Summary
Уреазы метод подготовки проб для ГХ / МС анализ посреднических метаболитов представляет его изобретателем. Метод позволяет одним шагом последующих мер в неонатальный скрининг на врожденные нарушения по масс-спектрометрии тандеме по количественной углеводы, органические и аминокислоты, все в одном процессе.
Abstract
Каждый ребенок родился в США в настоящее время скрининг до 42 редких генетических расстройств называемые "врожденные нарушения обмена веществ". Скрининг метод основан на тандемной масс-спектрометрии и количественно acylcarnitines в качестве экрана для органических acidemias а также меры аминокислот. Все государства также выполнять ферментативную тестирование на углеводный расстройств, таких как галактоземия. Потому что результаты могут быть неспецифическими, последующие испытания положительных результатов требуется использование более определенным методом. Настоящий доклад описывает "уреазы" метод подготовки проб для скрининга врожденных ошибок. Кристаллическая фермента уреазы используется для удаления мочевины из жидкостей организма, которое позволяет большинству других водорастворимых метаболитов быть обезвоженной и производные для газовой хроматографии в одну процедуру. Обезвоживание испарением в потоке азота способствует добавление ацетонитрила и метиленхлорида. Затем, trimethylsilylation происходит в присутствии уникальный катализатор, триэтиламмония трифторацетата. Автоматизированная впрыска и хроматографии следует макро-приводом пользовательских количественного 192 метаболитов и полу-количественная оценка всех основных компонентов с использованием специализированных библиотек масс-спектрах ТМС производные биологических соединений. Анализа могут быть выполнены на широко используемых Chemstation платформы с использованием макросов и библиотек можно получить у автора. В нашей лаборатории более 16000 образцов пациентов были проанализированы с помощью метода с диагностическим выходом около 17% - то есть, 17% образцов результаты показывают результаты, которые должны быть приняты заказа врача. Входит в них более 180 подтвердили врожденных нарушений, из которых около 38% не могли быть поставлен с помощью предыдущих методов.
Protocol
Процедура обработки проб мочи
- Оттепель мочи в 37 ° С водяной бане. Декантировать в новый контейнер, если оригинал под угрозу.
- Возьмите максимальное аликвоту 13 мл пробы и хранить его при температуре -20 ° С в конической трубе помечены центрифуги.
- Измерьте и запишите оптической плотности образца, поставив пару капель мочи в рефрактометра.
- Фильтры образца через 0,2 мкм фильтр.
- Отмерьте объем образца ниже по оптической плотности
1.000-1.009 1,00 мл 1.010-1.019 0,50 мл 1.020-1.050 0,25 мл + 0,25 мл H 2 O - Указанного объема, затем переведен в Reactivial содержащие следующие внутренние стандарты: 500 нмоль (нмоль) 3 креатин, 10 нмоль D 3 метилмалоновой кислоты, 100 нмоль каждого из следующих 13 C 3 лактата, 13 C 3 пируват, 13 C-2 15 N глицин, серин 3 г, д 5 фенилаланин, д 11 hexanoylglycine, 15 N 2 оротат, д 4 себациновой кислоты, 13 C 6 глюкозы, D 6 инозитол и г 5 триптофан.
- 20 мкл (мкл) 7,5 единиц / мкл раствора уреазы (Calzyme Лаборатории каталога нет. 116A0100) добавляется к образцу, который затем промыть и опечатаны в соответствии CO 2 через инертный перегородки.
- Образец закрепляется при температуре 37 ° С в течение 30 минут с большим количеством углекислого газа добавил интервалом в 15 минут для поддержания давления.
- 20 мкл больше уреазы раствор добавляют, флакон очищается с углекислым газом, и образец поддерживается на уровне 37 ° С в течение еще 15 минут.
- 500 мкл 30:70 ацетона, метанола добавляют резиновую перегородку заменяется с тефлоновым покрытием перегородки, и образец охлаждается до температуры -20 ° С в течение 15 минут.
- Твердые частицы удаляли центрифугированием при 1500 оборотов в минуту * 10 минут, затем сливают в чистую 2,0 куб.см Reactivial (Supelco / Sigma)
- Добавить триэтиламмония трифторацетата (TEA / ТФК) (Sigma) следующим образом:
- 20 мкл для 1,00 мл образца
- 40 мкл на 0,5 мл, или менее, образцы
- Топ с ацетонитрилом и место под потоком азота при температуре 70 ° С до постоянного объема достигается (TEA / TFA останется) (~ 15 минут).
- Повторите шаг 13, до 4 раз, пока осадок (~ 10 минут каждая).
- Дайте остыть в течение 2 минут. Топ с метиленхлоридом, будучи осторожным кипения на, и сухой (~ 4:00 минуты).
- Повторите шаг 15.
- Добавить MSTFA (N-метил-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide) (Тепловая Scientific) по следующим ставкам:
- 150 мкл на 1,00 мл образца
- 200 мкл на 0,50 мл, или менее, образцы
- Cap в атмосфере азота и инкубировать при температуре 70 ° С в течение 1 часа.
- Трансфер в microvials, в атмосфере азота, для анализа на газовый хроматограф / масс-спектрометр.
- Место microvials для автоматизированного впрыском Agilent 5975 GC / MS: Инструмент температуры: инжектор 200 ° C, интерфейс 250 ° С, печь 80 ° С в течение 1 минуты; рампы при 4 ° С / мин 80-130 ° C, на рампе 6 ° C / мин 130-200 ° С, рампы при температуре 12 ° C / мин 200-285 ° С, держите в течение 10 минут. Колонка: 25 м, 320 микрон ID, 0,5 микрона толщиной пленки DB-5. Массовая Spec: источник 230 ° C, четырехъядерные 150 ° С, сканирование 50-650 а.е.м. на 2,46 скан / сек. Растворитель задержка 3,5 минуты.
Представитель Результаты
Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы увидеть представителя результаты.
Discussion
Уреазы метод (1) была процитирована 62 раз в медицинской литературе с различными модификациями. Группа Мацумото (2,3) упрощенная процедура высокой пропускной неонатального скрининга и сообщили результаты от 16000 пациентов. Kuhara и др. (4-7) сообщили о применении метода в ряде случаев врожденных диагностики ошибок и принятия последующих мер. Rhead (8) также подтвердили полезность метода для клинической диагностики и последующих врожденных ошибок. Метод был применен в моче медведи, нокаут мышей, слонов и гомогенатах целом плодовых мух и их личинок (9). Культура СМИ из Cryptococcus до и после сайт-направленного мутагенеза были также проанализированы, без уреазы шагом (10). Метод был применен для человека питательных оценки студентов-медиков, синдромом Дауна больных и сумасшедших пожилых ветеранов после загрузки пациентов с пероральной дозы аминокислоты триптофан, метионин и изолейцин (11). Все восемь витаминов группы оценивали по количественной продукты распада три аминокислоты, которые, среди них, требуют, чтобы все 8 витаминов в некоторый момент в их деградации. Токсических эффектов лекарственных средств и их предотвращению изменения климата витамина сообщалось (12). Образцах амниотической жидкости из обычной и вниз беременности синдром, были проанализированы и сообщили (13-15).
Disclosures
Метаболический Лаборатории Скрининг CLIA лицензией клинической лаборатории принадлежащих Университета Сент-Луиса, некоммерческая корпорация. Доктор Шумейкер непосредственно не прибыли от лаборатории доходов, но может принести пользу косвенно от лабораторных производительности. Ни один из методов, методик, результаты, нормальные диапазоны, макросы, программное обеспечение, библиотеки или выводы считаются собственностью и находятся в свободном доступе для заинтересованных сторон.
Acknowledgments
В состоянии технической помощи Энтони Томас с благодарностью.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MSD 5975 | Agilent Technologies | GC/MS/Computer | |
| MSD 5973 | Agilent Technologies | GC/MS/Computer | |
| Urease | Calzyme | 116A0100 | Also Sigma C3 |
| Stable Isotope Standards | CDN Isotopes | ||
| Solvents | Fisher Scientific | ||
| Analytes | Sigma-Aldrich | ||
| GC Columns | J&W Scientific | 123-5026 | |
| TEA/TFA | Fluka | 09747 | |
| Vials | Supelco, Sigma-Aldrich | Z115088/12EA | |
| Merlin Microseal | Agilent Technologies | 5181-8815 | |
| MSTFA | Thermal Scientific, Inc. | 48913 |
References
- Shoemaker, J. D., Elliott, W. H. Automated screening of urine samples for carbohydrates, organic and amino acids after treatment with urease. J. Chromatogr. 562 (1-2), 125-138 (1991).
- Kuhara, T., Shinka, T., Inoue, Y., Ohse, M., Zhen-wei, X., Yoshida, I., Inokuchi, T., Yamaguchi, S., Takayanagi, M., Matsumoto, I. Pilot study of gas chromatographic-mass spectrometric screening of newborn urine for inborn errors of metabolism after treatment with urease. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 731 (1), 141-147 (1999).
- Fu, X., Iga, M., Kimura, M., Yamaguchi, S. Simplified screening for organic acidemia using GC/MS and dried urine filter paper: a study on neonatal mass screening. Early Hum Dev. 58 (1), 41-55 (2000).
- Kuhara, T., Ohdoi, C., Ohse, M. Simple gas chromatographic-mass spectrometric procedure for diagnosing pyrimidine degradation defects for prevention of severe anticancer side effects. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758 (1), 61-74 (2001).
- Kuhara, T. Diagnosis of inborn errors of metabolism using filter paper urine, urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 758, 3-25 (2001).
- Iga, M., Kimura, M., Ohura, T., Kikawa, Y., Yamaguchi, S. Rapid, simplified and sensitive method for screening fructose-1,6-diphosphatase deficiency by analyzing urinary metabolites in urease/direct preparations and gas chromatography-mass spectrometry in the selected-ion monitoring mode. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 746 (1), 75-82 (2000).
- Kuhara, T., Ohse, M., Ohdoi, C., Ishida, S. Differential diagnosis of homocystinuria by urease treatment, isotope dilution and gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 742 (1), 59-70 (2000).
- Validation and Extension of the Urease Method for Urine Organic and Amino Acid Analysis. Young, V., Lo, S., Shoemaker, J., Thomas, A., Rhead, W. Society for Inherited Metabolic Disorders Annual Meeting, 2008 Mar, Asilomar, California, , (2008).
- Smith, E. M., Hoi, J. T., Eissenberg, J. C., Shoemaker, J. D., Neckameyer, W. S., Ilvarsonn, A. M., Harshman, L. G., Schlegel, V. L., Zempleni, J. Feeding Drosophila a biotin-deficient diet for multiple generations increases stress resistance and lifespan and alters gene expression and histone biotinylation patterns. J Nutr. 137 (9), 2006-2012 (2007).
- Brown, S. M., Shoemaker, J. D., Lodge, J. K. The Importance of NADP+-Dependent Isocitrate Dehydrogenase in Resistance to Nitrosative Stress and the Inessentiality of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase for Oxidative Stress Resistance in Cryptococcus neoformans. Eukaryotic Cell. , (2010).
- Shoemaker, J. D. Nutritional Screening in Humans by Gas Chromatography-Mass Spectrometry of Urine Metabolites After Substrate Loading. , (1992).
- Baggot, P. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Valproate-induced biochemical abnormalities in pregnancy corrected by vitamins: A Case Report. Epilepsia. 40 (44), 512-515 (1999).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. A folate-dependent metabolite in amniotic fluid from pregnancies with normal or trisomy 21 chromosomes. Fetal Diagn Ther. 21 (1), 148-152 (2006).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Organic acid concentrations in amniotic fluid found in normal and Down syndrome pregnancies. Fetal Diagn Ther. 23 (3), 245-248 (2008).
- Baggot, P. J., Eliseo, A. J., DeNicola, N. G., Kalamarides, J. A., Shoemaker, J. D. Pyridoxine-related metabolite concentrations in normal and Down syndrome amniotic fluid. Fetal Diagn Ther. 23 (4), 254-257 (2008).
