Larve Ring Kirtel Dissektion: Isolation af udviklingsmæssige endokrine organer fra Drosophila

Overview

Denne video beskriver Drosophila ringkirtlen, en kompleks endokrine struktur vigtigt for biosyntese og sekretion af ecdysteroids og andre hormoner. Den fremhævede protokol demonstrerer dens dissektion, fiksering og immunostaining.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Imura et al.,Protokoller til visualisering af steroidogene organer og deres interaktive organer med immunostaining i Fruit Fly Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

BEMÆRK: Den samlede protokolordning er vist i figur 1.

1. Dissektion af Larval Ring Gland (RG)

BEMÆRK: I D. melanogaster, som tilhører cyclorrhaphous Diptera, er PG inden for et sammensat endokrine organ kaldet ringkirtlen (RG, Figur 2D). Da det er umuligt, at PG er kirurgisk adskilt fra andre typer af celler (diskuteres senere), et praktisk mål er at isolere en intakt, ubeskadiget RG ved dissektion.

1. Forberedelse af larver i de relevante udviklingsstadier
   BEMÆRK: For at synkronisere udviklingsstadierne af D. melanogaster larver er det nødvendigt at samle æg inden for et smalt tidsvindue og samle larver på passende tidspunkter.
   1. Æg indsamles i 2 timer på en agarplade til druesaft ved 25 °C.
   2. Saml nyklækkede 1^m instar larver under et dissekerende mikroskop med pincet og overfør dem til et lille hætteglas, der indeholder moset standardgær / majsmelfluefoder.
      BEMÆRK: Larvernes alder repræsenteres af "timer efter æglægning (hAEL)", "timer efter luge (hAH)" eller "timer efter L3 ecdysis (hAL3E)".
   3. På det rette tidspunkt skal du samle de iscenesatte larver med en engangs plastsløjfe for at undgå uønsket skade. For at minimere en forskel i udviklingsmæssige progression af de 3^rd instar larver, indsamle 2^nd instar larver på 70 hAEL (48 hAH) og give dem mulighed for at smelte i 2 timer intervaller. Derefter indsamles de 3^rd instar larver inden for 2 timer efter L3 ecdysis; denne procedure giver 0-2 hAL3E larver.
   4. Overfør de iscenesatte larver til en skål fyldt med fosfat buffered saltvand (PBS).
   5. Skyl larverne med PBS for at fjerne restfødevarer fra kroppen.
2. Grov dissektion af larver under et dissekerende mikroskop
   1. Hold mundkrogen på en larve med pincet. Afbryd larvekroppen ved den forreste tredjedel af kropslængden ved hjælp af mikrosaks.
   2. Hold den afskårne ende af den forreste larvekrop med et par pincet. Brug det andet par pincet, skub forsigtigt spidsen af hovedet mod indersiden af kroppen; denne procedure vender larvekroppen vrangen ud.
      BEMÆRK: Dette trin kan springes over for dissektion af 1^st instar larver.
   3. Gentag trin 1.2.1-1.2.2 med yderligere larver i 5-10 min.
      BEMÆRK: Antallet af larver skal være lig med eller mindre end 20 for at spare tid til dissektion.
3. Fiksering og farvning af væv med immunohistochemisteri
   1. En tredjedel af larvekroppene (trin 1.2.2) anbringes i et mikrorør på 1,5 mL fyldt med 500 μL fikseringsopløsningen (4% paraformaldehyd i PBS). Der udtages mindre end 20 prøver ad gangen, ellers kan PBS, der er fastgjort til de faste prøver, forårsage en ugunstig fortynding af fikseringsmærket. Til filetdissektion skal du fjerne en dråbe PBS og derefter tilføje en dråbe fikseringsopløsning.
      BEMÆRK: Til fikseringsopløsning kan der anvendes enten 3,7% formaldehyd eller 4% paraformaldehyd.
   2. Det dissekerede væv inkuberes i fikseringsopløsningen i 30 minutter ved stuetemperatur (RT) eller alternativt i 2 timer ved 4 °C.
   3. Fixopløsningen udskiftes med 500 μL PBS, og prøverne skylles hurtigt 3 gange. Prøverne vaskes med 500 μL 0,3% PBT (PBS + 0,3% octylphenol ethoxylat) i 15 minutter på en vippe på RT. Til filetdissektion skal du fjerne insektstifterne og overføre prøverne til et 1,5 mL mikrorør.
      BEMÆRK: For at øge permeabiliteten af antistoffer i væv behandles prøverne med 500 μL 2,0% PBT i 1-2 timer på en rocker ved RT.
   4. PBT udskiftes med 500 μL blokeringsopløsning (2% kvægserumalbumin i PBT). Inkuber prøverne i 1,5 timer på en rocker på RT.
   5. Blokeringsopløsningen erstattes med 50 μL den primære antistofopløsning, dvs.
   6. Prøverne inkuberes natten over på en vippe ved 4 °C.
   7. Den primære antistofopløsning udskiftes med 500 μL 0,3% PBT, og prøverne skylles hurtigt 5 gange. Prøverne vaskes 3 gange med 500 μL 0,3% PBT i 15 minutter hver på en rocker på RT.
   8. 0,3% PBT erstattes med 50 μL den sekundære antistofopløsning (farvekonjugerede antistoffer fortyndet i blokeringsopløsningen). Til nuklear farvning tilsættes 0,5 μL 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, 0,1 mg/ml stamopløsning) til 50 μL opløsning. Prøverne inkuberes på en vippe i 2 timer ved RT eller alternativt ved 4 °C natten over.
      BEMÆRK: Hold prøverne i uvidenhed.
   9. Antistofopløsningen udskiftes med 500 μL 0,3% PBT og skylles 5 gange. Prøverne vaskes 3 gange med 500 μL 0,3% PBT i 15 min hver ved RT.
4. Fin dissektion af hjerne-RG-komplekset, der indeholder PG og montering
   1. Brug en engangspipet til at overføre de immunostained prøver til en skål fyldt med 0,3% PBT.
      BEMÆRK: For at undgå ubelejlige bobler under dissektion og montering kan 0,3% PBT udskiftes med PBS.
   2. Under et dissekerende mikroskop skal du holde neglebåndet eller mundkrogen med et par pincet. Brug en 27 G nål fastgjort til en 1 mL sprøjte som en "kniv", skære den forreste spids af spiserøret og øjet diske til at fjerne hjerne-RG-eye disk kompleks fra kroppen neglebånd.
   3. Adskil spiserøret og tarmen fra hjerne-RG-eye disk kompleks med pincet. Da spiserøret passerer gennem hjernen over ventral nerve ledningen (VNC), trække tarmen til den bageste side.
      BEMÆRK: Hvis du vil fjerne ekstra imaginale diske fra prøverne, skal du klippe forbindelserne mellem hjernen, øjenskiverne og benskiverne med en nålekniv.
   4. Gentag trin 1.4.1-1.4.4 for andre prøver.
      BEMÆRK: For at forhindre vævsrester i at klæbe til prøverne skal hver afsluttet prøve overføres til en anden ren skål fyldt med 0,3% PBT eller PBS.
   5. Overfør prøverne til midten af en ren glasrutsjebane med en mikropipette.
      BEMÆRK: For 2^nd eller 3^rd instar larver skal enden af en micropipettespids afkortes med et barberblad.
   6. Under et dissekerende mikroskop skal du justere individuelle prøver med deres dorsale side op ved hjælp af pincet.
      BEMÆRK: RG er placeret på den dorsale side af hjernen (Figur 2A). Denne justering letter specifikationen af individuelle prøver under billedbehandling.
   7. Vip en glasrutsjebane, og tør så meget overskydende PBT af som muligt. Sæt en dråbe monteringsreagens på en side af rutsjebanen. Placer kanten af et dæksel slip fra den anden side af dråben og læg dækslet slip på prøverne langsomt med pincet.
      BEMÆRK: Denne fremgangsmåde forhindrer prøverne i at bevæge sig uden for dækslet.
   8. Prøverne opbevares ved 4 °C. Hold prøverne i uvidenhed.

Representative Results

Figur 1: Den samlede protokolordning. To forskellige dissektionsmetoder gælder for larver og voksne kvinder, afhængigt af formålet med forsøgene. Monteringsmetoderne udtænkes også i henhold til prøvebetingelserne. Fiksering, farvning og billeddannelsesteknikker er dybest set fælles for alle prøver. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Visualisering af PG og PG-projicerende Neuroner. (A og B)Hjerneringkirtlen (RG) komplekset af den vilde type 3^rd instar larve. I (B) er PG skitseret af syede linjer. Den filamentøse struktur mellem hjernen og RG er luftrøret. (C-E) Innervation af PG blev visualiseret med mCD8::GFP drevet af GMR45C06-GAL4 i FlyLight kollektion. PG og GFP-positive neuroner var mærket med anti-Sro antistof (magenta) og anti-GFP antistof (grøn), henholdsvis. Det fluorescerende billede flettes med det transmitterede lysbillede for at angive vævenes kontur. I (D) illustreres PG, corpora allata (CA) og corpora cardiaca (CC). PG-projicerende neuroner er mere fremtrædende i high-power billedet med 40X objektiv linse (pile i E) end den lave effekt billede med 10X objektiv linse (C). Skalalinje = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Egg collection
tissue culture dish (55 mm)	AS ONE	1-8549-02	for grape-juice agar plates
collection cup	HIKARI KAGAKU
yeast paste	Oriental dry yeast, Tokyo
100% grape juice	Welch Food Inc.
rearing larvae
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS)	SARSTEDT	58.487
disposable loop	AS ONE	6-488-01
standard fly food			The recipe is on the website of Bloomington stock center.
Dissection
dissecting microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
dissecting microscope	Leica	S8 AP0
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated)	IWAKI	1000-035
Sylgard	TORAY		coarting silicon inside dishes
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm)	TERUMO	NN-2719S	A "knife" to cut the tissue
forceps, Inox, #5	Dumont, Switzerland
insect pin (0.18 mm in diameter)	Shiga Brand		for fillet dissection
micro scissors	NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.	MB-50-10
Fixation
ultrapure water	Merck Millipore
phosphate buffered saline (PBS)
Formaldehyde	Nacalai tesque	16222-65
Paraformaldehyde	Nacalai tesque	02890-45
Triton-X100	Nacalai tesque	35501-15
microtubes (1.5 ml)	INA OPTIKA	CF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker)	As one	TM-300	rocker
Bovine Serum Albumin	SIGMA	9048-46-8
Primary antibody
anti-Sro (guinea pig), 1:1000
anti-GFP (rabbit), 1:1000	Molecular Probes	A6455	Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100	Nakarai tesque	04363-66
anti-5HT (rabbit), 1:500	SIGMA	S5545
anti-Hts 1B1 (mouse)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1
anti-DE-cadherin (rat), 1:20	DSHB	DCAD2
anti-nc82 (mouse), 1:50	DSHB	nc82
Secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11008
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11001
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate	Life Technologies	A-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate	Life Technologies	A-21435
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin	Life Technologies	A-22283
Mounting reagents
Micro slide glass	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	SS7213
Square microscope cover glass	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	C218181
FluorSave reagent (Mounting reagent)	Calbiochem	345789
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper)	WATSON	5660-222-1S
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP			gifts from K. Ito, The University of Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4			Li, H. H. (2014) and Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010)
w; UAS-mCD8::GFP			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)