Larve Ring Kirtel Dissektion: Isolation af udviklingsmæssige endokrine organer fra Drosophila

- For at dissekere ringkirtlen skal du bruge et dissekerende mikroskop, to pincet, en finmålernål til at tjene som dissekeringskniv og en bufferløsning. Find ringkirtlen ved at identificere larvernes hoved, som indeholder mundkrogene.

Larveringen kirtel er en kompleks endokrine struktur, der indeholder tre forskellige endokrine organer. Corpus allatum sidder i midten af ringkirtlen og producerer ungdomshormon, som regulerer udvikling og aldring. Prothoracic kirtlen omgiver corpus allatum og udgør størstedelen af strukturen. Ecdysone, et hormon involveret i insektmalt, er lavet af denne kirtel. Under prothoracic kirtel er corpus hjertekød, der producerer adipokinetic hormon, et næringsstof regulator.

I dette eksempel vil vi dissekere larvehjerner og ringkirtler til immunhistokemi.

- Når du har forberedt larverne, skal du starte kurset dissektion i en tre centimeter skål fyldt med PBS under et dissekerende mikroskop. For det første skal du gribe fat i mundkrogen med pincet. Derefter skal du ved hjælp af mikrosaks afskære kroppen med omkring en tredjedel af længden fra den forreste spids. Næste skal du holde den forreste længde med et par pincet og bruge et andet par til forsigtigt at skubbe spidsen af hovedet ind i kroppen for i sidste ende at vende larvekroppen vrangen ud.

Forbered op til 20 larver på denne måde inden for 10 minutter og overfør dem derefter til fiksativ opløsning. Efter 30 minutter vaskes præparaterne og fortsættes med immunostaining. Efter immunostaining larverne skal du bruge en engangspipette til at overføre prøverne til en skål fyldt med 0,3% PBT.

Under et dissekerende mikroskop skal du gribe fat i neglebåndet eller mundkrogen med et par pincet. Brug derefter en 27-gauge nål fastgjort til en en milliliter sprøjte som en kniv for at fjerne hjerneringkirtlen- øjenskivekomplekset fra kroppens neglebånd ved at skære væk den forreste spids af spiserøret og øjenskiverne.

Dernæst ved hjælp af pincet, omhyggeligt adskille spiserøret og tarmen fra hjernen-ring kirtel-øje disk kompleks. Træk tarmen ud til den bageste side, da spiserøret passerer gennem hjernen over ventral nerve ledningen. Endelig, at isolere hjerne-ring kirtel kompleks, omhyggeligt skære forbindelserne mellem hjerneskiven, øje diske, og ben diske med en nål kniv.

- Det er helt afgørende at bruge fine pincet med skarpe kanter under dissektion. Jeg anbefaler også på det kraftigste, at man skærper tangen med en Arkansas slibesten for at bringe deres kanter sammen uden huller.

- For at overføre prøverne skal du bruge en mikropipette med en bred borespids. Sæt prøverne på midten af glasrutschebanen. Brug derefter pincet til at placere prøverne på deres ventrale sider, så ringkirtlen, der er placeret på rygsiden af hjernen, kan afbildes. Næste, vip rutsjebanen og tør så meget af den overskydende PBT som muligt. Derefter sættes en dråbe monteringsreagens i nærheden af prøverne og brug pincet til langsomt at sænke en coverlip over reagenset og derefter over prøverne.