Iniezione di vene di coda: Un metodo per somministrare cellule tumorali per studi metastatici in un modello di topo

Inizia aggiungendo tripina in una piastra di Petri contenente cellule tumorali del seno etichettate per staccarle dalla superficie. Aggiungere il mezzo contenente siero per interrompere l'azione della tripsina. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico e centrifugarla in cella a pellet.

Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in salina tamponata con fosfato. Posizionare il tubo sul ghiaccio per rallentare il metabolismo cellulare. Caricare questa sospensione cellulare contenente la quantità richiesta di cellule in una siringa di blocco Luer e fissarla su di essa.

Posizionare un topo in un limitatore di roditori con la coda all'esterno. Immergere la coda in acqua tiepida per dilatare le vene. Ci sono due vene sui lati laterali e un'arteria sul lato ventrale della coda. Pulire la coda con alcool, inserire l'ago e iniettare la sospensione cellulare.

Una volta nel flusso sanguigno, le cellule tumorali iniettate invadono gli organi, come i polmoni, e proliferano. Rimuovere lentamente l'ago e utilizzare una garza sterile sul sito di iniezione per applicare pressione per interrompere il sanguinamento. Riportare il mouse nella sua gabbia e garantire un pieno recupero. Nel seguente protocollo, dimostriamo l'iniezione di cellule tumorali metastatiche etichettate in un modello di topo per quantificare la metastasi e la colonizzazione del cancro al seno.

Aspirare il supporto e sciacquare le piastre cellulari con 1X PBS. Tripinare le cellule con 5 millilitri di tripside per piastra di 15 centimetri per due o cinque minuti e trasferire tutte le cellule in un tubo conico. Lavare le cellule rimanenti dal piatto di coltura tissutale con mezzi di crescita completi sufficienti per temprare la tripina. Aggiungere il lavaggio allo stesso tubo conico. Contare le celle utilizzando un contatore di celle automatico per determinare il numero di cella totale.

Quindi, centrifugare le cellule a 122 volte G per tre minuti e aspirare il supernatante. Rimossare le cellule in 1X PBS alla concentrazione desiderata. Qui, 25.000 cellule vengono iniettate in ogni topo in 100 microlitri di PBS, quindi le cellule resuspended sono a 250.000 cellule per millilitro. Mantenere le sospensioni cellulari sul ghiaccio fino all'iniezione.

Lavorando in un cappuccio presso la struttura animale, mescolare delicatamente, ma mescolare accuratamente le cellule invertendo il tubo o usando una siringa da 1 millilitro per assicurarsi che vengano riutilizzate uniformemente. Ora, carica una siringa di blocco Luer da 1 millilitro con sospensioni cellulari ed espello le bolle d'aria in eccesso. Posizionare un ago da 1/2 di pollice e 30 calibro sulla siringa con la smussatura ed espellere le bolle d'aria.

Posizionare delicatamente il mouse in un limitatore di roditori. La vena laterale della coda dovrebbe essere visibile e dilatata. In caso meno, pizzicare delicatamente la base della coda e immergere la coda in acqua calda del rubinetto per dilatare le vene. Usa una salvietta alcolica per pulire la coda. Quindi inserire l'ago nella vena della coda, smussare il lato verso l'alto e iniettare 100 microlitri di sospensione cellulare. Se l'ago è inserito correttamente nella vena, dovrebbe facilmente scivolare leggermente in avanti e indietro e non dovrebbe esserci resistenza quando lo stantuffo viene spinto.

Le iniezioni di successo dovrebbero anche comportare un lavaggio, in cui il colore blu della vena diventa bianco per alcuni secondi dopo l'iniezione. Rimuovere lentamente l'ago e, utilizzando una garza sterile, applicare pressione sul sito di iniezione per fermare qualsiasi sanguinamento. Riportare il mouse nella gabbia e monitorare per 15 minuti per garantire il pieno recupero.