Iniezione di vene di coda: Un metodo per somministrare cellule tumorali per studi metastatici in un modello di topo

Overview

Questo video descrive una tecnica di iniezione di cellule tumorali etichettate usando l'iniezione di vene della coda in un modello di topo. Monitoriamo ulteriormente la formazione di metastasi del cancro al seno e la crescita utilizzando l'imaging animale vivo in vivo in tempo reale.

Protocol

1. Iniezione della vena di coda di cellule tumorali etichettate

NOTA: Il passaggio 1.2.4 è stato ottimizzato per la crescita di cellule 4T1 in topi BALB/c sigeneici. Se vengono utilizzate altre linee cellulari tumorali e ceppi di topo, il numero di cellule iniettate e la lunghezza del saggio devono prima essere ottimizzati.

1. Espandere le linee cellulari 4T1 generate nel passaggio 2 su due piatti da 15 cm in mezzi di crescita completi in modo che le cellule in eccesso siano disponibili il giorno dell'iniezione.
2. Preparare le cellule per l'iniezione delle vene della coda come segue:
   1. Aspirare il supporto e sciacquare le piastre cellulari con 1x PBS.
   2. Tripinare le cellule con 5 mL di tripside per piastra di 15 cm per 2-5 minuti (le cellule devono risciacquare liberamente dal fondo del pozzo). Trasferire tutte le celle in un tubo conico. Lavare le cellule rimanenti dal piatto di coltura tissutale con mezzi di crescita completi sufficienti per temprare la tripina e aggiungere il lavaggio allo stesso tubo conico.
   3. Contare le celle utilizzando un contatore di celle automatico per determinare il numero di cella totale.
   4. Centrifugare le cellule a 122 x g per 3 minuti, aspirare il supernatante e rimescolare le cellule in 1x PBS alla concentrazione desiderata. Qui, 2,5 x 10^{4 cellule vengono} iniettate in ogni topo in 100 μL di PBS, quindi le cellule resuspend a 2,5 x 10⁵ celle/mL. Mantenere le sospensioni cellulari sul ghiaccio fino all'iniezione.
      NOTA: è importante limitare la quantità di tempo tra la trippsinizzazione delle cellule e l'iniezione della vena della coda a circa 1 ora.
3. Iniettare cellule 4T1 dal passo 1.2.5 nei topi attraverso la vena laterale della coda come segue:
   1. Lavorando in un cappuccio presso l'impianto animale, mescolare delicatamente ma accuratamente le cellule invertendo il tubo o utilizzando una siringa da 1 ml per assicurarsi che siano riutilizzate uniformemente. Assicurarsi sempre che le cellule vengano rimorsi prima di caricare la siringa.
   2. Caricare una siringa luer-lock da 1 ml con sospensione cellulare ed espellere le bolle d'aria in eccesso. Posizionare un ago da 1/2 pollice e calibro 30 sulla siringa con la smussatura ed espellere le bolle d'aria.
   3. Posizionare delicatamente il mouse in un limitatore di roditori.
   4. Le vene posteriori della coda dovrebbero essere visibili e dilatate. In caso meno, pizzicare delicatamente la base della coda e immergere la coda in acqua calda del rubinetto per dilatare le vene.
      NOTA: La dilatazione delle vene può essere ottenuta anche posizionando la gabbia del topo sotto una lampada riscaldante e/o sopra una pastiglia riscaldante.
   5. Usa una salvietta alcolica per pulire la coda. Inserire l'ago nella vena della coda, smussare il lato verso l'alto e iniettare 100 μL di sospensione cellulare.
      NOTA: Se l'ago è inserito correttamente nella vena, dovrebbe facilmente scivolare leggermente in avanti e indietro e non dovrebbe esserci resistenza quando lo stantuffo viene spinto. Le iniezioni di successo dovrebbero anche comportare un "lavaggio" in cui il colore blu della vena diventa bianco per alcuni secondi dopo l'iniezione.
4. Rimuovere lentamente l'ago e utilizzare una garza sterile, applicare pressione sul sito di iniezione per interrompere qualsiasi sanguinamento.
5. Riportare il mouse nella gabbia e monitorare per 15 minuti per garantire il pieno recupero. I topi devono essere controllati per i segni di dolore o angoscia 3 volte alla settimana.
6. Monitorare i topi per la formazione e la crescita della metastasi per 3-6 settimane (linea cellulare e ceppo di topo dipendente) utilizzando un dispositivo di imaging animale vivo in vivo (vedere i passaggi 1.5 e 1.6).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5% Trypsin	Gibco	15090-046	Trypsin for tissue culture
Alcohol wipes			For sterolizing the injection site before tail vein injecitons
BALB/C mice (female, 6 weeks)	Taconic	BALB-F	For tail vein metastatic colonization and burden assays
Dulbecco&39;s phosphate buffered saline	Himedia	TS1006
EDTA	VWR	97061-406	Used to dilute trypsin for tissue culture
FBS 100% US origin	VWR	97068-085	Component of complete growth media
L-Glutamine	Gibco	25030-081	Component of complete growth media
Mouse breast cancer cells, 4T1	Karmanos Cancer Institute	Aslakson, CJ et al.,1992	Mouse metastatic breast cance cell line
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122	Component of complete growth media