиомиоциты были мечены антителами к цТНТ (белого цвета); и щелевые контакты Cx43+ были обнаружены антителом к Cx43 (зеленый). (A) Сканирование плитки EDF, показывающее продольный разрез через правую внелегочную PV. Отверстия ЛП и ВП не показаны на изображении и будут расположены слева, в то время как внутрилегочная ВП и соответствующая паренхима легких (также не показаны) будут расположены справа. (В,В) Сканирование с помощью EDF одной плитки правой внелегочной ФВ. Стрелками выделены щелевые контакты Cx43+ на клеточных границах кардиомиоцитов. Желтыми стрелками обозначены щелевые контакты на полярных сторонах кардиомиоцитов, локализованные с интеркалированными дисками, а красными стрелками обозначены щелевые контакты на латеральной стороне кардиомиоцитов. Масштабные линейки = 50 мкм (А), 20 мкм (В,С). Сокращения: ПВ = легочная вена; EDF = увеличенная глубина резкости; LA = левое предсердие. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Иммунофлуоресцентное окрашивание контрольной ткани. (А) Положительное контрольное окрашивание мышиной ЛЖ. Ядра клеток окрашивали препаратом Hoechst 33342 (синий); кардиомиоциты были мечены антителами к цТНТ (белого цвета); и Сх43+ щелевые контакты были обнаружены антителами к Сх43 (зеленый). (Б) Отрицательное контрольное окрашивание правого внелегочного ВП с использованием только вторичных антител. Ядра клеток окрашены препаратом Hoechst 33342 (синий). Масштабные линейки = 20 мкм (А), 50 мкм (В). Сокращения: ЛЖ = левый желудочек; ПВ = легочная вена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Фильтр-куб | Фильтр возбуждения | Фильтр выхлопных газов |
| ПОДПРЫГИВАНИЕ | 350 / 50 | 460 / 50 |
| Л5 | 480 / 40 | 527 / 30 |
| Протокол TXR | 560 / 40 | 630 / 75 |
Таблица 1: Характеристики возбуждающего и эмиссионного фильтров фильтрующих кубов Leica DM6 B.
| Соединение | Конечная концентрация | Требуется г или мл / 100 мл |
| Крепежный раствор | ||
| Параформальдегид (PFA) 16% | 4% | 25 мл |
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) 1x концентрированный | 75 мл | |
| Решение для пермеабилизации | ||
| Тритон Х-100 | 0.1% | 0,1 мл |
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) 1x концентрированный | 99,9 мл | |
| Блокирующий буфер | ||
| Сыворотка нормального состояния (NGS) | 10% | 10 мл |
| Бычий сывороточный альбумин (BSA) | 0.5% | 0,5 мг |
| Подросток 20 | 0.1% | 0,1 мл |
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) 1x концентрированный | 89,9 мл | |
| Буфер для промывки | ||
| Бычий сывороточный альбумин (BSA) | 0.5% | 0,5 мг |
| Подросток 20 | 0,1 мл | |
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) 1x концентрированный | 99,9 мл | |
Таблица 2: Рецепты буферов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
С помощью этого протокола мы делимся методом различения и изоляции ВП сердца мыши и проведения на них иммунофлуоресцентного окрашивания. После забора органов сердце и легкие обезвоживали в стерилизованном растворе сахарозы с последующим отделением желудочков от предсердий и долей легких под микроскопическим контролем. После этого основание сердца было подготовлено для визуализации ВП с последующим вырезанием их из легких в области подвздошной кости. Последующее иммунофлуоресцентное окрашивание проводили с помощью криотехники путем встраивания ткани в соединение O.C.T., разрезания ее криотомом и выполнения иммунофлуоресцентного окрашивания для cTNT и Cx43.
Выделение ФВ может быть полезным для изучения их роли в аритмогенезе ФП. Тем не менее, выделение PV у мышей является сложной задачей. В дополнение к своему небольшому размеру, ВП скрыты за основными бронхами и выступающими сосудами у основания сердца, что значительно затрудняет их обнаружение. Этот протокол обеспечивает простой и прозрачный способ исследования мышиных PV и позволяет использовать экономический подход для детального изучения их морфологических характеристик. Предложенный подход к забору и препарированию сохраняет анатомические отношения между ЛВ, соответствующими долями легких и ЛП, облегчая исследования всего тканевого комплекса ЛП-ЛП.
МС имеют гетерогенную структуру. Значительная вариабельность в непрерывности и ориентации волокон была описана у многих видов, включая крыс и людей, и в основном обнаружена вокруг отверстий PV 4,20. Эти различия приводят к анизотропной электрической проводимости и могут индуцировать возбуждения при возвращении в атмосферу и вегетативную активность в PV21. Кроме того, электрическая взаимосвязь между РС и предсердным миокардом на стыке ЛП-ФВ может приводить к переходу десинхронизированных электрических импульсов от ЛП к левому предсердию, что приводит к ФП2. Таким образом, сохранение морфологических пропорций на стыке ЛП-ВП имеет решающее значение для изучения взаимодействия между миокардом предсердий и ВП. Для этого необходима точная идентификация основных бронхов и ПА. Мы идентифицировали ориентиры в соответствии с их анатомическим положением и соотношением с помощью микроскопа с 10-кратным увеличением и систематически отслеживая их курс от основания сердца до ЛГ.
Мы выполнили ПЧ-окрашивание мышиных ВВ. Подходы к окрашиванию на основе иммунореактивных красителей широко распространены у разных видов и позволяют напрямую детектировать целевые антигены, обеспечивая качественный визуальный контраст в микроскопии. Этот подход позволяет как качественно, так и количественно характеризовать неповрежденные срезы тканей на белковом уровне. Мы используем сердечный изотип ТНТ для различения миокарда и несердечной мускулатуры. Наличие кардиомиоцитов в ВВ, а также СВК и НПВ было описано ранее7. Однако другие трубчатые структуры легких, включая ПА, бронхи и частные легочные сосуды, не содержат клеток сердечной мышцы, что позволяет легко отличить их с помощью окрашивания ПФ7. При маркировке структурных белков, таких как цТНТ, кардиомиоциты демонстрируют характерную поперечную бороздку в зависимости от их ориентации по направлению к траектории пучка. Направление полосы может быть отображено в ImageJ с помощью таких плагинов, как OrientationJ или Directionality Plugin. Это помогает количественно определить и охарактеризовать направленность кардиомиоцитов и может быть полезно для идентификации областей с анизотропной электрической проводимостью. Кроме того, это исследование подтверждает предыдущие выводы относительно обильного присутствия Cx43 в миокарде ВП мышей, который организован таким же образом, как и в ЛЖ (рис. 4A)15,16. Примечательно, что мы наблюдали щелевые контакты на боковой мембране кардиомиоцитов у мышиных ВП. Это состояние, известное как латерализация, было продемонстрировано как патофизиологический механизм при мерцательной аритмии, особенно у самцов мышей22. Таким образом, этот протокол подчеркивает потенциал для проведения аналогичных исследований на кардиомиоцитах мышей с рассеянным склерозом.
PV-изоляция является важным методом для исследования аритмии, поскольку она позволяет проводить ряд исследований, включая IF-окрашивание, проточную цитометрию, флуоресцентно-активированную сортировку клеток, оптическое картирование и патч-зажим. Однако, поскольку текущий протокол был разработан для визуализации фиксированных и встроенных тканей ПЧ, прямых доказательств того, что кардиомиоциты могут быть выделены из препаратов ФВ в достаточном качестве, чтобы можно было проводить такие эксперименты, как патч-зажим, в настоящее время отсутствуют. Успех микродиссекции зависит от опыта исследователя из-за небольших размеров и хрупкости сердечной ткани мыши. Качество визуализации ПЧ также в значительной степени зависит от этапа встраивания. Горизонтальное расположение трудно достижимо, целостность тканей срезов может пострадать, и ФВ могут разорваться, если они не заполнены соединением O.C.T. Кроме того, действие протокола ограничено 2D-визуализацией, так как метод не позволяет проводить 3D-реконструкцию ФВ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявлять.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Немецким центром сердечно-сосудистых исследований (DZHK; 81X3600221to H.V., 81X2600255 to S.C.), Китайским стипендиальным советом (CSC201808130158 R.X.), Немецким научно-исследовательским обществом (DFG; Программа ученого-клинициста в области сосудистой медицины (PRIME), MA 2186/14-1 to P. T.) и Corona Foundation (S199/10079/2019 to S. C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
References
- Lippi, G., Sanchis-Gomar, F., Cervellin, G. Global epidemiology of atrial fibrillation: An increasing epidemic and public health challenge. International Journal of Stroke. 16 (2), 217-221 (2021).
- Wijesurendra, R. S., Casadei, B.
- Haïssaguerre, M., et al. Spontaneous initiation of atrial fibrillation by ectopic beats originating in the pulmonary veins. The New England Journal of Medicine. 339 (10), 659-666 (1998).
- Mueller-Hoecker, J., et al. Of rodents and humans: a light microscopic and ultrastructural study on cardiomyocytes in pulmonary veins. International Journal of Medical Sciences. 5 (3), 152-158 (2008).
- Kramer, A. W., Marks, L. S. The occurrence of cardiac muscle in the pulmonary veins of Rodenita. Journal of Morphology. 117 (2), 135-149 (1965).
- Nathan, H., Eliakim, M. The junction between the left atrium and the pulmonary veins. Circulation. 34 (3), 412-422 (1966).
- Nathan, H., Gloobe, H. Myocardial atrio-venous junctions and extensions (sleeves) over the pulmonary and caval veins: Anatomical observations in various mammals. Thorax. 25 (3), 317-324 (1970).
- Bond, R. C., Choisy, S. C., Bryant, S. M., Hancox, J. C., James, A. F. Ion currents, action potentials, and noradrenergic responses in rat pulmonary vein and left atrial cardiomyocytes. Physiological Reports. 8 (9), 14432 (2020).
- Thiagalingam, A., et al. Pulmonary vein contraction: Characterization of dynamic changes in pulmonary vein morphology using multiphase multislice computed tomography scanning. Heart Rhythm. 5 (12), 1645-1650 (2008).
- Spach, M. S., Barr, R. C., Jewett, P. H. Spread of excitation from the atrium into thoracic veins in human beings and dogs. The American Journal of Cardiology. 30 (8), 844-854 (1972).
- Scott McNutt, N., Weinstein, R. S. Membrane ultrastructure at mammalian intercellular junctions. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 26, 45-101 (1973).
- Barr, L., Dewey, M. M., Berger, W. Propagation of action potentials and the structure of the nexus in cardiac muscle. Journal of General Physiology. 48 (5), 797-823 (1965).
- Kawamura, K., Konishi, T. Ultrastructure of the cell junction of heart muscle with special reference to its functional significance in excitation conduction and to the concept of "disease of intercalated disc". Japanese Circulation Journal. 31 (11), 1533-1543 (1967).
- Van Kempen, M. J., Fromaget, C., Gros, D., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Spatial distribution of connexin43, the major cardiac gap junction protein, in the developing and adult rat heart. Circulation Research. 68 (6), 1638-1651 (1991).
- Verheule, S. Tissue structure and connexin expression of canine pulmonary veins. Cardiovascular Research. 55 (4), 727-738 (2002).
- Xiao, Y., et al. Expression of connexin 43, ion channels and Ca2+-handling proteins in rat pulmonary vein cardiomyocytes. Experimental and Therapeutic Medicine. 12 (5), 3233-3241 (2016).
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), (2020).
- Tomsits, P., et al. Medetomidine/midazolam/fentanyl narcosis alters cardiac autonomic tone leading to conduction disorders and arrhythmias in mice. Lab Animal. 52 (4), 85-92 (2023).
- Xia, R., et al. Isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node. Journal of Visualized Experiments. (171), (2021).
- Bredeloux, P., Pasqualin, C., Bordy, R., Maupoil, V., Findlay, I. Automatic activity arising in cardiac muscle sleeves of the pulmonary vein. Biomolecules. 12 (1), 23 (2021).
- Chen, P. S., et al.
- Thibault, S., Ton, A. -T., Huynh, F., Fiset, C. Connexin lateralization contributes to male susceptibility to atrial fibrillation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (18), 10696 (2022).
