Summary
La méthode d'uréase préparation des échantillons pour analyse GC / MS des métabolites intermédiaires est présenté par son inventeur. La méthode permet en une seule étape de suivi du dépistage néonatal des erreurs innées par spectrométrie de masse en tandem par les glucides quantifier, organiques et d'acides aminés tout dans un seul processus.
Abstract
Chaque enfant né aux États-Unis est maintenant projeté pour un maximum de 42 troubles génétiques rares appelées «erreurs innées du métabolisme". La méthode de dépistage est basé sur la spectrométrie de masse en tandem et quantifie acylcarnitines comme un écran pour des acides organiques et des mesures aussi des acides aminés. Tous les états également effectuer des tests enzymatiques pour les troubles des glucides tels que galactosémie. Parce que les résultats peuvent être non spécifiques, des tests de suivi des résultats positifs est nécessaire en utilisant une méthode plus définitive. Le présent rapport décrit les «uréase" méthode de préparation des échantillons pour le dépistage erreur innée. Uréase cristalline est utilisé pour éliminer l'urée à partir des fluides corporels, qui permet la plupart des autres métabolites hydrosolubles pour être déshydratés et transformés en dérivés pour la chromatographie en phase gazeuse dans une procédure unique. La déshydratation par évaporation dans un courant d'azote est facilitée par l'ajout d'acétonitrile et le chlorure de méthylène. Puis, triméthylsilylation a lieu dans la présence d'un catalyseur unique trifluoroacétate triéthylammonium,. D'injection automatisée et est suivie par chromatographie macro-conduit la quantification personnalisées de 192 métabolites et semi-quantification de tous les principaux composants en utilisant des bibliothèques spécialisées des spectres de masse des TMS dérivés des composés biologiques. L'analyse peut être effectuée sur la plate-forme Chemstation largement utilisé en utilisant les macros et les bibliothèques disponibles auprès de l'auteur. Dans notre laboratoire, plus de 16.000 échantillons de patients ont été analysés en utilisant la méthode avec un rendement diagnostique d'environ 17% - soit 17% des résultats des échantillons révèlent conclusions qui doivent être traitées par le médecin traitant. Inclus dans ce sont plus de 180 confirmés erreurs innées, dont environ 38% n'auraient pas pu être diagnostiquée à l'aide des méthodes précédentes.
Protocol
Procédure de traitement des échantillons d'urine
- Décongeler les échantillons d'urine dans un bain d'eau à 37 ° C. Décanter dans un nouveau récipient si l'original est compromise.
- Prélever une partie aliquote maximum de 13 ml d'échantillon et de le stocker à -20 ° C dans un tube à centrifuger conique étiquetés.
- Mesurer et noter la densité optique de l'échantillon en plaçant quelques gouttes d'urine dans le réfractomètre.
- Filtrer l'échantillon à travers un filtre de 0,2 um.
- Mesurez le volume d'échantillon ci-dessous en fonction de la densité optique
De 1.000 à 1.009 1,00 ml De 1.010 à 1.019 0,50 ml 1.020 à 1.050 0,25 ml + 0,25 ml de H 2 O - Le volume spécifié est ensuite transféré dans un contenant Reactivial les normes internes suivants: 500 nanomoles (nmoles) 3 créatine; 10 nmoles d 3 acide méthylmalonique; 100 nmoles chacun des 13 suivantes C 3 lactate, pyruvate 13 C 3, C 13 2 15 N glycine, sérine D 3, D 5 phénylalanine, D 11 hexanoylglycine, 15 N 2 orotate, d 4 acide sébacique, 13 C 6 du glucose, d 6 inositol et d 5 tryptophane.
- 20 microlitres (ul) d'un 7,5 unités / ul solution d'uréase (Calzyme Laboratoires catalogue no. 116A0100) est ajoutée à l'échantillon, qui est ensuite rincé et scellés sous CO 2 grâce à un septum inerte.
- L'échantillon est maintenu à 37 ° C pendant 30 minutes avec du gaz carbonique plus de dioxyde ajoutés à intervalles de 15 minutes pour maintenir la pression.
- 20 ul de la solution de plusieurs uréase est ajouté, le flacon est rincé avec du dioxyde de carbone, et l'échantillon maintenu à 37 ° C pendant 15 minutes.
- 500 ul d'acétone 30:70: méthanol est ajouté, le septum en caoutchouc est remplacé par un septum en téflon enduit, et l'échantillon est refroidi à -20 ° C pendant 15 minutes.
- Les solides sont éliminés par centrifugation à 1500 rpm x 10 minutes puis décanté dans un endroit propre Reactivial 2,0 cc (Supelco / Sigma)
- Ajouter trifluoroacétate triéthylammonium (TEA / TFA) (Sigma) comme suit:
- 20 ul de 1,00 ml d'échantillons
- 40 ul de 0,5 ml, ou moins, des échantillons
- Terminez avec de l'acétonitrile et le lieu sous un flux d'azote à 70 ° C jusqu'à un volume constant est réalisé (TEA / TFA restera) (~ 15 minutes).
- Répétez l'étape 13, jusqu'à 4 fois jusqu'à ce que se forme un précipité (~ 10 minutes chacun).
- Laisser refroidir pendant environ 2 minutes. Terminez avec le chlorure de méthylène, en prenant soin de déborder, et sec (~ 4h00 minutes).
- Répétez l'étape 15.
- Ajouter MSTFA (N-méthyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide) (thermique scientifique) aux taux suivants:
- 150 ul d'échantillons 1,00 ml
- 200 pi de 0,50 ml ou moins, des échantillons
- Cap sous atmosphère d'azote et incuber à 70 ° C pendant 1 heure.
- Transfert à microtubes, sous atmosphère d'azote, pour une analyse sur le chromatographe en phase gazeuse / spectromètre de masse.
- Microtubes place pour injection automatisée par le CPG Agilent 5975 / MS: les températures sont Instrument: injecteur 200 ° C, une interface 250 ° C, four à 80 ° C pendant 1 minute; rampe à 4 ° C / minute 80-130 ° C, rampe à 6 ° C / minute de 130 à 200 ° C, d'une rampe à 12 ° C / minute de 200 à 285 ° C, maintenir pendant 10 minutes. Colonne: 25 m, 320 microns d'identité, 0,5 microns d'épaisseur du film DB-5. Spectrométrie de masse: la source de 230 ° C, quad 150 ° C, de numérisation de 50 à 650 uma à 2,46 scans / sec. Solvant délai de 3,5 minutes.
Les résultats représentatifs
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Discussion
La méthode uréase (1) a été cité 62 fois dans la littérature médicale avec diverses modifications. Groupe de Matsumoto (2,3) a simplifié la procédure de criblage à haut débit néonatale et a rapporté les résultats de 16000 patients. Kuhara et d'autres (4-7) ont rapporté l'utilisation de la méthode dans plusieurs cas de diagnostic d'erreur innée et de suivi. Rhead (8) a également confirmé l'utilité de la méthode pour le diagnostic clinique et le suivi des erreurs innées. La méthode a été appliquée à l'urine de l'ours, souris knock-out, des éléphants et des homogénats de mouches des fruits entiers et leurs larves (9). Les milieux de culture de Cryptococcus avant et après la mutagenèse dirigée ont également été analysés, sans l'étape uréase (10). La méthode a été appliquée à l'évaluation nutritionnelle des étudiants en médecine humaine, Bas patients présentant un syndrome démentiel et des anciens combattants âgés après le chargement des sujets avec des doses orales des acides aminés tryptophane, la méthionine et l'isoleucine (11). Tous les huit vitamines B ont été évaluées par la quantification des produits de dégradation des trois acides aminés qui, parmi eux, exigent que tous les 8 vitamines à un moment de leur dégradation. Les effets toxiques des produits pharmaceutiques et leur atténuation par la supplémentation en vitamine A a été signalé (12). Échantillons de liquide amniotique de grossesses normales du syndrome de Down et ont été analysées et rapportées (13-15).
Disclosures
Le Laboratoire de dépistage métabolique est un laboratoire CLIA licence cliniques détenue par Saint Louis University, une corporation sans but lucratif. Cordonnier Dr ne profite pas directement à partir des recettes de laboratoire, mais peut bénéficier indirectement de la productivité du laboratoire. Aucune des méthodes, des techniques, des résultats, des fourchettes normales, des macros, des logiciels, des bibliothèques ou des conclusions sont considérés comme propriétaires et sont librement disponibles aux parties intéressées.
Acknowledgments
L'assistance technique de mesure Anthony Thomas est grandement appréciée.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MSD 5975 | Agilent Technologies | GC/MS/Computer | |
| MSD 5973 | Agilent Technologies | GC/MS/Computer | |
| Urease | Calzyme | 116A0100 | Also Sigma C3 |
| Stable Isotope Standards | CDN Isotopes | ||
| Solvents | Fisher Scientific | ||
| Analytes | Sigma-Aldrich | ||
| GC Columns | J&W Scientific | 123-5026 | |
| TEA/TFA | Fluka | 09747 | |
| Vials | Supelco, Sigma-Aldrich | Z115088/12EA | |
| Merlin Microseal | Agilent Technologies | 5181-8815 | |
| MSTFA | Thermal Scientific, Inc. | 48913 |
References
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- Kuhara, T., Shinka, T., Inoue, Y., Ohse, M., Zhen-wei, X., Yoshida, I., Inokuchi, T., Yamaguchi, S., Takayanagi, M., Matsumoto, I. Pilot study of gas chromatographic-mass spectrometric screening of newborn urine for inborn errors of metabolism after treatment with urease. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 731 (1), 141-147 (1999).
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