Summary
Tillverkning av mikroflödessystem kanaler och deras genomförande i experiment för att studera kemotaxi födosöksbeteende av marina mikrober i en ojämn näringsämne marinmålning och simning beteende bakterier i skjuvning flöde beskrivs.
Abstract
I vilken utsträckning planktoniska bakterier kan utnyttja mikroskala resurs fläckar kommer att ha betydande konsekvenser för oceaniska trophodynamics och biogeokemiska flux. Men att dra nytta av näringsämnen fläckar i havet, simma mikrober måste övervinna influenser av fysiska krafter, inklusive molekylär diffusion och turbulent skjuvning, vilket kommer att begränsa tillgången på patchar och förmåga bakterier att lokalisera dem. Fram tills nyligen har metodologiska begränsningar förhindrade direkta undersökningar av mikrobiell beteende inom fläckvis livsmiljöer och realistiska småskaliga förhållanden flöde. Därför har mycket av vår nuvarande kunskap om mikrobiell beteende i havet anskaffats från teoretiska förutsägelser. För att få ny information om mikrobiell födosöksbeteende i havet har vi tillämpat mjuka litografiska tillverkningsteknik för att utveckla 2 mikroflödessystem enheter, som vi har använt för att skapa (i) mikroskala näringsämne fläckar med mått och diffusionsprovtagare av betydelse för oceaniska processer och (ii) mikroskala virvlar, med skjuvhastigheter motsvarar de förväntade i havet. Dessa mikroflödessystem enheter har möjliggjort en första direkta undersökning av mikrobiell simning och kemotaxi beteende inom en heterogen och dynamisk marinmålning. Den kombinerade användningen av epifluorescence och faskontrast mikroskopi möjliggöra direkta undersökningar av fysiska dimensioner och diffus karaktär av näringsämnen patchar, med iakttagande av befolkningen nivå aggregative svar, utöver de simmar hur enskilda mikrober. Dessa experiment har visat att vissa arter av växtplankton, heterotrofa bakterier och phagotrophic protister är skickliga på att hitta och utnyttja sprida mikroskala resurs fläckar inom mycket korta tidsramar. Vi har också visat att upp till måttlig skjuvhastigheter, marina bakterier kan strida flödet och simma genom sin omgivning på egen hand. Men utöver en tröskel hög skjuvning nivå, är bakterier justeras i skjuvning flödet och är mindre i stånd att simma utan störningar från flödet. Mikrofluidik representerar en ny och billig metod för att studera vattenlevande mikrobiell ekologi, och på grund av dess lämplighet för exakt skapa realistiska strömningsfält och lutningar substrat i mikroskala, är idealiskt gäller för undersökningar av mikrobiell beteende vid de minsta skalorna i interaktion. Vi föreslår därför att mikrofluidik utgör ett värdefullt verktyg för att få en bättre förståelse för ekologi mikroorganismer i havet.
Protocol
Förberedelser
1. Skapa en mask
Med hjälp av en CAD-program, designa kanal för högupplösta utskrifter på en öppenhet. Detta kommer att vara den "mask".
I renrummet:
2. Rengör och baka oblat
Först spruta skivan med aceton, sedan snabbt med metanol, sedan med isopropanol. Slutligen, torra brödet med hjälp av kvävgas.
Grädda skivan i ugnen (130 ° C) i 5 min.
3. Beläggning rånet
Placera rån i centrum av spin-beläggning maskin. Häll fotoresist (SU-8) från flaskan på rånet. Låt SU-8 flöde och slappna av för ~ 10 s. Slå på spinn-bestrykare och ramp sin hastighet från 0 till 500 rpm under 5 s, hålla 500 rpm under 10 s, ramp upp till sluthastighet över 10 s och hålls kvar vid sluthastighet i 30 s. Den slutliga hastigheten beror på riktade skikttjocklek och används SU-8. Detaljerna finns på http://www.microchem.com/
4. Soft-baka
Efter beläggning rånet, baka det först vid 65 ° C och därefter i 95 ° C. Gräddningstiden varierar med riktade tjocklek och typ av fotoresist. Sedan, låt skivan sitta i rumstemperatur i minst 5 min.
5. Exponering
Placera masken på toppen av rån och exponera rånet mot UV-ljus under den tid som rekommenderas i SU-8 manualen.
6. Efter exponering baka
Grädda rånet vid 65 ° C och sedan 95 ° C efter SU-8 manuella instruktioner.
7. Utveckling av rån för att få "master" (mögel)
Förbered en bägare fylld med byggherren (PMMA). Sänk ned rån i bägaren medan mycket försiktigt oscillerande bägaren tills oexponerade delen av fotoresist tvättas bort.
I vårt labb:
8. Förbered PDMS och häll den på rånet
Blanda PDMS med härdare vid 10:01 förhållandet i en kopp. Rör om och blanda homogent: detta kommer att generera massor av bubblor och gör blandningen ser ogenomskinlig. Häll blandningen på "master".
9. De-bubblan i vakuumkammare
För att ta bort bubblorna, placerade master och PDMS blandning som täcker den in i en vakuumkammare tills alla bubblor är borta.
10. Baka i ugn
Grädda i minst 12 timmar i en ugn vid 65 ° C för att härda PDMS.
11. Slå hål
Dra av PDMS från master och hål punch för inlopp och utlopp av kanalerna.
I renrum (visas inte)
12. Plasma limning
Kanaler är bundna till en glasskiva efter att behandla både PDMS lagret och glasskiva med syre plasma i 1 min.
Experiment:
Exp # 1: Undersökning av kemotaxi respons av marina mikrober till mikro-skala näringsämne lager
1) Ställa in experimentet
- Lägg organismer och substrat till glassprutor
- Placera mikroflödessystem kanal på mikroskop scenen och fäster slangen till lämpliga inlopp och utlopp
- Anslut slangen till spillo reservoar. Se till att slangen är helt nedsänkt i vätskan i avfallet behållaren för att undvika tryckvariationerna
- Placera sprutor på sprutpump och ansluta till ventiler och slangar
- Ställ in mikroskopet: ljus, förstoring, etc.
- Fokus på lämplig plats i kanalen
- De-bubblan kanal med större spruta fylld med konstgjorda havsvatten
- Ställ in lämpligt flöde på sprutpump. I det här fallet 2 ml / min, vilket motsvarar en genomsnittlig hastighet på 220 ìm s -1 i kanalen
2) Köra experimentet
- Starta sprutpump för att upprätta ett näringsämne gradient i kanalen
- När flödet har stabiliserats och ett band av näringsämnen har utvecklats, stoppa flödet på sprutans pump och börja spela in tid från denna punkt
- Näringsämnen bandet börjar diffusa sidled
- Vid regelbundna tidsintervall, använda programvara bildanalys för att spela in sekvenser av bilder för att skapa "filmer"
- Diskriminera simning organismer genom att ta tid skillnad bilder mellan två efterföljande bildrutor, så att endast rörliga objekt är nu visualiseras, tillåter oss att skilja rörliga celler från icke rörliga partiklar och bakgrundsljud
- Ta filmer för att bestämma positioner av celler i kanalen med hänvisning till position av näringsämnen patch
- Spela in filmer med jämna mellanrum i 10-20 minuter för att analysera positioner och simning mönster av organismer
- Genom att använda programvaran bildanalys för att överlagra positioner organismer i olika ramar (tilldelning till varje pixel maximal ljusintensitet registreras i den pixeln under hela filmen), kan vi få bollbana information för simning celler
Exp # 2: Undersökning av effekterna av shear på marina bakterier simmar i en vortexZ
- Med hjälp av olika kanaler geometri, kan vi observera beteende av bakterier som simmar i en virvel på olika skjuvhastigheter
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En förståelse för hur marina mikrober interagerar med sina lokala kemiska och fysiska miljön är absolut nödvändigt för en mer komplett och exakt uppfattning om betydelsen av planktoniska mikroorganismer i haven näringsämnen och kol cykler (Azam och Malfatti 2007). På grund av de små skalor (<mm) över vilken många viktiga mikrobiella interaktioner äger rum, har tekniska begränsningar förhindrat detaljerade undersökningar av mikrobiella beteende inom den heterogena biologiska fysikalisk-kemiska landskapet förutspådde att upplevas genom att simma mikrober i havet. Senaste framstegen inom mikrofluidik (Whitesides et al. 2001) har möjliggjort detaljerade analyser av mikrobiell ekologi i komplexa mikrohabitat (Mao et al. 2003, Park et al. 2003, Keymer et al. 2006, Marcos och Stocker 2006). Den mikroflödessystem enheter som beskrivs här får oss att undersöka både kemotaxi respons av marina mikrober till ett spridande näringsämne patch (Blackburn et al. 1997, 1998) och simning beteende mikrober inom turbulenta skjuvning, på en enda cell nivå.
Den mjuka litografiska tillverkningsprocessen är inblandade i att göra mikroflödessystem kanaler tillåter intrikata detaljer som ska skapas inom kanalen arkitektur, som tillåter exakt kontroll av flöden och gradienter i kanalerna. Flexibilitet som erbjuds genom tillverkningstekniken möjliggör för kanaler av olika dimensioner som ska skapas för jämförande studier. Det bildanalyssystem tillämpas här tillåter visualisering av enskilda celler och näringsämnen gradienter, vilket ger en plattform för detaljerad kvantitativ analys av mikrobiella bad och kemotaxi beteende vid både encelliga och befolkningsnivå.
Vi har tillämpat denna mikroflödessystem kanal som en känslig chemotaxis analys för en mängd olika bad marina mikrober och har funnit att många arter har förmåga att snabbt svara på en sprida plåster av näringsämnen, bildar täta ansamlingar av celler i de höga halter av näringsämnen inuti plåstret. Under kemotaxi ansamling av celler i det näringsämne patchen har vissa arter också uppvisade markant beteendemässiga förändringar, inklusive förändringar i simning hastighet och vrida frekvens. Våra observationer ger experimentellt stöd för hypotesen att marina mikrober kan utnyttja kortlivade näringsämne fläckar i havet som viktiga tillväxt livsmiljöer.
Med hjälp av olika kanaler geometri, kan vi generera stabila microvortices skalor relevanta för mikrobiell dynamik i vattenmiljön. Denna setup ger oss möjlighet att observera beteendet hos bakterier simmar som svar på olika skjuvhastigheter. I motsats till de slumpmässiga simma beteende under normal drift flöde villkor, under inflytande av en stark sax, bakterier både följa effektiviserar av flödet fältet och är i linje med dem. Denna setup ger värdefulla insikter om det grundläggande samspelet mellan mikroorganismer och deras vätska dynamiska miljö.
I alla dessa experiment har mikrofluidik visat sig vara ett effektivt verktyg för att studera mikrobiell beteende inom dynamiska mikrohabitat. Med en växande insikt om betydelsen av mikrobiella dynamiken på naturliga livsmiljöer och nya tillämpningar av mikrofabricerade teknik, föreslår vi att den fortsatta kopplingen mellan mikrofluidik med mikrobiell ekologi kommer att ge viktiga nya insikter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vill tacka Mikrosystemteknik Laboratories på MIT för att tillåta oss att filma en del av denna video i renrummet anläggningen.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS, Sylgard 184 | Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | http://www.ellsworth.com/sylgard.html | |
| SU8-2100 | Photoresist | MicroChem Corp. | www.microchem.com | |
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted microscope | Microscope | Nikon Instruments | ||
| PEEK tubing (0.762 mm ID, 1.59 mm OD) | Tool | Upchurch Scientific | www.upchurch.com | |
| Syringes (Luer-Lok Tip) | Tool | BD Biosciences | ||
| Fitting Part P-704-01 | Tool | Upchurch Scientific | To connect tubing to Luer-Lok Tip Syringes | |
| Syringe Pump (PHD 2000 Programmable) | Equipment | Harvard Apparatus | ||
| CCD Camera (PCO 1600) | Equipment | Cook |
References
- Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).
- Blackburn, N., Azam, F., Hagstrom, A. Spatially explicit simulations of a microbial food web. Limnology and Oceanography. 42, 613-622 (1997).
- Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. G. Microscale nutrient patches in plankton habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282, 2254-2256 (1998).
- Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proceedings of the National Academy of Science. 103, 17290-17295 (2006).
- Mao, H., Cremer, P. S., Manson, M. D. A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 5449-5454 (2003).
- Marcos,, Stocker, R. Microorganisms in vortices: a microfluidic setup. Limnology and Oceanography: Methods. 4, 392-398 (2006).
- Park, S., Wolanin, P. M., Yuzbahyan, E. A., Lin, H., Darnton, N. C., Stock, J. B., Silberzan, P., Austin, R. Influence of topology on bacterial social interaction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13910-13915 (2003).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
