꼬리 정맥 주입: 마우스 모형에 있는 전이성 연구를 위한 암세포를 관리하는 방법

Overview

이 비디오는 마우스 모형에 꼬리 정맥 주입을 사용하여 표지된 암세포를 주입하는 기술을 기술합니다. 우리는 또한 유방암 전이 형성을 감시하고, 생체 내 살아있는 동물 화상 진찰에서 실시간으로 사용하여 성장.

Protocol

1. 표지된 암세포의 꼬리 정맥 주입

참고: 단계 1.2.4는 syngeneic BALB/c 마우스에서 성장하는 4T1 세포에 최적화되었습니다. 다른 암 세포주 및 마우스 균주를 사용하는 경우, 주입 된 세포의 수와 분석의 길이가 먼저 최적화되어야합니다.

1. 주입 당일 에 초과 세포를 사용할 수 있도록 완전한 성장 매체에서 2 단계에서 생성 된 4T1 세포주를 완전한 성장 매체로 확장하십시오.
2. 다음과 같이 꼬리 정맥 주입을 위한 세포를 준비하십시오:
   1. 미디어를 흡인하고 1배 PBS로 셀 플레이트를 헹구세요.
   2. 2-5 분 동안 15cm 플레이트 당 5 mL의 트립신으로 세포를 트립시화하십시오 (세포는 자유롭게 우물의 바닥에서 헹구어야합니다). 모든 세포를 원물 튜브로 옮기습니다. 트립신을 담금질하고 동일한 원추형 튜브에 세척을 추가 하기에 충분 한 전체 성장 매체와 조직 배양 접시에서 나머지 세포를 세척.
   3. 자동화된 셀 카운터를 사용하여 셀을 계산하여 총 셀 수를 결정합니다.
   4. 세포를 122 x g에서 3분 동안 원심분리하고, 수퍼나탄을 흡인시키고, 원하는 농도에서 1x PBS로 세포를 재연한다. 여기서, 2.5 x 10⁴ 세포는 PBS의 100 μL에서 각 마우스에 주입되므로 2.5 x 10⁵ 셀/mL에서 세포를 다시 중단합니다. 세포 현탁액을 주입 할 때까지 얼음에 보관하십시오.
      참고: 세포의 트립시닝과 꼬리 정맥 주입 사이의 시간을 약 1 시간으로 제한하는 것이 중요합니다.
3. 다음과 같이 측면 꼬리 정맥을 통해 마우스에 단계 1.2.5에서 4T1 세포를 주입하십시오.
   1. 동물 시설에서 후드에서 작업, 부드럽게하지만 철저하게 튜브를 반전하거나 균일하게 다시 중단되도록 1 mL 주사기를 사용하여 세포를 혼합. 주사기를 적재하기 전에 셀이 항상 다시 중단되었는지 확인하십시오.
   2. 셀 서스펜션으로 1mL 루어 락 주사기를 적재하고 과도한 기포를 추방합니다. 1/2 인치, 30 게이지 바늘을 주사기에 놓고 기포를 추방합니다.
   3. 마우스를 설치류 제지제에 부드럽게 배치합니다.
   4. 측면 꼬리 정맥을 보이고 넓혀야 합니다. 그렇지 않은 경우 꼬리의 베이스를 부드럽게 꼬집어 따뜻한 수돗물에 꼬리를 담그고 정맥을 팽창시다.
      참고: 정맥의 팽창은 또한 가열 램프 의 밑에 마우스 케이지를 놓고/또는 가열 패드의 위에 두어달성될 수 있습니다.
   5. 꼬리를 청소하기 위해 알코올 닦아사용합니다. 바늘을 꼬리 정맥에 삽입하고, 옆구리를 위로 베벨하고, 세포 현탁액의 100 μL을 주입한다.
      참고: 바늘이 정맥에 제대로 삽입되면 약간 앞뒤로 쉽게 밀어야하며 플런저를 밀어 넣을 때 저항이 없어야합니다. 성공적인 주사는 또한 정맥의 청색이 주입 후 몇 초 동안 흰색으로 변하는 "플러시"를 초래해야합니다.
4. 천천히 바늘을 제거하고 멸균 거즈를 사용하여, 어떤 출혈을 중지 주사 부위에 압력을 적용합니다.
5. 마우스를 케이지에 반환하고 전체 복구를 보장하기 위해 15 분 동안 모니터링하십시오. 마우스는 매주 3배의 통증이나 요난의 징후를 확인해야합니다.
6. 생체 내 살아있는 동물 화상 진찰 장치를 사용하여 3-6 주 (세포주 및 마우스 변형 에 의존하는) 전이 형성 및 성장을 위한 마우스를 모니터링합니다(1.5 단계 및 1.6 단계 참조).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.5% Trypsin	Gibco	15090-046	Trypsin for tissue culture
Alcohol wipes			For sterolizing the injection site before tail vein injecitons
BALB/C mice (female, 6 weeks)	Taconic	BALB-F	For tail vein metastatic colonization and burden assays
Dulbecco&39;s phosphate buffered saline	Himedia	TS1006
EDTA	VWR	97061-406	Used to dilute trypsin for tissue culture
FBS 100% US origin	VWR	97068-085	Component of complete growth media
L-Glutamine	Gibco	25030-081	Component of complete growth media
Mouse breast cancer cells, 4T1	Karmanos Cancer Institute	Aslakson, CJ et al.,1992	Mouse metastatic breast cance cell line
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122	Component of complete growth media