Dissecção da lente dos olhos: uma técnica para observar a morfologia das lentes de zebrafish

Overview

Este vídeo descreve o protocolo que é desenvolvido para dissecar lentes de zebrafish adultos e larvais para analisar a morfologia das lentes corticais e a integridade estrutural das suturas das lentes.

Protocol

1. Dissecção de Lentes larval e zebrafish adulta

1. Anesthetize peixes de 6 dpf larvas até a idade adulta com tricaine até não responder ao toque, mas ainda mostrando um batimento cardíaco forte. Meça o comprimento padrão do peixe conforme Schilling (2002) para encenação.
2. Extir esse consumo imediato de olhos usando tesouras de microdiscção e coloque em um prato de dissecção em PBS (Figura 1 mostrada para olhos adultos).
   1. Faça um prato personalizado de 35 mm recheado com silicone para dissecções de lentes. Uma vez que o silicone tenha definido, extirve um divot de cerca de 2-3 mm de diâmetro e 0,5 mm de profundidade para imobilizar olhos/lentes adultas durante a dissecção.
3. Dissecção de lentes adultas de zebrafish
   1. Coloque um olho adulto no lado posterior do prato divot cheio de PBS. Imobilize o olho inserindo fórceps no ângulo <45° através do disco óptico. Tenha cuidado para não cortar ou comprimir a lente. Faça duas ou três incisões radiais através da retina e esclera do disco óptico para a zona ciliar com tesoura de dissecção.
   2. Descasque a retina e a esclera como pétalas de flores e inverta o olho, lado da córnea para cima. Imobilize a lente indiretamente através da manipulação da esclera e córnea com o lado plano da tesoura, enquanto afasta a retina e os tecidos ligados com fórceps. Corte cuidadosamente o excesso de tecido da lente.
      NOTA: É vital dissecar cuidadosamente para obter lentes consistentemente saudáveis.
4. Dissecção de lentes de zebrafish larval
   1. Coloque um lado posterior do olho larval sobre a parte plana do prato de silicone preenchido com PBS e use uma agulha de tungstênio afiada para fazer cortes radiais através da retina e esclera enquanto imobiliza o olho com outra agulha de tungstênio ou fórceps.
      NOTA: Tenha cuidado para não danificar a lente.
      1. Afie a ponta de um fio de tungstênio de 2 cm eletrolítico, suspendendo a ponta do fio em 10% (w/v) NaOH e aplicando uma corrente alternada de baixa tensão14. Fixar a agulha em uma pipeta Pasteur derretendo a extremidade de vidro usando um queimador Bunsen.
         NOTA: Ferramentas alternativas de dissecção de multa também podem ser usadas.
         ATENÇÃO: NaOH é corrosivo.
   2. Retire suavemente a lente do olho dissociado com um lado contundente da agulha, e puxe cuidadosamente o tecido preso.

Representative Results

Figura 1: Dissecção de lentes de zebrafish. (A) Os olhos são dissecados a partir de peixes anestesiados e colocados posteriormente para cima (B). (C) Os olhos são imobilizados por fórceps através do disco óptico (od) e duas a três incisões radiais são feitas na retina e esclera do disco óptico para as zonules. (D) Dobre as abas para revelar a lente. (E) Gire a córnea olho para frente, imobilize a lente indiretamente através da córnea e retire a esclera-retina. (F) Cortar a retina restante e zona ciliar/zonules da lente

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP399
Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Dumont #5 forceps	Dumont & Fils		Keep forceps sharpened
Vannas micro-dissection scissors	Ted Pella Inc	1346	Sharp/sharp straight tips
Confocal microscope	Nikon		Eclipse Ti-E
Sodium Hydroxide beads	Fisher Scientific	S612-3	CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2019 Journal of Visualized Experiments Page 2 of 2 respiratory system, corrosive to metals
Disposable Pasteur glass pipets	Fisherbrand	13-678-20A