Single Cell Dissociation of Caenorhabditis elegans: Een methode om levende cellen te isoleren

Overview

Deze video beschrijft een methode om hele wormen te dissocieren in een eencellige suspensie die geschikt is voor FACS of immunoprecipitatie van intacte cellen.

Protocol

Dit protocol is een uittreksel uit Duitsland et al, Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).

1. Bereiding en verzameling van oude wormen voor celisolatie

OPMERKING: Hieronder wordt de isolatie van cholinerge neuronen van de transgene unc-17::GFP stam (OH13083) verkregen uit de Caenorhabditis Genetics Center (CGC) stam repository aan de Universiteit van Minnesota. Het is noodzakelijk om steriele omstandigheden te handhaven om besmetting door schimmels of bacteriën te voorkomen.

1. Bereid en synchroniseer wormen via de bleekmethode zoals beschreven door T. Stiernagle. Voor verouderingsexperimenten, plaatwormen op nematodengroeimedium (NGM) platen met 25 μM wateroplossing van fluorodeoxyuridine (FuDR) om de eiproductie te verminderen en het uitkomen van eieren te stoppen. Inspecteer agarplaten regelmatig om besmetting of het uitkomen van eieren te voorkomen, omdat dit onbetrouwbare resultaten zal veroorzaken.
   OPMERKING: Voor unc-17::GFP-cellen worden meestal drie NGM-platen van 100 mm x 15 mm gebruikt om voldoende cellen van belang te isoleren.
2. Verzamel wormen en bereid buffers voor op celisolatie.
   1. Verzamel wormen in een conische buis van 15 ml. Was wormen van plaat met 1,5 ml M9 buffer (1 mM MgSO_4,85 mM NaCl, 42 mM Na₂HPO4·7H₂O, 22 mM KH₂PO, pH 7,0) en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1.600 x g. Gooi supernatant weg en was wormen met 1 ml M9-buffer. Herhaal centrifugeren en was in totaal vijf keer om zoveel mogelijk E. coli besmetting te verwijderen.
      OPMERKING: Het toevoegen van antibiotica (50 μg/ml), zoals ampicilline, bij deze stap kan helpen bij het verminderen van bacteriële besmetting.
   2. Bereid voor twee monsters 2 ml natriumdodecylsulfaat-dithiothreitol (SDS-DTT) lysisbuffer: 200 mM DTT, 0,25% (w/v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8,0) en 3% (w/v) sacharose.
   3. Bereid 15 ml isolatiebuffer (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl_2,2 mM MgCl_2,25 mM HEPES [pH 7.3]) voor en bewaar deze op ijs.
      OPMERKING: Zowel de SDS-DTT-lysisbuffer als de isolatiebuffer moeten voor elk experiment vers worden gemaakt.
3. Cuticula verstoring en eencellige isolatie
   1. Centrifugeer dieren verzameld in stap 1.2.1 gedurende 5 min bij 1.600 x g. Verwijder alle supernatant en hang wormen op in 1 ml M9-media en breng over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
   2. Pelletwormen met centrifugeren bij 1.600 x g gedurende 5 min.
   3. Voeg 200 μL SDS-DTT-lysisbuffer toe aan wormen en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Wormen moeten langs het lichaam worden "ge knipoogd" als ze onder een lichtmicroscoop worden bekeken.
      OPMERKING: Langdurige blootstelling aan SDS-DTT-lysisbuffer kan leiden tot de dood van wormen, die kunnen worden gecontroleerd door wormen te observeren. Wormen die dood zijn, zullen langwerpig zijn en niet krullen.
   4. Voeg 800 μL ijskoude isolatiebuffer toe en meng door de buis zachtjes te flikkeren.
   5. Pelletwormen gedurende 1 min bij 13.000 x g bij 4 °C, verwijder supernatant en was met 1 ml isolatiebuffer.
   6. Herhaal stap 1.3.5 in totaal vijf keer en verwijder de isolatiebuffer elke keer zorgvuldig.
   7. Voeg 100 μL proteasemengsel van Streptomyces griseus (15 mg/ml) (tabel met materialen) opgelost in isolatiebuffer toe aan de pellet en incubeer gedurende 10−15 min bij RT.
      OPMERKING: Net als bij de SDS-DTT-lysisbuffer kan de uitgebreide proteasevertering leiden tot een overmatig decolleté van eiwitten langs het plasmamembraan, waardoor isolatie van blootgestelde oppervlakte GFP via magnetische kralen wordt voorkomen.
   8. Breng tijdens de incubatie met proteasemengsel mechanische verstoring aan door monsters op en neer te pipetten tegen de bodem van de 1,5 ml microcentrifugebuis met een micropipetpunt van 200 μL gedurende ~ 60−70 keer. Houd de pipetpunt met constante druk tegen de wand van de microcentrifugebuis om cellen goed te ontkoppelen.
   9. Om het stadium van de spijsvertering te bepalen, verwijdert u een klein volume (~ 1−5 μL) van het spijsverteringsmengsel, laat u het op een glazen dia vallen en inspecteert u het met behulp van een weefselkweekmicroscoop. Na 5-7 minuten incubatie moeten wormfragmenten zichtbaar minder nagelriem hebben en zal een slurry van cellen gemakkelijk zichtbaar zijn.
   10. Haltreactie met 900 μL in de handel verkrijgbare koude Leibovitz's L-15 medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en penicilline-streptomycine (eindconcentratie bij 50 U/ml penicilline en 50 μg/ml streptomycine).
   11. Pellet isoleert fragmenten en cellen door centrifugeren gedurende 5 min bij 10.000 x g bij 4 °C. Was de pelletcellen met 1 ml koude L-15-aangevulde media nog twee keer om ervoor te zorgen dat overtollig vuil en de nagelriem worden verwijderd.
   12. Resuspend pelletcellen in 1 ml L-15-aangevulde media en laat 30 minuten op ijs staan. Breng de bovenste laag, ongeveer 700−800 μL, naar een microcentrifugebuis. Deze laag bevat cellen zonder celresten en zal worden gebruikt in de daaropvolgende isolatie van cellen van belang.
   13. Gebruik volgens de instructies van de fabrikant een geautomatiseerde celteller of hemocytometer om de celdichtheid van 10−25 μL geïsoleerde cellen te meten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar, Molecular Biology Grade	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Contess Automated Cell Counter	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
FBS	Omega Scientific	FB-02
Fluorodeoxyuridine	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl (Bleach)	Clorox
Penicillin-Streptomicen	Fisher Scientific	15140122
Pronase E	Sigma	7433	protease mixture from Streptomyces griseus
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope	Tritech Research
Sucrose	USBiological	S8010