Novel Tank Diving Assay: En metode for å studere medfødte stressresponser i sebrafisk

Overview

Artikkelen beskriver en atferdsmetode for å vurdere stress i sebrafisk. Som svar på stress har sebrafisk en tendens til å svømme på bunnen av en tank til stress er fjernet. Eksempelprotokollen beskriver trinnvis metode for å utføre analysen.

Protocol

1. Nytt tanktestoppsett

1. Forbered en 250 ml beger ferdigfylt med fiskesystemvann, og minst to lagertanker.
2. På morgenen av testen, overfør minst 10 test voksen sebrafisk som skal brukes til hver eksperimentell tilstand (kontroller og eksperimentelle voksne) fra fiskeanlegg til en lagertank, overfør dem til atferdsrommet, og la dem akklimatisere i minst en time.
   MERK: En kraftanalyse bør utføres før eksperimentering, men i våre hender er en n = 10 vanligvis tilstrekkelig til å oppdage statistisk signifikans. Videre bør lagertanken ikke inneholde mer enn fem personer per liter vann. En akklimatisering på en time er tilstrekkelig ettersom sebrafisk voksne har vist seg å habituate innen 30 minutter etter en ny tank. Også atferdsrytmer påvirkes av døgnprosesser, og dermed bør eksperimentelle replikeringer gjort på forskjellige dager utføres innen samme timer. Vi utfører vanligvis alle eksperimenter mellom kl. 11.00 og 18.00.
3. Merk tankene slik at tilstanden eller genotypen til dyrene er blind for eksperimentet.
   MERK: Eksperimenter kan enkelt blindes til eksperimentet ved å merke tanker ved hjelp av et bokstav- eller tallsystem (dvs. en tank er merket 'A', en annen 'B', etc.). En part som ikke er involvert i eksperimentene merker tankene med et slikt system, og maskerer identitetene fra eksperimentet til etter at analysen er fullført.
4. Bruk et nett til å plassere en enkelt voksen forsiktig i det ferdigfylte begeret fra trinn 1.1. La den voksne fisken akklimatisere seg i begeret i 10 minutter.
   MERK: Registrer kjønnet til den voksne, da det kan være viktig etter analyse å se etter sexspesifikke forskjeller.
5. Etter akklimatisering i begeret, introduser fisken i den nye tanken (sett opp detaljer nedenfor) ved å forsiktig helle ut vannet og voksen fra begeret.
   MERK: Trinnene i denne delen beskriver hvordan du konfigurerer den nye tankanalysen. Et diagram over sluttproduktet er gitt i figur 1B.
   1. Plasser den nye tanken midt på bordet.
   2. Plasser de infrarøde lysene bak tanken og plasser det hvite akrylarket eller diffusorskjermen mellom tanken og LED-lyskilden.
   3. Plasser diffusoren slik at den maksimalt sprer lyset som kommer fra lysdiodene, og lysets intensitet er nok til å belyse den nye tanken. Jo nærmere brettet er lyskilden, jo lysere blir lysene, men jo mindre vil det spre seg. Hvis du derimot plasserer diffusorkortet vekk fra lyskilden, reduseres lysintensiteten, men lyset spres bedre.
   4. Fyll omtrent tre fjerdedeler av den nye tanken med fiskesystemvann.
      MERK: Systemvann genereres ved hjelp av omvendt osmose av vann fra springen, etterfulgt av dosering slik at ledningsevnen tilsvarer 900 ± 100 μS, at pH er nøytral (7,2), og at temperaturen er 27 ± 1 °C.
   5. Koble kameraet til kamerastativet og koble kameraet til datamaskinen. Åpne videoanskaffelsesprogramvaren og juster kameraet for å møte forsiden av tanken og sørg for at hele den nye tanken kan sees, og at det ikke er noen skjulte områder i videoen. Juster tanken og de infrarøde lysene slik at det er tilstrekkelig og jevn belysning gjennom tanken når den observeres gjennom kameraet.
      MERK: Før du går videre til eksperimenter, kan det ofte være nyttig å utføre en prøvekjøring, der video av en fisk fanges og sporing utføres. Dette vil sikre at oppsettet er tilstrekkelig for eksperimentering av atferd.
6. Etter å ha introdusert den voksne i den nye tanken, start kameraopptaket og flytt bort fra oppsettet for å forhindre ekstra nød for fisken.
7. Etter at innspillingen er ferdig, fjern personen fra den nye tanken og legg den i en ny lagertank.
   MERK: En annen lagertank enn den i trinn 1.2 bør brukes til å forhindre gjentatt testing på de samme personene.

Representative Results

Figur 1. Diagram over det nye tankoppsettet. (A) Dimensjoner på den 1,8 L trapesformede nye tanken sett fra opptakssiden av tanken. (B) Diagram over oppsettet, inkludert posisjonene til infrarøde lys, kamera og barrierer som brukes til å minimere menneskelig interferens.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera			We use Point Grey Grasshopper3 USB camera with lens from Edmund Optics.
Infrared filter	Edmund Optics
Video Acquisition Program			Use programs such as Virtualdub or FlyCapture because the acquisition framerate can be set.
Infrared LED lights
Assay tank	Aquaneering	Part number ZT180	Size: M3 1.8 liter
Stand and clamp, or standard tripod for camera
250mL beaker
Tracking software			We use Ethovision XT 13 from Noldus Information Technology