Summary
Изготовление микрожидкостных каналов и их реализация в экспериментах для изучения хемотаксиса нагула поведение морских микробов в питательную пятнистый морской пейзаж и плавание поведение бактерий в сдвиговом потоке описаны.
Abstract
Степень, в которой планктонных микробов могут использовать микромасштабной патчи ресурс будет иметь значительные последствия для океанических трофодинамика и биогеохимических потоков. Однако, чтобы воспользоваться питательной пятна в океане, плавание микробы должны преодолеть влияние физических сил в том числе молекулярной диффузии и турбулентного сдвига, который будет ограничивать доступность патчей и способность бактерий, чтобы найти их. До недавнего времени методологические ограничения есть исключается прямое экзаменов микробного поведения в местах обитания пятнистый и реалистичные мелкие условиях потока. Таким образом, большая часть наших знаний о микробной поведения в океан, было получено от теоретических предсказаний. Для получения новой информации о микробной нагула поведения в океане мы применили мягкие литографических методов изготовления развивать 2 микрожидкостных устройств, которые мы использовали для создания (я) микромасштабной питательных пятна с размерами и характеристиками диффузионного отношение к океанических процессов и (II) микромасштабной вихрей, с скоростях сдвига, соответствующие этим ожидается в океан. Эти микрожидкостных устройств позволили первое прямое изучение микробной плавания и хемотаксиса поведения в гетерогенных и динамические морской пейзаж. Комбинированное использование epifluorescence и микроскопии фазового контраста позволяют осуществлять прямое обследование физические размеры и диффузионных характеристик питательных патчей, в то время как наблюдения на уровне населения агрегатного ответа, в дополнение к плаванию поведении отдельных микробов. Эти эксперименты показали, что некоторые виды фитопланктона, гетеротрофных бактерий и простейших phagotrophic имеют большой опыт по поиску и использованию диффундирующих микромасштабной патчи ресурсов в очень короткие сроки. Мы также показали, что до умеренных скоростях сдвига, морские бактерии способны бороться с потоком и плавать в их среде по собственному желанию. Тем не менее, за порог высокий уровень сдвига, бактерии ориентированы в сдвиговом потоке и менее способны плавание без нарушения из потока. Microfluidics представляет собой новый и недорогой подход к изучению водной экологии микробов, и из-за его пригодность для точного создания реалистичных поля потока и подложки градиенты на микроуровне, идеально применимы к экзаменам микробного поведения на самых малых масштабов взаимодействия. Поэтому мы предлагаем микрофлюидики представляет собой ценный инструмент для получения лучшего понимания экологии микроорганизмов в океане.
Protocol
Подготовка
1. Создайте маску
Использование программного обеспечения CAD, дизайн канала для печати с высоким разрешением на прозрачность. Это будет "Маска".
В чистой комнате:
2. Чистота и выпекать пластины
Во-первых, струя пластины с ацетоном, а затем быстро с метанолом, затем с изопропанола. Наконец, сухие пластины использованием азота.
Выпекать пластины в духовку (130 ° C) в течение 5 мин.
3. Покрытие пластин
Место пластины в центре спин-покрытие машины. Налейте фоторезиста (ГУ-8) из бутылки на пластине. Пусть SU-8 потоков и отдохнуть в течение ~ 10 с Включите спин-рампа для нанесения покрытий и его ускорения с 0 до 500 оборотов в минуту в течение 5 с, держать на 500 оборотов в минуту в течение 10 с; рампы до конечной скоростью более 10 с и поддерживает на конечной скоростью в течение 30 сек Конечная скорость зависит от целевой толщины покрытия и SU-8 используется. Подробную информацию можно найти на http://www.microchem.com/
4. Soft-печь
После нанесения покрытия на пластины, испечь его первым при 65 ° С, а затем при 95 ° C. Время выпечки зависит от целевой толщины и типа фоторезиста используется. Тогда, позвольте пластины сидеть при комнатной температуре в течение не менее 5 мин.
5. Экспозиция
Место маски в верхней части пластины и разоблачить пластины УФ-свет на время, рекомендуется в СУ-8 руководства.
6. Постконтактная испечь
Выпекать пластин при 65 ° С, а затем 95 ° C следующих SU-8 Инструкция по.
7. Разработка пластин для получения "мастер" (форм)
Подготовка стакан заполнен разработчиком (PMMA). Погрузите пластин в мензурку в то время как очень мягко осциллирующих стакан, пока часть неэкспонированные из фоторезиста вымываются.
В нашей лаборатории:
8. Подготовка PDMS и залить его на пластины
Смешайте PDMS с отвердителем в соотношении 10:1 в чашку. Перемешать и смешать его однородно: это будет генерировать много пузырьков и сделать смесь выглядят непрозрачными. Вылейте смесь на "мастер".
9. Де-пузырь в вакуумной камере
Для удаления пузырьков, расположенных мастера и PDMS смесь, которая покрывает его в вакуумную камеру, пока все пузырьки исчезли.
10. Выпечки в духовке
Выпекать в течение по крайней мере 12 часов в духовке при температуре 65 ° С, чтобы укрепиться PDMS.
11. Пробивки отверстий
Снимите PDMS от мастера и пробивки отверстий для входов и выходов из каналов.
В чистом помещении (не показаны)
12. Плазменные связи
Каналы крепятся к стеклу после лечения как слой PDMS и стекло с кислородной плазмы в течение 1 мин.
Эксперименты:
Опыт № 1: Исследование хемотаксиса ответ морских микробов к микро-масштабе питательного слоя
1) Настройка эксперимента
- Добавить организмы и субстраты для стекла шприцы
- Место микрожидкостных канал на столик микроскопа и приложить трубку к соответствующим входы и выходы
- Подключите трубку тратить водохранилище. Убедитесь, что трубка полностью погружен в жидкость в резервуар отходов, чтобы избежать колебаний давления
- Место шприцы на шприцевой насос и подключиться к клапаны и трубы
- Настройка микроскопа: освещенности, увеличение и т.д.
- Сосредоточьтесь на соответствующую позицию в канале
- Де-пузырь канал с помощью больших шприц с искусственной морской воде
- Установите соответствующие скорости потока на шприцевой насос. В этом случае 2 мл / мин, что соответствует средней скорости потока -1 220 мкм с в канале
2) Запуск эксперимента
- Начало шприцевой насос установить питательный градиент в канале
- Как только поток стабилизировался и группа питательных веществ, разработал, остановить поток на шприцевой насос и начинают записи с этой точки
- Питательные группа начинает диффузного боков
- Через равные промежутки времени, использование программного обеспечения для анализа изображений для записи последовательности кадров для создания "Фильмы"
- Дискриминация плавание организмов путем принятия временной разницы между двумя изображениями последующих кадрах, так что только движущиеся объекты теперь визуализировать, что позволяет нам различать подвижных клеток из неподвижных частиц и фоновых шумов
- Возьмите фильмы, чтобы определить позиции клеток в канал со ссылкой на рosition из питательных патч
- Запись фильмов на регулярной основе в течение 10-20 мин для анализа позиций и плавание моделей организмов
- Используя программное обеспечение для анализа изображений для наложения позиции организмов в разных кадрах (назначение на каждый пиксель максимальной интенсивности света, записанные в этом пикселе в течение срока действия фильма), можно получить траекторию информации для купания клетки
Опыт № 2: Исследование эффектов сдвига на морских бактерий купание в vortexZ
- Используя различные геометрии канала, мы можем наблюдать поведение бактерий купание в вихре на различных скоростях сдвига
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Понимание того, как морские микроорганизмы взаимодействуют с местными химической и физической среды необходимо для более полного и точного восприятия роли планктонных микроорганизмов в океане питательных веществ и углеродного цикла (Azam и Малфатти 2007). Однако из-за малых масштабах (<мм), по которым многие важные взаимодействия микробного состоится, технические ограничения не позволили подробное обследование микробной поведения в рамках гетерогенных био-физико-химические пейзаж прогнозируется на уровне опытного вплавь микробов в океане. Последние достижения в области микрофлюидики (Уайтсайдс и соавт. 2001) дали возможность детального анализа микробной экологии в сложных микросреды обитания (Мао и соавт. 2003 г., парк и соавт. 2003, Кеймер и соавт. 2006 года Маркос и Стокер 2006). Микрожидкостных устройств описаны здесь позволило нам рассмотреть и хемотаксиса ответ морских микробов диффундирующих патч питательных веществ (Блэкберн и соавт. 1997, 1998) и плавание поведения микробов в турбулентный сдвиг, на одном уровне клетки.
Мягкие литографического процесса изготовления, возникающие в процессе микрожидкостных каналов позволяет сложные детали должны быть созданы в пределах канала архитектуры, что позволяет точно контролировать потоки и градиенты в пределах каналов. Гибкость предоставляемых изготовления техника позволяет каналов различных размеров должна быть создана для сравнительных исследований. Система анализа изображений применяются здесь разрешений визуализации отдельных клеток и питательных градиенты, предоставляя платформу для детального количественного анализа микробных плавания и хемотаксиса поведение как на одноклеточных и популяционном уровне.
Мы применили этот микрожидкостных каналов в качестве чувствительного анализа хемотаксиса для различных плаванием морских микробов и обнаружили, что многие виды способны быстро реагировать на диффундирующие патч питательных веществ, образуя плотные скопления клеток в высокой концентрации питательных веществ внутри патча. Во время хемотаксиса накопление клеток в питательную патч, некоторые виды имеют также выставлены отмеченные поведенческие сдвиги, в том числе изменения в скорости плавания и превращение частоты. Наши наблюдения дают экспериментальную поддержку гипотезы, что морские микроорганизмы могут использовать короткоживущие питательных пятна в океане как важные места обитания роста.
Используя различные геометрии канала, мы в состоянии генерировать стабильные микровихрей на весах, имеющих отношение к микробной динамика в водной среде. Эта установка позволяет наблюдать поведение бактерий купание в ответ на различные скоростях сдвига. В отличие от случайного поведения плавания под покоя состояние потока, под влиянием сильного сдвига, бактерий и следовать линии тока поля течения и приведены в соответствие с ними. Эта установка позволяет получить ценную информацию по фундаментальные взаимодействия микроорганизмов и их жидкости динамической среде.
В каждом из этих экспериментов, микрофлюидики оказалась эффективным инструментом для изучения микробных поведение в динамических микросреды обитания. В условиях растущего признания важности микробных динамику в пределах естественных мест обитания, и новые приложения микрожидкостных технологии, мы полагаем, что дальнейшие связи микрофлюидики с микробной экологии принесет новые важные идеи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Microsystems технологий лаборатории Массачусетского технологического института за предоставленную нам возможность фильме часть этого видео в чистой комнате объекта.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS, Sylgard 184 | Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | http://www.ellsworth.com/sylgard.html | |
| SU8-2100 | Photoresist | MicroChem Corp. | www.microchem.com | |
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted microscope | Microscope | Nikon Instruments | ||
| PEEK tubing (0.762 mm ID, 1.59 mm OD) | Tool | Upchurch Scientific | www.upchurch.com | |
| Syringes (Luer-Lok Tip) | Tool | BD Biosciences | ||
| Fitting Part P-704-01 | Tool | Upchurch Scientific | To connect tubing to Luer-Lok Tip Syringes | |
| Syringe Pump (PHD 2000 Programmable) | Equipment | Harvard Apparatus | ||
| CCD Camera (PCO 1600) | Equipment | Cook |
References
- Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).
- Blackburn, N., Azam, F., Hagstrom, A. Spatially explicit simulations of a microbial food web. Limnology and Oceanography. 42, 613-622 (1997).
- Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. G. Microscale nutrient patches in plankton habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282, 2254-2256 (1998).
- Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proceedings of the National Academy of Science. 103, 17290-17295 (2006).
- Mao, H., Cremer, P. S., Manson, M. D. A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 5449-5454 (2003).
- Marcos,, Stocker, R. Microorganisms in vortices: a microfluidic setup. Limnology and Oceanography: Methods. 4, 392-398 (2006).
- Park, S., Wolanin, P. M., Yuzbahyan, E. A., Lin, H., Darnton, N. C., Stock, J. B., Silberzan, P., Austin, R. Influence of topology on bacterial social interaction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13910-13915 (2003).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
